一種基於lamp技術的番茄細菌性潰瘍病的檢測方法
2024-04-01 08:59:05
一種基於lamp技術的番茄細菌性潰瘍病的檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種基於LAMP技術快速鑑定番茄細菌性潰瘍病菌的檢測方法。所述檢測方法包括LAMP引物的設計與合成、模板DNA的提取、LAMP擴增體系建立，LAMP擴增方法，所述的LAMP擴增方法反應溫度為63℃左右、反應在90min內完成擴增，引物包括外引物、內引物；所述方法操作簡便，成本低廉、高靈敏度、檢測特異性大於99%、高特異性、不易汙染。
【專利說明】—種基於LAMP技術的番茄細菌性潰瘍病的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，特別涉及一種基於LAMP技術快速鑑定番茄細菌性潰瘍病菌的檢測方法。
【背景技術】
[0002]番茄潰瘍病是番茄生產中最為嚴重、具有毀滅性的病害之一。其病原菌為密執安棒桿菌密執安亞f中，即 Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,簡稱 Cmm0
[0003]該病自從1909年首次在美國密執安州的溫室番茄上發現以來，現己廣泛分布於美國各番茄產區，並逐漸成為世界性病害。20世紀年代、60年代和80年代，番茄潰瘍病在美國中西部地區、北卡羅來那州及加拿大安大略地區大流行，造成的產量損失最高達以上。一年期間，該病在英國大流行，使番茄罐頭工業受到嚴重影響。目前，在美洲、歐洲、亞洲、非洲和大洋洲的多個國家都有番茄潰瘍病發生危害的報導。我國有關番茄潰瘍病的記載始於1981年，目前番茄潰瘍病在我國北京、黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、新疆、河北、山西、山東、上海、海南等省、市、自治區都有發生，使許多地區番茄生產受到了不同程度的影響。因此，我國1995年將該病原菌列入《全國植物檢疫對象名單》，2007年列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》。 [0004]目前國內通用的GB、SN等標準採用培養、生化反應等表型檢測方法和PCR、基因晶片和測序比對等分子檢測方法輔助相結合的方法，檢驗周期需要2-7天，且操作複雜，成本較高，難以適應當代貿易中快速檢驗的客觀需求。尤其是在田間地頭和碼頭海港等野外工作條件下，不具備PCR往往無法開展快速檢測。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供一種基於LAMP技術快速鑑定番茄細菌性潰瘍病菌的檢測方法，以滿足對出入境檢驗檢疫中番茄細菌性潰瘍病的鑑定。
[0006]實現本發明的技術方案為:
一種基於LAMP技術快速鑑定番茄細菌性潰瘍病菌的檢測方法，所述檢測方法包括LAMP引物的設計與合成、模板DNA的提取、LAMP擴增體系建立，LAMP擴增方法，所述的LAMP擴增方法反應溫度為63°C左右、反應在90min內完成擴增，引物包括外引物、內引物；
所述的外引物是Cmm_F3和Cmm-B3 ；
所述的內引物是Cmm-FIP和Cmm-BIP ；
所述引物序列自5』端到3』端如下:
Cmm-F3 CGCTCATGGGTGGAACAT Cmm-B3 CGGAAAGGGTCCGACAAG
Cmm-FIP ACGTTCCCACCCCACAAGGATTTTGACATTGATGCCGGCTGA Cmm-BIP CTGGTGTGTCGAGGGCATGTTTTTAAACCAGACACACCCAGAAG。[0007]其中，所述模板DNA提取指番茄組織DNA的提取，離心提取其上清液，具體步驟為:
稱取80mg樣品，加入到2ml的離心管中；加入600 μ L裂解液充分混勻。65°C溫浴至少30分鐘。然後加入30(^1^蛋白沉澱液，13000印111離心41^11。將上清液轉移至另一乾淨的1.5ml離心管中；若上清很混濁可以再加等體積的氯仿/異戊醇(24:1)顛倒混勻，13000rpm離心4min，將上清液轉移至另一乾淨的離心管中；加入0.8倍體積異丙醇，_20°C沉澱30min。13000rpm離心4min,棄上清，加入600 μ L 70%乙醇，13000rpm離心4min,棄上清，晾乾，加TE溶液30 μ L溶解。
[0008]所述LAMP擴增體系建立是採用水溶液配置，體系總體積25 μ L，其中包括:
模板DNA 2 μ L
2X U-LAMP MIX 17 μ L
Cmm-F3 5uM， IuL
Cmm-B3 5uM， IuL
Cmm-FIP40uM，I μ L
Cmm-BIP40uM，I μ L
Bst DNA 酶 8 U/ μ L，I μ L 螢光染料I μ L。
[0009]所述LAMP擴增方法採用實時螢光PCR儀，將按照LAMP擴增體系配製好的試劑加入反應器中，63°C左右反應I小時，共分為40個循環，每個循環I分鐘30秒，每個循環結束時收集螢光。
[0010]所述LAMP擴增方法採用普通水浴鍋或金屬浴完成，將按照LAMP擴增體系配製好的試劑加入PE管中，放入63°C左右水浴鍋中保溫90min，然後取出放入另一 80°C水浴鍋中保溫10 min後，取出。
[0011]本發明與現有技術相比其顯著優點是:(1)操作簡便，成本低廉。環介導等溫擴增(LAMP)方法是具有與PCR技術同等甚至超越的優勢，加之對儀器設備要求寬鬆，不用PCR儀，簡單易行，周期短至I小時，可縮短檢驗周期50%以上，可實現大量樣品的快速檢測，適合進行現場及大量樣品的高通量檢測。(2)高靈敏度。檢測靈敏度高於普通PCR2-3個數量級，檢測敏感性為100-10000cfu/mL，檢測特異性大於99%。(3)高特異性。所檢測的陰性對照株均無陽性結果出來。(4)不易汙染。本發明的螢光染料是在反應前加入的鈣黃綠素商用染料，上機檢測過程不需要開蓋，可以有效避免開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠汙染。提高了檢測的重複性，降低了檢測的假陽性。
[0012]下面結合附圖對本發明作進一步說明。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1是本發明LAMP方法特異性擴增曲線圖；(I為番茄細菌性潰瘍病菌；2_6為苜蓿細菌性萎蔫病菌；玉米內州萎蔫病菌；馬鈴薯環腐病菌；菜豆細菌性萎蔫病菌；鬱金香黃色皰斑病菌；番茄細菌性葉斑病菌)。
[0014]圖2是本發明LAMP 方法檢測番茄樣品電泳結果圖；(M:DNA Marker DL2000 ；1:陰性對照；2-7:待檢番茄樣品)。【具體實施方式】
[0015]下面結合基於LAMP技術快速鑑定番茄細菌性潰瘍病菌的方法的實例說明本發明的【具體實施方式】。
[0016]實施例1
基於LAMP技術快速鑑定番茄細菌性潰瘍病菌的檢測方法，所述檢測方法包括LAMP引物的設計與合成、模板DNA的提取、LAMP擴增體系建立，LAMP擴增方法，所述的LAMP擴增方法反應溫度為63°C左右、反應在90min內完成擴增，引物包括外引物、內引物；
所述的外引物是Cmm_F3和Cmm-B3 ；
所述的內引物是Cmm-FIP和Cmm-BIP ；
所述引物序列自5』端到3』端如下:
Cmm-F3 CGCTCATGGGTGGAACAT Cmm-B3 CGGAAAGGGTCCGACAAG
Cmm-FIP ACGTTCCCACCCCACAAGGATTTTGACATTGATGCCGGCTGA Cmm-BIP CTGGTGTGTCGAGGGCATGTTTTTAAACCAGACACACCCAGAAG。
[0017]具體步驟為:
步驟一，模板DNA的 提取:稱取80mg菌體組織。加入到2ml的離心管中；加入600 μ L裂解液充分混勻。65°C溫浴至少30分鐘。然後加入300 μ L蛋白沉澱液，13000rpm離心4min。將上清液轉移至另一乾淨的1.5ml離心管中；若上清很混濁可以再加等體積的氯仿/異戊醇(24:1)顛倒混勻，13000rpm離心4min，將上清液轉移至另一乾淨的離心管中；加Λ 0.8倍體積異丙醇,_20°C沉澱30min。13000rpm離心4min,棄上清,加入600 μ L 70%乙醇，13000rpm離心4min,棄上清，晾乾，加TE溶液30 μ L溶解。
[0018]步驟二，引物設計和合成:引物序列自5』端到3』端如下:
Cmm-F3 CGCTCATGGGTGGAACAT
Cmm-B3 CGGAAAGGGTCCGACAAG
Cmm-FIP ACGTTCCCACCCCACAAGGATTTTGACATTGATGCCGGCTGA Cmm-BIP CTGGTGTGTCGAGGGCATGTTTTTAAACCAGACACACCCAGAAG。
[0019]步驟三，LAMP擴增體系建立:採用水溶液配置，體系總體積25 μ L,其中包括: 模板DNA 2 μ L
2X U-LAMP MIX 17 μ L
Cmm-F3 5uM， IuL
Cmm-B3 5uM， IuL
Cmm-FIP40uM，I μ L
Cmm-BIP40uM，I μ L
Bst DNA 酶 8 U/ μ L，I μ L 螢光染料I μ L。
[0020]步驟四，LAMP擴增:將按照LAMP擴增體系配製好的試劑放入八聯管，置於實時螢光PCR儀中，63°C左右反應I小時，共分為40個循環，每個循環I分鐘30秒，每個循環結束時收集螢光。根據管中螢光的的情況即可判斷該番茄樣品是否攜帶細菌性潰瘍病病菌。[0021]分別選取番茄細菌性潰瘍病菌；苜蓿細菌性萎蔫病菌；玉米內州萎蔫病菌；馬鈴薯環腐病菌；菜豆細菌性萎蔫病菌；鬱金香黃色皰斑病菌；番茄細菌性葉斑病菌菌體組織經過DNA提取後，配製LAMP擴增體系，使用實時螢光PCR儀作為反應器，進行LAMP檢測，經過實時螢光擴增之後，觀察螢光曲線圖，從圖1可以看出:2-6病原菌均未出現擴增信號，而僅有目標病原菌番茄細菌性潰瘍病菌出現明顯的擴增信號，判定為檢出。
[0022]實施例2
基於LAMP技術快速鑑定番茄細菌性潰瘍病菌的檢測方法，所述檢測方法包括LAMP引物的設計與合成、模板DNA的提取、LAMP擴增體系建立，LAMP擴增方法，所述的LAMP擴增方法反應溫度為63°C左右、反應在90min內完成擴增，引物包括外引物、內引物；
所述的外引物是Cmm_F3和Cmm-B3 ；
所述的內引物是Cmm-FIP和Cmm-BIP ；
所述引物序列自5』端到3』端如下:
【權利要求】
1.一種基於LAMP技術快速鑑定番茄細菌性潰瘍病菌的檢測方法，其特徵在於:所述檢測方法包括LAMP引物的設計與合成、模板DNA的提取、LAMP擴增體系建立，LAMP擴增方法，所述的LAMP擴增方法反應溫度為63°C左右、反應在90min內完成擴增，引物包括外引物、內引物; 所述的外引物是Cmm_F3和Cmm-B3 ； 所述的內引物是Cmm-FIP和Cmm-BIP ； 所述引物序列自5』端到3』端如下: Cmm-F3 CGCTCATGGGTGGAACAT Cmm-B3 CGGAAAGGGTCCGACAAG Cmm-FIP ACGTTCCCACCCCACAAGGATTTTGACATTGATGCCGGCTGA Cmm-BIP CTGGTGTGTCGAGGGCATGTTTTTAAACCAGACACACCCAGAAG。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於:所述模板DNA提取指番茄組織DNA的提取。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於:所述LAMP擴增體系建立是採用水溶液配置，體系總體積25 μ L,其中包括: 模板DNA 2 μ L 2 X U-LAMP MIX 17 μ L Cmm-F3`5uM，IuL Cmm-B35uM，IuL Cmm-FIP40uM，I μ L Cmm-BIP40uM，I μ L Bst DNA 酶8 U/ μ L，I μ L 螢光染料I μ L。
4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於:所述LAMP擴增方法採用實時螢光PCR儀，將按照LAMP擴增體系配製好的試劑加入反應器中，63°C左右反應I小時，共分為40個循環，每個循環I分鐘30秒，每個循環結束時收集螢光。
5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於:所述LAMP擴增方法採用普通水浴鍋或金屬浴完成，將按照LAMP擴增體系配製好的試劑加入PE管中，放入63°C左右水浴鍋中保溫90min，然後取出放入另一 80°C水浴鍋中保溫10 min後，取出。
【文檔編號】C12Q1/68GK103773853SQ201310737212
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年12月30日 優先權日:2013年12月30日
【發明者】楊雷亮, 孫麗霞, 邱德義, 陳定虎, 管維, 王章根 申請人:中華人民共和國中山出入境檢驗檢疫局