一種中藥活性成分與dna相互作用的研究方法
2024-04-03 04:42:05 4
專利名稱：一種中藥活性成分與dna相互作用的研究方法
技術領域：
本發明涉及中藥的研究領域，特別提供了一種利用微透析-高效液相色譜聯用技術，研究中藥活性成分和DNA相互作用的方法。
背景技術：
中藥是祖國醫藥學的寶貴遺產，具有明確的臨床療效，因此從中藥中篩選有藥理活性的成分具有目標明確、毒副作用小、原料來源多等有利因素。以DNA為作用靶點的藥物通常具有潛在的抗癌作用，因此，從中藥中篩選並研究和DNA的作用的活性成分對新的抗癌藥物先導化合物的發現具有重大意義。現有的研究中藥和DNA作用的方法包括紫外光譜法、螢光光譜法、核磁共振法、拉曼光譜法等等。但是這些方法都是研究中藥中單一成分和DNA的作用，中藥成分複雜，往往含有大量的化合物，要獲得單一成分不僅提取困難，費時費力，而且有很大的盲目性。
微透析(microdialysis)取樣技術是近年來發展起來的一種生物化學樣品收集採樣新技術它利用具有一定分子量截留的半透膜提取出複雜體系(諸如生物樣品等)中的小分子，因此所收集的透析液無需預處理即可除去大分子的幹擾；微透析將透析微型化、探針化，收集採樣具有實時性、快捷、微量、準確的優點，易於自動化，方便與現代分析儀器聯用。
發明內容
本發明的目的是通過微透析取樣技術和高效液相色譜分析相結合，利用微透析取樣技術的樣品用量少且不需預處理和高效液相色譜的分離能力強大、定量準確的特點，建立一種簡便、高效、準確且成本低廉的體外實驗方法，從中藥中篩選出能夠和DNA發生相互作用的活性化合物，為以中藥有效成分為基礎的抗癌藥物設計提供新的先導化合物。
本發明提供了一種中藥活性成分與DNA相互作用的研究方法，其特徵在於採用微透析取樣技術與高效液相色譜聯用的技術。
本發明中藥活性成分與DNA相互作用的研究方法中，具體包含如下步驟——將待研究的中藥提取液和DNA溶液混合形成均相的混合體系，微透析取樣並收集反應透析液；——在與上述步驟相同的條件下，將待研究的中藥提取液和不含DNA的空白溶液混合形成均相的混合體系，微透析取樣並收集空白透析液；——將上述反應透析液和空白透析液在相同的條件下分別進行高效液相色譜分析；——將上述分析獲得反應透析液和空白透析液色譜圖進行比較，相對於空白透析液相色譜，峰面積減小的為待研究的中藥提取液中能夠和DNA分子發生相互作用的活性成分，峰面積沒有發生變化的為不能夠和DNA分子發生相互作用的成分。
本中藥活性成分與DNA相互作用的研究方法，可用於各種單味中藥及中藥複方的提取物水溶液與DNA分子及其他生物大分子的相互作用的研究，特別適用於中藥有效成分的篩選。
本發明中藥活性成分與DNA相互作用的研究方法中，中藥提取物溶液和DNA混合後，發生藥物和DNA分子的反應。反應液是一個複雜體系，含有大分子DNA、幾十種乃至上百種中藥化合物小分子、DNA與小分子結合的複合物以及其他雜質。本發明首先採用微透析取樣技術，可以從中藥提取物和DNA混合體系中提取出未結合的游離化合物而不影響結合平衡，避免了複雜的預處理過程，同時，利用高效液相色譜的強大分離能力，可以對中藥中多種成分同時分析而無需分別提取或純化。
通過微透析和高效液相色譜相結合的方法，能夠同時研究中藥提取物中多種成分與DNA分子的相互作用，並從中快速分離分析能夠和DNA發生結合的成分，為新的抗癌藥物設計提供先導化合物。
另外，由於來自中藥的有效成分源自天然，相對於合成藥物(西藥)，中藥具有毒副作用小，療效獨特的特點，因此更加具有進行結構改造和研究的價值，人們越來越把目光投向傳統中藥，希望從中篩選出具有藥理活性的物質。本發明無疑為用現代化手段篩選中藥活性成分提供了一種有效的方法。
總之，本發明的新穎性和創造性在於首次採用微透析取樣與高效液相色譜聯用技術在體外研究中藥和DNA分子的相互作用，不僅DNA和中藥提取液的樣品用量少，操作簡單，而且通過色譜手段能夠同時研究多種中藥成分與DNA分子的作用，從大量成分中迅速篩選出具有與DNA結合能力的化合物，且可以得出其與DNA的結合率。也就是說，本方法操作簡便易行，樣品用量少，結果直觀可見。
附圖1.黃連提取液與DNA的反應透析液與空白透析液的色譜圖比較(虛線為空白透析液，實線為反應透析液)；附圖2.黃柏提取液與DNA的反應透析液與空白透析液的色譜圖比較(虛線為空白透析液，實線為反應透析液)。
具體實施例方式1、對反應液及空白液進行微透析取樣。
將一定量的中藥提取液和一定量的DNA溶液混合，形成均相的混合體系。在攪拌平衡一段時間後，在設定的灌流液(perfusion solution)流速下，用微透析裝置進行取樣，收集反應透析液(microdialysate)。同樣條件下，將中藥提取液和不含DNA的空白溶液混合，微透析取樣並收集空白透析液。
2、對透析液進行高效液相色譜分析，比較反應透析液和空白透析液的色譜譜圖。
將一定體積的反應透析液和空白透析液分別注入高效液相色譜進樣閥中，在一定的色譜條件下進行色譜分析並比較。在中藥提取液和DNA的反應體系中，根據其與DNA分子能夠發生相互作用與否，中藥的各種成分可以分為兩種類型，即(一)能夠和DNA分子發生相互作用的成分；(二)不能和DNA分子發生相互作用的成分。前者由於和DNA分子具有結合平衡，游離濃度減小，其對應的高效液相色譜圖上的峰面積隨之減小，後者對應的峰面積則沒有變化。因此，通過計算並比較反應透析液和空白透析液色譜圖上對應化合物的峰面積，即可得出中藥成分與DNA的結合反應信息，從而篩選出中藥中能夠和DNA發生作用的化合物，同時依據結合量可計算其與DNA的結合率。
實施例1稱取黃連粉末20g置於燒瓶中，用150mL 30％乙醇浸泡過夜，加熱回流1.5h後過濾，將藥物殘渣再用100mL 30％乙醇加熱回流1.5h後過濾，合併濾液並旋轉蒸發蒸乾後加25mL純水溶解，得到黃連提取物的水溶液。取50mg小牛胸腺DNA溶於40mL磷酸鹽緩衝液(6mM NaH2PO4，2mMNa2HPO4，1mM EDTANa4，185mM NaCl，PH＝7.0)。取10μL黃連提取物水溶液，加入3290μL磷酸鹽緩衝溶液，充分混合併置於37℃恆溫水浴中，加入2700μL DNA溶液，平衡0.5h。裝上微透析裝置，開始透析取樣，透析探針半透膜分子量截流為18,000，灌流液流速為1μL/min，取樣時間為30min，收集透析液。透析灌流液為如上的磷酸鹽緩衝液，加DNA溶液、平衡及微透析取樣過程均在緩慢的攪拌下進行。另外在同樣條件下收集DNA空白透析液。
室溫下進行高效液相色譜分析。色譜條件如下儀器島津LC-10Atvp液相色譜泵，島津SPD-10Avp檢測器，250×4.6mm，I.D.BDS柱(Hypersil BDS填料，大連伊利特公司裝填)，WDL-95色譜工作站。
流動相A相Britton-Robinson緩衝液(1350μL磷酸，1150μL醋酸，1.236g硼酸，1.011g庚烷磺酸鈉混合溶解於1000mL純水，以NaOH溶液調節PH＝3.0)；B相50％乙腈+50％Britton-Robinson緩衝液。
線性梯度洗脫條件0min-40min40％B-90％B。
流速1.0mL/min檢測波長345nm
比較反應透析液和空白透析液的色譜圖(附圖1)，發現部分化合物峰面積沒有變化，7個化合物峰面積有明顯減小，經定性有巴馬汀和小檗鹼，二者的結合率分別為36.2％和48.2％。另有部分峰面積減小的化合物尚未定性。
實施例2稱取黃柏粉末10g置於燒瓶中，用100mL 30％乙醇浸泡過夜，加熱回流1.5h後過濾，將藥物殘渣再用70mL 30％乙醇加熱回流1.5h後過濾，合併濾液並旋轉蒸發蒸乾後加25mL純水溶解，得到黃柏提取物的水溶液。取50mg小牛胸腺DNA溶於40mL磷酸鹽緩衝液(6mM NaH2PO4，2mM Na2HPO4，1mM EDTANa4，185mM NaCl，PH＝7.0)。取200μL黃柏提取物水溶液，加入3100μL磷酸鹽緩衝溶液，充分混合併置於37℃恆溫水浴中，加入2700μL DNA溶液，平衡0.5h。裝上微透析裝置，開始透析取樣，取樣條件同實施例1。另外在同樣條件下收集DNA空白透析液。
室溫下進行高效液相色譜分析。色譜條件如下儀器同實施例1流動相A相Britton-Robinson緩衝液(1350μL，磷酸，1150μL醋酸，1.236g硼酸，1.011g庚烷磺酸鈉混合溶解於1000mL純水，以NaOH溶液調節PH＝3.0)；B相50％乙腈+50％Britton-Robinson緩衝液。
梯度洗脫條件0min-25min22％B；25min-70min30％B-95％B。
流速1.0mL/min
檢測波長345nm比較反應透析液和空白透析液的色譜圖(附圖2)，發現部分化合物峰面積沒有變化，3個化合物峰面積有明顯減小，經定性分別為藥根鹼，巴馬汀和小檗鹼，結合率分別為30.6％，25.3％和28.6％。
權利要求
1.一種中藥活性成分與DNA相互作用的研究方法，其特徵在於採用微透析取樣技術與高效液相色譜聯用的技術。
2.按照權利要求1所述中藥活性成分與DNA相互作用的研究方法，其特徵在於具體包含如下步驟——將待研究的中藥提取液和DNA溶液混合形成均相的混合體系，微透析取樣並收集反應透析液；——在與上述步驟相同的條件下，將待研究的中藥提取液和不含DNA的空白溶液混合形成均相的混合體系，微透析取樣並收集空白透析液；——將上述反應透析液和空白透析液在相同的條件下分別進行高效液相色譜分析；——將上述分析獲得反應透析液和空白透析液色譜圖進行比較，相對於空白透析液相色譜，峰面積減小的為待研究的中藥提取液中能夠和DNA分子發生相互作用的活性成分，峰面積沒有發生變化的為不能夠和DNA分子發生相互作用的成分。
3.權利要求1或2所述中藥活性成分與DNA相互作用的研究方法用於中藥有效成分的篩選。
全文摘要
一種中藥活性成分與DNA相互作用的研究方法，其特徵在於採用微透析取樣技術與高效液相色譜聯用的技術。具體包含如下步驟分別將待研究的中藥提取液和DNA溶液，及待研究的中藥提取液和不含DNA的空白溶液混合形成均相的混合體系，微透析取樣並收集反應透析液和空白透析液；在相同的條件下分別進行高效液相色譜分析；將上述分析獲得譜圖進行比較，相對於空白透析液相色譜，峰面積減小的為待研究的中藥提取液中能夠和DNA分子發生相互作用的活性成分，峰面積沒有發生變化的為不能夠和DNA分子發生相互作用的成分。本方法操作簡便易行，樣品用量少，結果直觀可見。
文檔編號G01N30/86GK1719246SQ20041002091
公開日2006年1月11日 申請日期2004年7月7日 優先權日2004年7月7日
發明者鄒漢法, 蘇興業, 孔亮, 郭明 申請人:中國科學院大連化學物理研究所