一種柑桔潰瘍病菌接種方法
2024-04-01 11:37:05
專利名稱：一種柑桔潰瘍病菌接種方法
技術領域：
本發明涉及植物病害、病原研究技術領域，特別是涉及一種柑桔潰瘍病菌接種方法。
背景技術：
柑桔是世界第一大水果，在巴西、中國、美國等138個國家(地區)都有種植，總面積約800萬hm2，總產量1.2億餘噸。中國是柑桔最重要的原產中心，目前柑桔栽培面積約190萬hm2,年產量約2千萬噸,分別居世界第一位和第二位。柑桔潰瘍病(citrus canker)是由地毪草黃單胞桿菌柑桔致病變種(Xanthomonas axonopodis pv.cirri)引起的柑桔毀滅性病害，為國內外重大檢疫對象，主要侵染芸香科柑桔屬、枳屬及金柑屬植物。該病害主要分布在亞洲、非洲及美洲的30多個國家，約佔生產柑桔國家和地區的三分之一，其中以亞洲發生最為普遍。因此，對柑桔潰瘍病的發生流行和防控技術研究的重要性可見一斑，而最基礎的研究內容包含病原菌的致病性、菌系分化、藥劑研製與篩選等，這些研究內容的必需手段之一即是病原菌的接種方法。傳統的接種方法為針刺接種法，該方法通過針刺形成傷口，有助於病菌侵入，此方法雖然接種成功率高，但缺點也正是由於人為針刺形成傷口，提高了病菌的侵入可能，不能真實反應接種病菌的致病力。同時，針刺接種的發病點僅限於針刺位置，與自然發病的隨機分布不符，不便於病害調查分級。
發明內容
為了克服傳統接種方法的缺點，本發明的目的在於提供一種柑桔潰瘍病菌接種方法，即噴霧接種法，是一種簡便、高效及更符合病害發生發展客觀實際的柑桔潰瘍病菌接種方法。可真實反應接種用的柑桔潰瘍病菌的侵入力、致病力，與田間自然發病相似，為柑桔潰瘍病和其病原學的研究提供更合理的接種方法。
本發明所述的柑桔潰瘍病菌接種方法依次通過下列步驟實現:
(1)用牛肉汁蛋白腖培養基(NA)培養柑桔潰瘍病菌純菌種；
(2)將培養好的菌種用無菌水稀釋成濃度為IXlO8cfu/mL的菌體懸浮液；
(3)將菌體懸浮液均勻噴霧在柑桔活體植株或離體葉片上，使葉片剛好布滿霧滴；
(4)接種完成後，將柑桔活體植株或離體葉片移入溫度為23-28°C、相對溼度大於80%的環境中培養5天，然後移入普通環境中培養。
圖1為傳統針刺接種發病症狀 圖2為田間病害症狀
圖3為本發明接種發病症狀 本發明的優點如下:
(I)操作簡便，容易實施，實用性強。
(2)無人為創傷，病菌侵入能力、侵入途徑和致病等方面更能反應真實情況。(3)接種方式與田間病菌接觸寄主相似，症狀表現貼近自然，更適宜於病害發病率和嚴重度調查。
具體實施例方式實施例1:離體葉片接種
(1)將柑桔潰瘍病菌純菌種用牛肉汁蛋白腖培養基(NA)活化培養24h ；
(2)將培養好的菌種用無菌水稀釋成濃度約為IXlO8cfu/mL的菌體懸浮液；
(3)選取成熟初期的健康柑桔葉片，用70%酒精清洗表面30s，接著用無菌水衝洗1-2min，再用無菌濾紙輕輕吸乾表面水分，在操作過程中保護葉柄傷口處不沾水；
(4)將步驟(2)準備好的菌體懸浮液用無菌微型噴霧器均勻噴霧在步驟(3)準備的葉片背面，以剛好布滿霧滴為宜，無菌水為對照；
(5)接種完成後，將柑桔葉片移入溫度為23-28°C、相對溼度大於80%的恆溫箱或人工氣候箱中培養，7天後可觀察發病情況。
實施例2:活體植株接種
(1)將柑桔潰瘍病菌純菌種用牛肉汁蛋白腖培養基(NA)活化培養24h ；
(2)將培養好的菌種用無菌水稀釋成濃度約為IXlO8cfu/mL的菌體懸浮液；
(3)選取有合適數量的初期成熟葉片的健康柑桔植株材料，且植株大小適合溫室或人工氣候箱培育；
(4)將步驟(2)準備好的菌體懸浮液用無菌微型噴霧器均勻噴霧在步驟(3)準備的柑桔植株葉片正反面，以無菌水作對照處理，葉片上剛好布滿霧滴為宜；
(5)接種完成後，將柑桔植株移入溫度為23-28°C、相對溼度大於80%的溫室(或人工氣候箱)中培養(也可保溼培養5天後移入常規溫光環境中培養)，25天後觀察症狀情況。
權利要求
1.一種柑桔潰瘍病菌接種方法，其特徵在於依次通過下列步驟實現: (1)用牛肉汁蛋白腖培養基培養柑桔潰瘍病菌純菌種； (2)將培養好的菌種用無菌水稀釋成濃度為IXlO8cfu/mL的菌體懸浮液； (3)將菌體懸浮液均勻噴霧在柑桔活體植株或離體葉片上，使葉片剛好布滿霧滴； (4)接種完成後，將柑桔活體植株或離體葉片移入溫度為23-28°C、相對溼度大於80%的環境中培養5天，然後移入普通環境`中培養。
全文摘要
一種柑桔潰瘍病菌接種方法，先用牛肉汁蛋白腖培養基培養柑桔潰瘍病菌，製成菌體懸浮液，然後噴霧接種在柑桔活體植株或離體葉片上進行培養。是一種簡便、高效及更符合病害發生發展客觀實際的柑桔潰瘍病菌接種方法。可真實反應接種用的柑桔潰瘍病菌的侵入力、致病力，與田間自然發病相似，更適宜於病害發病率和嚴重度調查。操作簡便，容易實施，實用性強。
文檔編號C12Q1/02GK103173515SQ20131009218
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月21日 優先權日2013年3月21日
發明者馬冠華, 董國菊, 肖崇剛 申請人:西南大學