Pcr法檢測抗抑黴唑柑橘綠黴菌菌系的引物序列及方法
2024-04-01 10:14:05
專利名稱：Pcr法檢測抗抑黴唑柑橘綠黴菌菌系的引物序列及方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種PCR法檢測抗抑黴唑柑橘綠黴菌菌系 的引物序列及方法。
背景技術：
我國是世界柑橘生產的第一大國，目前我國柑橘的栽培面積(2700萬畝)和產量 (2500萬噸)，均居世界第一。由柑橘綠黴病菌(Penicilliumdigitatum)造成的柑橘綠黴 病是柑橘採後貯藏和銷售期間的最主要病害，如果不使用藥劑處理，一般年份該病害可導 致20-30%的採後柑橘腐爛。1990年開始，我國廣泛應用殺菌劑抑黴唑(imazalil)處理採後柑橘以防治貯藏 期的綠黴病發生。但由於長期使用，抗抑黴唑的柑橘綠黴病菌系已在各柑橘產區陸續發現， 在抗性菌株存在的貯藏庫，常規劑量的抑黴唑對綠黴病的控制效果很差，甚至完全失效。因 此，建立抗性菌株的快速檢測技術對指導果農科學用藥，保證防治效果極有必要。已有的研究發現，柑橘綠黴病菌對抑黴唑的抗性存在2種分子機制。(1) 14 α -脫 甲基酶基因CYP51啟動子區的一個U6_bp轉錄增強子簡單串聯重複了 5次，比敏感菌株多 了4次(Hamamoto H,Hasegawa K,NakauneR,et al. Tandem repeat of a transcriptional enhancer upstream of the stetol14 α-demethylase gene(CYP51)in Penicillium digitatum[J], Applied andEnvironmental Microbiology,2000,66 (8) :3421-3426 ；Li H Y,Xie Q Y,SongA H. Sequence comparison of CYP51 genes between imazalil—sensitive andimazalil-resistant strains of Penicillium digitatum(in Chinese)[J]. Mycosystema (菌物系統)，2003，22(1) : 153-256.)，我們稱之為抑黴唑抗性I型；⑵CYP51 啟動子區的126-bp轉錄增強子中插入了一段199-bp核苷酸序列((ihosoph J M, Schmidt L S, Margosan D A, et al. Imazalil resistancelinked to a unique insertion sequence in the PdCYP51 promoter region ofPenicillium digitatum[J]. Postharvest Biology and Technology, 2007,44 :9-18)，我們稱之為抑黴唑抗性II型。這些額外插入導致抑黴 唑靶標(CYP51)基因的表達上升，從而使病菌抗藥性出現。基於以上抗性分子機制，國際 上和國內(本實驗室)已經建立快速的分子檢測體系(HamamotoH，Hasegawa K，Nakaune R, et al. PCR-based detection of sterοldemethyIation inhibitor-resistant strains of Penicillium digitatum[J]. PestManagement Science, 2001, 57 :839-843.； Chen G J, Zhang Z F, Jiang L Y, etal. Real-time PCR assay for detection of the frequency of i mazali1-resistanceof Penicillium digitatum(in Chinese)[J]. ACTA PHYT0PATH0L0GICASINICA(植物病理學報)，2008, 38 (6) :561-569)。然而，最近我們發現，雖然上述抗性分子機制在我國也存在，但絕大多數從浙江分 離的抑黴唑抗性菌系的CYP51基因啟動子區並不存在任何的額外插入，抗性既不屬於抗性 I型或II型。通過分析柑橘綠黴菌EST庫發現，柑橘綠黴病菌CYP51基因存在兩個同源基 因，稱之為CYP51B和CYP51C。比較敏感菌株與抗性菌株之間CYP51B全長基因及其上遊1Kb的序列，發現抗性菌株CYP51B啟動子區上遊_174bp處均有一個199bp核苷酸序列的插入， 而該序列在敏感菌株中均不存在。實時螢光定量PCR(qPCR)分析表明，抗性菌株的CYP51B 表達量比敏感菌株高6倍或以上。將包含該199bp核苷酸插入的CYP51B基因導入敏感菌 株，能使敏感菌株對抑黴唑的抗性增強。以上事實說明，CYP51B啟動子區的199bp序列插 入是導致這類菌系對抑黴唑抗性的分子機制，稱之為抑黴唑抗性III型。
發明內容
本發明提供了一組引物序列，利用該組引物序列對待測菌DNA進行擴增，可以鑑 定柑橘綠黴菌抗抑黴唑的類型。一種PCR法檢測抗抑黴唑柑橘綠黴菌菌系的引物序列，包括兩對引物，其中第一 對引物的上遊引物的鹼基序列如SEQ ID NO. 1所示，第一對引物的下遊引物的鹼基序列如 SEQ ID NO. 2所示；第二對引物的上遊引物的鹼基序列如SEQ ID NO. 3所示，第二對引物的 下遊引物的鹼基序列如SEQ ID NO. 4所示。本發明還提供了利用上述引物序列檢測抗抑黴唑柑橘綠黴菌菌系的方法，包括(1)提取待測菌的DNA ；(2)以提取的DNA為模板，利用上述引物序列進行PCR擴增；(3) PCR擴增產物進行凝膠電泳分離，染色；(4)根據凝膠上的條帶數目及其位置判定待測菌抗抑黴唑的類型。本發明抗性引物特異性高，利用本發明引物可在一個PCR反應體系中即可檢測出 待測菌株是否是抑黴唑抗性菌株以及抗性的分子類型，且操作方便，耗時少。基於上述該檢測結果，可有效地掌握儲藏庫中抗性菌系種群的發展動態，指導果 農科學用藥，避免盲目用藥，減少成本，減少農藥殘留，增加經濟效益和社會效益。
圖1為本發明引物序列設計示意圖；圖2為本發明抗性檢測凝膠電泳圖譜示意圖，M =DNA Marker ；S 敏感菌株；I 抗 性I型菌株；II 抗性II型菌株；III 抗性III型菌株；圖3為本發明引物特異性檢測凝膠電泳圖，M =DNA Marker ； 1 :PdKH8⑶；2 Pdl9D(II) ；3 :Pdw03 (III) ；4 =PdOl(I)；圖4為本發明抗性檢測凝膠電泳真實圖譜，A 使用CYP51A1和CYP51A2引物擴增； B:使用Bl和B2引物擴增。
具體實施例方式(1)標準菌株抑黴唑敏感(Pd23或PdKH8)、抗性I型(PdOl)，抗性II型(Pdl9D)和抗性III型 (Pdw03)的柑橘綠黴菌標準菌株，這些菌株的抗性水平均通過實驗室抗性評價確定，抗性分 子機制通過基因克隆和測序證實。且上述菌株均為實驗材料，無特異性要求。保藏於浙江 大學生物技術研究所李紅葉教授實驗室，菌種向公眾開放。 (2)待測樣品及DNA提取
從柑橘園、貯藏庫、流通環節和銷售場所採集的發病果實或從發病果實分離獲得 的純培養物，刮取發病果實或純培養物上的黴層(綠黴菌的分生孢子)，提取DNA，具體方法 如下A.將上述刮取的分生孢子(及菌絲)(約50-200mg，帶有少量培養基不影響DNA 提取)置於 2mL Eppendorf■管中，加 800 μ L SLS 裂解液 QOOmmol/L Tris-HCl, 50mmol/L EDTA,200mmol/L NaCl, 2g/100ml N-月桂醯肌氨酸鈉，pH 8. 0)，用無菌牙籤充分攪拌分散 菌絲，55°C水浴lOmin，其間振蕩混勻2-3次，13200r/min離心IOmin ；B.取上清液750 μ L於1. 5_mL Eppendorf管中，加入等體積氯仿和異戊醇(體積 比24 1)的混合溶劑抽提DNA, 13200r/min離心IOmin ；C.取上清液於新的1. 5-mL Eppendorf管中，加2倍體積無水乙醇混合混勻，_20°C 靜置 IOmin 後，於 4°C、13200r/min 離心 4min，沉澱 DNA ；D.用70%無水乙醇洗滌沉澱，沉澱於室溫放置自然乾燥5-lOmin，溶於40 μ L TE 溶液(pH 8.0)，-20°C保存備用。(3)引物合成參見圖1設計引物，得到如下4個特異性引物B1、B2、CYP51A1和CYP51A2，具體見 下表
權利要求
1.一種PCR法檢測抗抑黴唑柑橘綠黴菌菌系的引物序列，其特徵在於，包括兩對引物 第一對引物的上遊引物的鹼基序列如SEQ ID NO. 1所示，第一對引物的下遊引物的鹼基序 列如SEQ ID NO. 2所示；第二對引物的上遊引物的鹼基序列如SEQ ID NO. 3所示，第二對引 物的下遊引物的鹼基序列如SEQ ID NO. 4所示。
2.一種利用權力要求所述的引物序列檢測抗抑黴唑柑橘綠黴菌菌系的方法，包括(1)提取待測菌的DNA；(2)以提取的DNA為模板，利用權利要求1所述的引物序列進行PCR擴增；(3)PCR擴增產物進行凝膠電泳分離，染色；(4)根據凝膠上的條帶數目及其位置判定待測菌抗抑黴唑的類型。
全文摘要
本發明公開了一種PCR法檢測抗抑黴唑柑橘綠黴菌菌系的引物序列及方法，該引物序列包括兩對引物，其中第一對引物的上遊引物的鹼基序列如SEQ ID NO.1所示，第一對引物的下遊引物的鹼基序列如SEQ IDNO.2所示；第二對引物的上遊引物的鹼基序列如SEQ ID NO.3所示，第二對引物的下遊引物的鹼基序列如SEQ ID NO.4所示。本發明方法操作簡單，省時省力，結果可靠，檢測結果可為果農在藥劑的選擇上提供科學的指導。
文檔編號C12Q1/68GK102115790SQ201010591618
公開日2011年7月6日 申請日期2010年12月16日 優先權日2010年12月16日
發明者孫學鵬, 李紅葉 申請人:浙江大學