一種柑橘潰瘍病菌拮抗細菌抑菌能力的測定方法
2024-04-02 17:37:05 2
專利名稱：一種柑橘潰瘍病菌拮抗細菌抑菌能力的測定方法
技術領域：
本發明涉及拮抗細菌對植物病原細菌抑菌能力的測定方法，具體涉及對柑橘潰瘍病菌抑菌能力的測定方法。
背景技術：
柑橘潰瘍病是由地毪草黃單胞桿菌柑橘致病變種、Xanthomonas axonopodis pv.citri)引起的ー種國內外檢疫性細菌病害，主要侵染芸香科柑橘屬、枳屬及金柑屬植物，引起柑橘葉片、果實、枝幹潰瘍斑，導致樹勢生長衰弱，產量和品質下降，造成巨大的經濟損失。 該病害可通過氣孔、皮孔等自然孔ロ或外界造成的傷ロ侵入寄主；通過風雨、媒介昆蟲、農事操作等局部傳播，帶菌的種苗、接穗和果實等柑橘材料遠距離傳播。目前對柑橘潰瘍病的防治措施主要採用以農業防治為基礎，化學藥劑為主的防治技木，柑橘是世界上重要的商品水果，環境汙染、病原菌抗藥性以及果品農藥殘留等問題限制了化學農藥的大規模利用。為提高我國柑橘的品質和出口標準，探索該病害新的防治途徑以克服農藥殘留和病原菌抗藥性等問題也勢在必行。生物防治對環境友好，無汙染，不易在果實上殘留，因而備受人們的關注。因此篩選獲得有抑菌能力的拮抗微生物成了研究柑橘潰瘍病生物防治的重要前期基礎。目前柑橘潰瘍病的拮抗微生物的篩選方法中，關於測定拮抗菌株抑菌能力的方法有抑菌圈法、牛津杯法、平板對峙法等，其直接以拮抗菌株的菌懸液來進行測定，在測定過程中，拮抗菌株繼續在培養基上生長，由於不同的菌株生物學特性不同，生長和產生代謝產物的能力也不同，導致測定的抑菌圈大小不準確，因此難以同時比較不同菌株的抑菌能力。
發明內容
本發明的目的在於解決上述現有技術的不足，提供ー種柑橘潰瘍病菌拮抗細菌抑菌能力的測定方法——無菌濾液紙碟法，此法不僅能用於測定出分離獲得的拮抗細菌對柑橘潰瘍病菌的抑制能力，還可以為篩選柑橘潰瘍病有潛在應用價值的拮抗細菌提供操作簡便、試驗穩定性好的方法。本發明解決其技術問題所採用的技術方案是按以下步驟進行
(a)將I.0 X IO6 CFU/ mL的拮抗細菌新鮮菌液I mL接種到盛有50 mL的NB液體培養基的三角瓶中，28°C下180 r/min振蕩培養72 h後，經12，000 r/min離心20 min，取上清液，經孔徑為0. 22 um的微孔濾膜過濾除菌即得無菌濾液；
(b)將直徑10mm的無菌濾紙片放入步驟(a)製得的無菌濾液中浸潤20min ；
(c)將柑橘潰瘍病菌配製為2.0 X IO8CFU/ mL的菌懸液，取2 mL菌懸液與冷卻至50°C的200 mL NA培養基混勻，倒入直徑90mm的培養皿制平板，每個平板20 mL ；
(d)往步驟(c)製得的含柑橘潰瘍病菌的平板中央放入步驟(b)製得的浸潤拮抗細菌無菌濾液的濾紙片，280C培養48 h後，觀察記錄拮抗細菌對柑橘潰瘍病菌的抑菌能力，測定抑菌圈直徑。步驟(a)中，NB液體培養基組成為牛肉浸膏3.0 g，酵母浸膏1.0 g，蛋白腖8.0g，葡萄糖 10. 0 g，牛肉膏 3.0 g，水 1,000.0 mL, pH 6. 8-7. O0步驟(b)中，NA培養基組成為牛肉浸膏3.0 g，酵母浸膏1.0 g，蛋白腖8.0 g，葡萄糖 10.0 g，牛肉膏 3.0 g，瓊脂 18.0 g，水 1,000.0 mL, pH 6. 8-7. O。本發明的有益效果是本發明使用拮抗細菌無菌濾液紙碟法能有效地測定出分離獲得的拮抗細菌對柑橘潰瘍病菌的抑制能力，操作簡便、試驗穩定性好、抑菌圈寬度測定準確。此外本法不需要特別的儀器，實驗成本較低。使用本發明方法能篩選出對柑橘潰瘍病有潛在應用價值的拮抗細菌。
圖I為本發明實施例中拮抗細菌抑制柑橘潰瘍病菌能力結果示意圖。
具體實施例方式下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑和材料。實施例使用本發明所述的方法測定分離獲得的拮抗細菌對柑橘潰瘍病菌的抑菌能力
I、將分離純化後的柑橘潰瘍病菌的拮抗細菌菌株用無菌水配製為1.0 X IO6 CFU/ mL的新鮮菌液，取I mL接種到盛有50 mL的NB液體培養基的三角瓶中，28°C下180 r/min振蕩培養72 h後，經12，000 r/min離心20 min，取上清液，經孔徑為0. 22 y m的微孔濾膜過濾除菌即得無菌濾液。所述NB液體培養基組成為牛肉浸膏3.0 g，酵母浸膏1.0 g，蛋白腖8.0 g，葡萄糖 10.0 g，牛肉膏 3.0 g，水 1,000.0 mL, pH 值 6. 8-7. O。2、將直徑10 mm的無菌濾紙片放入製得的無菌濾液中浸潤20min。3、將柑橘潰瘍病菌配製為2.0 X IO8CFU/ mL的菌懸液，取2 mL菌懸液與冷卻至50°C的200 mL NA培養基混勻，倒入直徑90mm的培養皿制平板，每個平板20 mL。所述NA培養基組成為牛肉浸膏3.0 g，酵母浸膏1.0 g，蛋白腖8.0 g，葡萄糖
10.0 g，牛肉膏 3. 0 g，瓊脂 18. 0 g，水 1，000. 0 mL, pH 6. 8-7. O。4、往含柑橘潰瘍病菌的平板中央放入浸潤拮抗細菌無菌濾液的濾紙片，28°C培養48 h後，觀察記錄拮抗細菌對柑橘潰瘍病菌的抑菌能力，測定抑菌圈直徑，每處理設3次重複。結果見圖1，拮抗細菌TR7菌株無菌濾液對柑橘潰瘍病菌有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑為19. 5mm。從圖可見本法能有效地測定出分離獲得的拮抗細菌對柑橘潰瘍病菌的抑制能力。
權利要求
1.一種柑橘潰瘍病菌拮抗細菌抑菌能力的測定方法，其特徵在於包括以下步驟 (a)將I.O X IO6 CFU/ mL的拮抗細菌新鮮菌液I mL接種到盛有50 mL的NB液體培養基的三角瓶中，28°C下180 r/min振蕩培養72 h後，經12，000 r/min離心20 min，取上清液，經孔徑為O. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌即得無菌濾液； (b)將直徑10mm的無菌濾紙片放入步驟(a)製得的無菌濾液中浸潤20min ； (c)將柑橘潰瘍病菌配製為2.O X IO8CFU/ mL的菌懸液，取2 mL菌懸液與冷卻至50°C的200 mL NA培養基混勻，倒入直徑90mm的培養皿制平板，每個平板20 mL ； (d)往步驟(c)製得的含柑橘潰瘍病菌的平板中央放入步驟(b)製得的浸潤拮抗細菌無菌濾液的濾紙片，28 0C培養48 h後，觀察記錄拮抗細菌對柑橘潰瘍病菌的抑菌能力，測定抑菌圈直徑。
2.根據權利要求I所述的柑橘潰瘍病菌拮抗細菌抑菌能力的測定方法，其特徵在於所述步驟(a)中，NB液體培養基組成為牛肉浸膏3. O g，酵母浸膏1.0 g，蛋白腖8.0 g，葡萄糖 10.0 g，牛肉膏 3.0 g，水 1,000.0 mL, pH 值 6. 8-7. O。
3.根據權利要求I所述的柑橘潰瘍病菌拮抗細菌抑菌能力的測定方法，其特徵在於所述步驟(c)中，NA培養基組成為牛肉浸膏3. O g，酵母浸膏1.0 g，蛋白腖8.0 g，葡萄糖10.O g，牛肉膏 3. O g，瓊脂 18.0 g，水 1,000.0 mL, pH 值 6. 8-7. O。
全文摘要
本發明公開了一種柑橘潰瘍病菌拮抗細菌抑菌能力的測定方法，該方法將拮抗細菌新鮮菌液接種到NB液體培養基中，取上清液經微孔濾膜過濾，無菌濾紙片浸潤其中；將柑橘潰瘍病菌配製菌懸液，與NA培養基混勻後制平板；無菌濾紙片放入平板中央，培養48h後測定抑菌圈直徑。本發明系採用拮抗細菌的無菌濾液來測定其對柑橘潰瘍病菌的抑制能力，從而為柑橘潰瘍病菌生防細菌的篩選提供方法。本發明方法能有效地測定出分離獲得的拮抗細菌對柑橘潰瘍病菌的抑制能力，具有操作簡便、試驗穩定性好、抑菌圈寬度測定準確等優點。使用本發明方法能篩選出對柑橘潰瘍病有潛在應用價值的拮抗細菌。
文檔編號C12Q1/20GK102766676SQ20121029578
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月20日 優先權日2012年8月20日
發明者易龍 申請人:贛南師範學院