一種人星狀病毒核苷酸的檢測引物和探針及檢測方法
2024-03-02 18:15:15
專利名稱：一種人星狀病毒核苷酸的檢測引物和探針及檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測技術領域，特別涉及一種人星狀病毒核苷酸的檢測引物和探針及檢測方法。
背景技術：
人星狀病毒(Human astrovirus, HAstV)是無包膜的單股正鏈RNA病毒，屬於星狀病毒科哺乳動物屬。HAstV是導致幼小動物產生腹瀉的一種重要病原，世界各地均已有星狀病毒感染的報導，既可散發也可以引起暴發流行，亦可引起醫源性感染。與輪狀病毒相似，星狀病毒感染多發生在2歲以內尤其是I歲以內的嬰幼兒。目前認為人星狀病毒是嬰幼兒病毒性胃腸炎的第二位病因，僅次於輪狀病毒。此外，老年人和免疫缺陷患者也是星狀病毒感染的高危人群，人類免疫缺陷患者、接受骨髓移植及聯合免疫缺陷患者發生星狀病毒感 染均已有報導。人星狀病毒亦是健康成年人發生胃腸炎的病因之一。因此，疾病預防控制機構以及醫院急需特異性強，敏感性高，操作方便，可用於胃腸炎等暴發疫情和臨床病例的早期快速診斷的方法。1975年Madeley首次在電鏡下觀察到星狀病毒，由於病毒顆粒表面有5 6個星狀突起，故而得名。人星狀病毒顆粒直徑為28 41nm，當病毒存在於高pH值環境下，其表現為典型的星狀形態。它的基因組從5』端到3』端包括一個約85個核苷酸的5』非編碼區、3個開放讀碼框架(ORFla、ORFlb, 0RF2)、1個約80個核苷酸的3』非編碼區和I個大約30個核苷酸的多聚腺苷酸尾。ORFla和ORFlb編碼非結構蛋白，ORFla編碼絲氨酸蛋白酶，且其下遊存在I個核定位信號；0RFlb編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase, RDRP), RDRP是通過核糖體讀框移位機制合成的I個融合蛋白。HAstV衣殼蛋白由0RF2編碼合成。在病毒複製的過程中，所感染的細胞內可檢測出2種病毒特異性的RNA，I個是6. 8KB的全長基因組RNA，另一個是2. 8Kb的亞基因組RNA，2種RNA的3』端均具有多聚腺苷酸尾。亞基因組RNA包含了全部的0RF2序列，可作為mRNA表達衣殼蛋白。0RF2編碼產物至少包括2個區域第I個區域(I 415個胺基酸)在各血清型之間是高度保守的;第2個區域(416個胺基酸 結束)是高度變異的，病毒的中和抗原決定簇即在此區域內。人星狀病毒在細胞培養中增殖困難，且多數星狀病毒在細胞培養物中不產生細胞病變，這為病毒分離帶來了難度。目前人星狀病毒的常規檢測方法主要是應用電鏡直接檢測糞中的病毒顆粒，或用免疫診斷方法檢測糞中的病毒抗原和血清中的特異性抗體。電鏡檢查病毒靈敏度較低，容易出現漏檢；免疫學方法特異性有待提高，而且都費時費力。傳統的RT-PCR也被用於人星狀病毒，但檢測時間需要6小時。
發明內容
本發明的首要目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供一種人星狀病毒核苷酸的檢測引物。
本發明的另一目的在於提供與上述檢測弓丨物配合使用的探針。本發明的另一目的在於提供一種檢測人星狀病毒核苷酸的方法，該方法通過使用上述檢測引物和探針進行實時螢光RT-PCR檢測，能夠快速簡單地判斷樣品是否有人星狀病毒，為人腹瀉和胃腸炎的病原學診斷提供科學依據。本發明的目的通過下述技術方案實現一種人星狀病毒核苷酸的檢測引物，所述的檢測引物由正向引物和反向引物組成，其核苷酸序列如下正向引物5，-GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC-3，；反向引物5』 -GGACTTGCTAGCCATCACACTTC-3，。與上述檢測引物配合使用的探針的核苷酸序列如下探針5』 -CCTCCCCTCCAAATGCGATGGAG-3』，該探針一端標記有報告螢光染料，另一端標記有淬滅螢光染料；優選的，該探針的5』端標記有報告螢光染料,3』端標記有淬滅螢光染料。所述的報告螢光染料優選為Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3或Cy5。所述的淬滅突光染料優選為Tamra、Rox> Dabcyl、BHQl或BHQ2。根據TaqMan技術，在常規PCR的基礎上添加了一條標記有兩個螢光染料基團的核苷酸探針，例如將報告螢光染料標記的探針的5』端，淬滅螢光染料標記在探針的3』端，兩者構成能量轉移結構，即報告螢光染料所發射的螢光可被淬滅螢光染料吸收，當二者距離變遠時，抑制作用減弱，報告螢光染料信號增強。在擴增反應過程中，探針同模板上的目的擴增片段雜交，由於Taq酶具有5』端到3』端的外切酶活性，在擴增延伸階段將探針切斷，淬滅螢光染料的抑制作用消失，報告螢光染料信號增強，在擴增延伸階段將探針切斷，淬滅螢光染料的抑制作用消失，報告螢光染料信號增強，從而實現對人星狀病毒的檢測。一種檢測人星狀病毒核苷酸的方法，包括如下步驟以待檢樣品RNA為模板，利用上述的正向引物、反向引物以及探針進行實時螢光RT-PCR擴增，每個循環結束採集數據，反應結束後根據擴增曲線判定結果。所述的檢測人星狀病毒核苷酸的方法的實時螢光RT-PCR反應體系包括如下組分2· 5 μ LlOXOne Step RNA PCR Buffer,2y L dNTP (各 2. 5mM)，上述正向引物和反向引物(10 μ M)各1. 5 μ L，O. 5 μ L 上述探針(10 μ Μ)，O. 5 μ L Taq 酶，O. 5 μ L RNase Inhibitor(40U/y L)，0. 5μ L AMV RTase XL (5U/y L),5y L RNA, 10. 5 μ L RNase Free dH20。當然，可以根據本發明給出的引物對或者其擴增產物序列設計其它類型的探針，以適用不同方法的螢光PCR檢測。本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果(I)本發明根據人星狀病毒基因組序列設計的引物特異性好，用於實時螢光RT-PCR檢測的靈敏度高。(2)本發明檢測方法準確性高，靈敏度高，其能夠快速簡單地判斷樣品是否有人星狀病毒，為人腹瀉、胃腸炎的病原學診斷及鑑別診斷提供了科學依據。
圖1是人星狀病毒核酸Real-time RT-PCR檢測方法的特異性試驗結果圖。
圖2是人星狀病毒核酸Real-time RT-PCR檢測方法的靈敏性試驗結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。實施例1引物和探針的設計從NCBI資料庫下載所有的已知人星狀病毒全基因組序列，並進行比較分析，選擇無二級結構且高度保守的區段，設計引物和探針，其序列如下正向引物5，-GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC-3，；反向引物5，-GGACTTGCTAGCCATCACACTTC-3』。探針的序列為5』 -CCTCCCCTCCAAATGCGATGGAG-3』 ；該探針的5』端用報告螢光染料VIC標記，3』端用淬滅螢光染料BHQ2標記。 實施例2人星狀病毒核酸螢光RT-PCR條件的優化利用滅活的人星狀病毒作為待檢樣品，用商業RNA提取試劑盒提取病毒基因組RNA,分別分裝後儲存於_20°C備用。(I)引物濃度的優化在反應體系中其它條件相同的情況下，將實施例1中的引物濃度分別從O.1 μ mol/L至1. 6 μ mol/L作倍比連續稀釋，通過試驗結果的分析比較，確定最佳引物終濃度為0.4μπιΟ1/1。(2)鎂離子濃度的優化在反應體系中其它條件相同的情況下，將MgCl2的濃度從lmmol/L至10mmol/L以lmmol/L遞增,確定鎂離子最佳鎂離子濃度為5mmol/L。(3)反轉錄酶(AMV RnaseXL)用量的優化使用不同濃度反轉錄酶的試驗結果比較，選定5U作為反轉錄酶的用量。(4) Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的優化通過比較Taq酶用量的優化實驗結果，選定5U作為Taq酶的用量。(5 ) dNTPs濃度的優化通過使用不同濃度的dNTPs進行檢測，綜合評估後選lmmol/L作為dNTPs的使用量。(6)探針濃度的優化在反應體系中其它條件相同的情況下，將實施例1中的探針濃度分別從0.1 μ mol/L至0. 5 μ mol/L作倍比連續稀釋後進行檢測，通過試驗結果的分析比較，確定最佳探針終濃度為0. 2 μ mol/L。利用實施例1的引物和探針進行反應體系的建立，最後確定採用的人星狀病毒實時螢光RT-PCR反應體系為25 μ I體系，所需各組分及相應濃度見表I。表I人星狀病毒實時螢光RT-PCR反應中的各組分情況
權利要求
1.一種人星狀病毒核苷酸的檢測引物，其特徵在於所述的檢測引物由正向引物和反向引物組成，其核苷酸序列如下 正向引物5』 -GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC-3』 ； 反向引物5』 -GGACTTGCTAGCCATCACACTTC-3，。
2.與權利要求1所述的檢測引物配合使用的探針，其特徵在於所述探針的核苷酸序列如下5』 -CCTCCCCTCCAAATGCGATGGAG-3』 ；該探針的5』端標記有報告螢光染料，3』端標記有淬滅螢光染料。
3.根據權利要求2所述的探針，其特徵在於所述探針的5』端標記有報告螢光染料，3』端標記有淬滅螢光染料。
4.根據權利要求2所述的探針，其特徵在於 所述的報告螢光染料優選為Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3或Cy5 ； 所述的淬滅螢光染料優選為Tamra、Rox, Dabcyl、BHQl或BHQ2。
5.一種檢測人星狀病毒核苷酸的方法，其特徵在於包括如下步驟以待檢樣品RNA為模板，利用上述的正向引物、反向引物以及探針進行實時螢光RT-PCR擴增，每個循環結束採集數據，反應結束後根據擴增曲線判定結果。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述的實時螢光RT-PCR反應體系包括如下組分2· 5 μ LlOXOne Step RNA PCR Buffer, 2 μ L dNTP(各 2· 5mM)，上述正向引物和反向引物(10 μ M)各1. 5 μ L，O. 5 μ L 上述探針(10 μ Μ)，O. 5 μ LTaq 酶，O. 5 μ LRNase Inhibitor(40U/y L)，0. 5μ L AMV RTase XL (5U/y L),5y L RNA, 10. 5 μ L RNase Free dH20。
全文摘要
本發明公開了一種人星狀病毒核苷酸的檢測引物和探針及檢測方法，屬於生物檢測技術領域。一種人星狀病毒核苷酸的檢測引物，由正向引物和反向引物組成，其核苷酸序列如SEQ NO.1和2所示。與上述檢測引物配合使用的探針的核苷酸序列如SEQ NO.3所示；該探針一端標記有報告螢光染料，另一端標記有淬滅螢光染料。檢測人星狀病毒核苷酸的方法，包括如下步驟以待檢樣品RNA為模板，利用上述的正向引物、反向引物以及探針進行實時螢光RT-PCR擴增，每個循環結束採集數據，反應結束後根據擴增曲線判定結果。本發明根據人星狀病毒基因組序列設計的引物特異性好，用於實時螢光RT-PCR檢測的靈敏度高。
文檔編號C12N15/11GK103014180SQ201210584378
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者肖性龍, 餘以剛, 吳暉, 李曉鳳, 唐語謙, 袁琨 申請人:華南理工大學