一種檢測發酵蔬菜中原核微生物多樣性的方法

2024-04-05 22:04:05

專利名稱：：一種檢測發酵蔬菜中原核微生物多樣性的方法
技術領域：
：本發明涉及微生物檢測技術，具體地說是一種應用分子手段檢測發酵蔬菜中原核微生物多樣性的方法。
背景技術：
：蔬菜發酵體系是一種獨特的微生態環境。其中的微生物(原核微生物)與發酵蔬菜製品的品質和風味有直接的關係，對發酵蔬菜中微生物的多樣性及其所扮演角色進行調查研究為改進傳統蔬菜發酵工藝、探究發酵菜風味形成機理等方面提供可供參考的數據。據資料報導，前人用微生物培養方法[1]和非培養方法(分析脂肪酸的方法[2-3和分析細胞碳源利用["])對發酵蔬菜中乳酸菌作系統分類法的研究。微生物的培養分離方法是在人工配製的培養基上接入發酵蔬菜水樣品，以一定的培養條件下培養發酵蔬菜水中微生物的方法，這種方法由於使用的培養基和培養條件和發酵蔬菜體系中營養、環境條件不完全相同，不可避免地會造成菌株的富集和衰退，這就人為改變了原始發酵蔬菜體系中菌群的微生態構成，會對研究結果造成較大的偏差。可能在發酵蔬菜體系中佔主要地位或含量很高的菌群在培養基中無法培養或生長很差。反而用培養分離法從發酵蔬菜中分離出的優勢的菌種經研究後卻發現這些細菌僅僅是由於培養基上能大量被培養出來，從而被高估了它們的實際含量和作用。另外，自然界中有相當的菌種(約有90%-99%)用培養基無法培養出來。因此用培養分離的方法反映發酵蔬菜體系中微生物種類和實際存在的微生物存在很大偏差。並且用微生物培養方法需要時間長，步驟繁瑣。用脂肪酸組成非培養方法分析發酵蔬菜體系中微生物多樣性時鑑定區分關係較遠的微生物有一定困難，其應用受到限制；碳源利用分析方法主要基於革蘭氏陰性菌的鑑定，不能真實反應發酵蔬菜體系中大量微生物。而用本發明的分子生物學手段能夠快捷、準確的反映發酵蔬菜中微生物多樣性。
發明內容本發明的目的在於針對上述不足提供一種檢測發酵蔬菜中微生物多樣性的新方法，該方法避開了微生物培養分離環節，釆取直接從樣品中抽取所含微生物總DNA進行分析，了解其中所包含的微生物DNA的種類，並且還可以估算各種微生物的相對含量。本發明方法包括如下步驟從樣品中抽取所含微生物總DNA，以總DNA為模板，以16SrRNA基因通用引物為引物擴增16SrRNA基因，回收擴增產物並建立16SrRNA基因的克隆菌庫，測定陽性克隆16SrRNA基因的序列，與基因資料庫比較後確定其身份。本發明的樣品可以是發酵液。所使用的通用引物可以是大腸桿菌16SrRNA上的一段。並且可以根據所要具體擴增的產物類型進一步確定引物序列。建立克隆菌庫可以釆用常規的方法，將擴增產物回收，並和T載體連接後導入感受態大腸桿菌中，經選擇性培養得到了16SrRNA基因的克隆菌庫。在測序前可以對陽性克隆菌用PCR法進一步確認，然後再送交測序公司測序可降低成本。並且可以通過計算某一陽性克隆菌佔總陽性克隆菌的比例確定該菌在發酵蔬菜體系中的相對含量。本發明方法由於直接從樣品中提取DNA，中間沒有任何篩選性的過程，因此，所得DNA能夠準確地反映發酵蔬菜中微生物種類，避免了培養分離方法不能真實反映發酵蔬菜體系微生態實際情況的缺點，並能夠對發酵蔬菜中某一微生物在發酵蔬菜體系中的含量作出評估。由於本發明方法不需要將菌種進行分離，因而可以大大縮短了檢測時間。4圖l是釆用常規方法的鑑定程序。具體實施例方式下面實施例用於對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的範圍。實施例l用16SrRNA基因檢測泡菜水中乳酸菌的種類及含量取四川泡菜水IO毫升，用滅菌的濾紙過濾，用細菌基因組DNA提取試劑盒(天根時代公司[TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.，LTD])提取發酵蔬菜濾液中微生物總DNA,以此DNA為模板，以細菌16SrRNA基因通用引物為引物進行PCR擴增，上下遊引物分別為fD1:5'國AGAGTTTGACCTCCTCCTGGCTCAG-3'rDl:5'國AAGGAGGTGATCCAGCC-3'擴增條件反應體系和反應條件分別見表1和表2。表1PCR反應體系Tab.lReactionsystemofPCRtableseeoriginaldocumentpage5表2PCR反應條件tableseeoriginaldocumentpage5再延伸72C10min回收擴增產物並與T載體連接，將連接產物導入感受態大腸桿菌ToPlO,用選擇培養基培養，篩選陽性克隆(含有目的片斷連接產物的菌落)，用PCR方法進一步確認陽性克隆，將陽性克隆測序，將測序結果分別在GenBank庫中比對，結果發現在本例中共有8種乳酸菌。見表3。表3發酵菜商中乳酸菌的16SrDNA序列分析結果OrganismidentifiedNo.(%)ofUniqueclonedesignationGenBankaccession%Similarity'鑑定的微生物organism不同微生物的編號number同源性(％)identifiedGenBank登錄號相對含量(％)丄a加6ocz7/wsaciaf的r/wfle14(25.46)BH>B3,B16，B26，B20，B21，DQ649012B5，B29，B30，B35，B4，B8，B36,B4097.998.7丄(3加6aa7/w51p/。她n/w20(36.36)B19，B25,B2，B6，B10，B13，DQ64卯13B27，B34,B14，Bl,B7，B18，B24,B15，B38，B39，B23，B4l，B42，B12,B2898,199.03(5.46)B44，B46DQ64901598.1~99.14(7.27)5(9.01)6(10.91)2(3.64)1(1.81)B50，B17，B6，B9DQ649014B22，B43，B51，B53，B55EF423913B31，B32，B37，B45，B47，B48EF423914B49，B52B54EF423911EF42390898.599.298.699.998.6-99.098.399.2*克隆菌16SrRNA基因序列同GenBank庫中比對後的同源程度用常規方法檢測發酵蔬菜體系中乳酸菌多樣性的方法步驟:1.發酵菜滷中乳酸菌的分離分離乳酸菌是用MRS和M17培養基。MRS瓊脂用於分離乳酸桿菌，明串珠菌和足球菌屬的乳酸菌。M17用於分離乳球菌屬和腸球菌。將發酵菜滷稀釋(105、106、10。後接種的MRS,M17平板在3(TC厭氧培養48時。從不同的高濃度平板中隨機挑取菌落轉移到裝有無菌MRS和M17肉湯培養基的10ml試管中，進行種屬鑑定之前將分離的菌落在適宜的瓊脂培養基上用連續劃線方法純化。共103株純化的菌。2發酵菜卣中乳酸菌的鑑定程序及實驗項目鑑定程序可參照圖l進行，實驗項目包括1)革蘭氏反應試驗2)觸酶反應試驗3)葡萄糖產氣實驗4)溫度和鹽濃度對微生物的影響通過上面的性質實驗把乳酸菌歸類，從同一類型選取幾株為代表用API50CH試劑條和API50CHL培養基進行碳源利用實驗，並用軟體作出鑑定結果。3.分離的乳酸菌的鑑定到屬的水平應用API50CH試劑條和API50CHL培養基按照廠商(APIsystem，Bio-Merieux,France)的指示說明對分離的30菌株(每類取5株)進行糖發酵反應，試驗結果由APILABPLUS(Version3.3.3，Bio畫Merieux，France)程序和標準分類法描述。API50CH試劑條成份見下表表4API50CH試劑條成份Table4ReagentcomponentofAP150CH碳源_對照25七葉靈1甘油26柳醇2赤癬醇27纖維二糖3D—阿拉伯糖28麥芽糖4L-阿拉伯糖29乳糖7tableseeoriginaldocumentpage8實驗結果:表5發酵菜滷中iL酸菌的表型鑑定試驗結果tableseeoriginaldocumentpage8兩種方法的分析比較l.常規方法的實驗時間為三個月左右，用本發明方法只需一周就可完成.檢測時間縮短了約13倍。2.用常規方法鑑定的乳酸菌有六種，分別為Z^cto6""7/^/acrics。其中丄acto6acz7/z^//朋torwm的含量最多，為分離總乳酸菌的34.44%，其)大是Z^cfo6acz7/Ms屍ew^wiw和丄flcA9Zjac/〃Ms6rev^，分另l)為30%和27.78%，Zflcto6ac7.〃z^y^7wewrt/m、丄ewco"ostoc附esew&ro/das、丄ac/oZac7.〃ws/ad'cs的含量少.3.用本發明方法鑑定的乳酸菌有八種，分別為丄"Ctok7C/〃Mac/dz》W"ae(25.46^)、丄"Co6(afc;/〃Ms//aw^^Mm(36.36%)、屍ed/ococcws>sp.(5.46%)、ffe^se〃aco"ykya(7.27%)丄acto6ac/〃ws/ewtosws(9.01M)、丄aCo6acz.〃wscwrw^M51(10.91^0)、丄ewcowastocw&sewterozVifes(3.64%)、丄acto6a"7/ws/^附附&7(1.81%)。其中Za"o6ac/〃附//awtoram的含量最多。這和常規檢測方法的結果一致，其次為Z^cto6""7/w2(3e(25.46%),此菌和屍Wococcws>sp.(5.46%)、,&e〃aco"yksa(7.27%)、丄ac^o6ac/〃MSci^va^^(10.91%)、丄acfoZ)ac/〃MS/2"wmewY(1.81%)是用常規方法未檢測到的乳酸菌。而常規方法檢測/""/^用本方法未檢測到，可能和培養基的成分適應這些菌的生長以及對菌的識別的差異有關。本發明未涉及培養基的配製和人為識別菌的其他實驗，因此反應發酵菜中乳酸菌的多樣性是真實的，並能夠對某一菌的含量做出正確的估計。參考文獻1、邱致廣.酸菜醃製過程中微生物與風味物質的變化[博士學位論文].臺灣國立中興大學食品科學研究所，19932、LeeJ.S.,JungM.C.，LeeK.C.，"a/,.IdentificationoflacticacidbacteriafromkimchibycellularFAMEsanalysis.KoreanJournalofAppliedMicrobiologyandBiotechnology,1996a,24:234~2413、LeeJ.S.,ChunC.O.,Kim,H.J.,"or/.AnalysisofcellularfattyacidmethylestersFAMEs.FortheidentificationofZewcowo加cstrainsisolatedfromkimchi.JournalofMicrobiology,1996b，34:225~2284、LeeJ.S.,ChunC.O.，JungM.C.，Wa/..Classificationofisolatesoriginationgfromkimchiusingcarbon-sourceutilizationpatterns.JournalofMicrobiologyandBiotechnology,1997a,7:68~745、LeeJ.S.，ChunC.O.，HectorM.，"a/..IdentificationofLeuconostocstrainsisolatedfromkimchiusingcarbon-sourceutilizationpatterns.JournalofMicrobiology,1997b,35:10~1權利要求1、一種檢測發酵蔬菜中微生物多樣性的方法，包括步驟從樣品中抽取所含微生物的總DNA，以總DNA為模板，以16SrRNA基因通用引物為引物擴增16SrRNA基因，回收擴增產物並建立16SrRNA基因的克隆菌庫，測定陽性克隆16SrRNA基因的序列，與基因資料庫比較後確定其身份。2、如權利要求l所述的方法，其特徵在於，該方法還包括通過計算某一陽性克隆菌佔總陽性克隆菌的比例確定該菌在發酵蔬菜體系中的相對含量。3、如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述的通用引物為細菌16sRNA基因通用引物。4、如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述的通用引物為fD1:5'國AGAGTTTGACCTCCTCCTGGCTCAG-3'rDl:5'-AAGGAGGTGATCCAGCC扁3'。5、如權利l或2所述的方法，其特徵在於，將擴增產物回收後，與T載體連接，並導入感受態大腸桿菌中，經選擇性培養得到16SrRNA基因的克隆菌庫。6、如權利要求l或2所述的方法，其特徵在於，在測序前還包括對陽性克隆菌用PCR法進一步確認。全文摘要本發明提供了一種檢測發酵蔬菜中微生物多樣性的方法，本發明方法直接從樣品中抽取所含微生物的總DNA，通過對16SrRNA基因的序列分析，從而確定樣品中微生物的種類。本發明方法由於直接從樣品中提取DNA，中間沒有任何篩選性的過程，因此，所得DNA能夠準確地反映發酵蔬菜中微生物種類，避免了培養分離方法不能真實反映發酵蔬菜體系微生態實際情況的缺點，並能夠對發酵蔬菜中某一微生物在發酵蔬菜體系中的相對含量作出評估。由於本發明方法不需要將菌種進行分離，因而可以大大縮短了檢測時間。文檔編號C12Q1/06GK101445822SQ200810102760公開日2009年6月3日申請日期2008年3月26日優先權日2008年3月26日發明者惠張,燕平梅,薛文通申請人:中國農業大學