一種用於家蠶轉基因的方法
2024-02-28 14:13:15 1
專利名稱：一種用於家蠶轉基因的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及用於家蠶轉基因的方法。具體為蟲卵注射方法導入外源基因，包括家蠶產卵、注射胚胎時期、排卵方法、注射和封口、催青等，較大地提高了轉基因效率。
背景技術：
所謂轉基因是指基因的轉移，即用各種工方法插入生物體自身不具有的基因，由於染色體遺傳物質的交換而使其表現形態得以改變。通過獲得的生物稱為轉基因生物，即轉基因植物和轉基因動物。進而所謂轉基因昆蟲是指昆蟲染色體上插入了別的生物的基因的重組昆蟲。利用病毒導入外源遺傳物質時，被重組的基因存在於病毒染色體上，於是病毒僅只感染生物體(也稱宿主)，而不將重組基因傳遞給他的下一代。但是轉基因昆蟲則在染色體上進行了遺傳物質的重組，一旦外源基因導入後則可在後代中傳遞，與昆蟲自身所具有的基因在後代中的表達完全相同。因此，一旦作成轉基因昆蟲，可以輕易地進行飼育、繁殖、傳代。即是所說的徹底改變生物自身性狀的生物技術。
目前研究現狀，家蠶轉基因主要通過以下三種途徑進行1、提取外源DNA並用技術手段導入另一昆蟲體內，主要在胚胎早期進行。
早期應用此方法也曾獲得多一些變異個體，但通常這些外源DNA僅僅進入細胞質而非整合到染色體上，因此往往不能穩定地遺傳；同時外源DNA進入另一個體，往往由於降解酶的作用而迅速分解，其表達的頻率很低。
2、利用轉座子將外源基因插入到宿主染色體上。
利用轉座子進行轉基因的研究表明其轉基因效率高，一般可達2-5％，高的可達20-30％(通常為果蠅)。對大多數昆蟲而言，其影響轉座效率的因素尚需研究，包括質粒大小、報告基因、極細胞形成的時間等。外源基因在宿主染色體上的轉座位置受核苷酸排列決定，這種轉座通常是不定向的。另外基因轉座往往伴隨著宿主基因的改變或突變。
3、利用同緣重組特性，通過構建基因打靶載體將外源基因導入宿主染色體利用轉座子產生轉基因昆蟲有其轉化率高的優點，但其轉座的位點通常是隨機的。利用同緣重組特性，通過構建基因打靶載體將外源基因導入宿主染色體則具有人為的定向性。這一方法為絲腺生物反應器研究，生產特定蛋白質及改進蠶絲特性提供了可能。
昆蟲轉基因無論通過何種途徑，蟲卵注射方法導入外源基因是其關鍵步驟，直接關係到轉基因成功與否和效率。
發明內容
本發明的目的是提供一種用於家蠶轉基因的方法。包括家蠶產卵、注射胚胎時期、排卵方法、注射和封口、催青等，可以較大地提高顯微注射的效率和轉基因效率。
本發明用於家蠶轉基因的方法包括以下步驟a)將強生粉配製成60％重量比的水劑，蒸成糨糊狀，均勻塗抹於蠶連紙上，自然晾乾，取剛羽化交配雌蛾，按1小時間隔分批在蠶連紙上產卵，每隔1小時將雌蛾移至另一蠶連紙上繼續產卵，直至產卵完畢；b)用70％酒精噴灑卵面，進行消毒處理，然後用清水水洗蠶卵到容器中，用細毛筆將蠶卵逐顆整齊排列於載玻片上，蠶卵卵孔部位朝上，卵窩部位朝右，自然晾乾，利用蠶連紙上的糨糊將蠶卵粘於載玻片上，自然晾乾；c)將外源基因克隆到轉座子載體上構建成重組轉座子piggy Bac-DsRed-FigH-外源基因-LBS，將純化的重組轉座子與Helper質粒按1∶1的重量比例用注射緩衝液調整濃度為0.4μg/μl，在實體顯微鏡下實施顯微注射，注射卵齡為產卵後2-4小時，注射量為15-20ng DNA，注射後蠶卵用皮革用膠封口；d)將注射後的蠶卵連同載玻片移入催青容器，25℃催青，孵化飼養GO代幼蟲；e)螢光雙筒解剖鏡下觀察G1代蟻蠶單眼色，挑選單眼顯紅色幼蟲繼續飼養、制種，G2世代後以同樣方法以單眼紅色為標記挑選飼養並繼代，同時以Northern，Southern和Western blot方法檢測外源基因轉座及表達情況。
本發明以蟲卵注射方法導入蜘蛛絲基因為例將上述方法進一步敘述如下將市售優質強生粉配製成60％水劑，蒸熟成糨糊，均勻塗抹於蠶連質上，自然晾乾備用。取剛羽化交配雌蛾，按1小時間隔分批產卵，每隔1小時將雌蛾移至另一蠶連紙上繼續產卵，直至產卵完畢。
為便於蠶卵注射，提高注射效率和轉基因效率，產於蠶連紙上的蠶卵需進行重排。方法是將蠶卵用70％酒精噴灑卵面，進行消毒處理。然後用清水水洗蠶卵到容器中，用細毛筆將蠶卵逐顆整齊排列於載玻片上，蠶卵卵孔部位(稍尖)朝上，卵窩(淺的凹陷)部位朝右，8排每排6顆。自然晾乾，利用蠶連紙上的糨糊將蠶卵粘於載玻片上。
將蜘蛛絲基因flag克隆到轉座子載體上構建成重組轉座子piggyBac-DsRed-FigH-flag-LBS，將純化的重組轉座子與Helper質粒(提供轉座酶)按1∶1的重量比例用注射緩衝液(5mMKCl、0.5mMPBS、pH7.0)調整濃度為0.4μg/μl。在實體顯微鏡下實施顯微注射，注射卵齡為產卵後2-4小時，注射量為15-20ng DNA。注射後蠶卵用皮革用膠(無毒)封口。
將注射後的蠶卵連同載玻片移入催青容器，25℃催青。孵化飼養GO代幼蟲。螢光雙筒解剖鏡下觀察G1代蟻蠶單眼色。挑選單眼顯紅色幼蟲繼續飼養、制種。G2世代後以同樣方法以單眼紅色為標記挑選飼養並繼代，同時以Northern，Southern和Western blot方法檢測蜘蛛絲基因轉座及表達情況。
具體實施例方式
本發明通過以下實施例作進一步闡述。
實施例1解剖蜘蛛(Nephila clavata)雌性成蟲絲腺，以0.8％生理鹽水洗淨，採用Sambrook等方法抽提基因組DNA。設計橫絲基因擴增引物，引物15』-AATGAAAAAAGAGGGTTGGTACCTCCTGG-3』(下劃線為KpnI酶切位點)，引物25』-TTCGAATTTTCTTGGGTCTGCAGGTGT-3』(下劃線為PstI酶切位點)；按以下條件PCR擴增獲得橫絲基因94℃1分、56℃1分、72℃1分30秒，30個循環。將擴增的蜘蛛絲橫絲基因克隆入pFastBacHT B(Invitrogen)並測序。再將橫絲基因切出，克隆入轉座子載體pBac3×P3DsRed，構建成重組轉座子載體，該載體含有家蠶絲素重鏈啟動子，紅色螢光標記基因，轉座子和蜘蛛絲橫絲基因等部分。
實施例2轉基因注射用蠶卵為多化性N4品種，將純化的重組轉座子與Helper質粒(提供轉座酶)按1∶1的重量比例用注射緩衝液(5mMKCl、0.5mMPBS、pH7.0)調整濃度為0.4μg/μl。在實體顯微鏡下實施顯微注射，注射卵齡為產卵後2-4小時，注射量為15-20ng DNA。注射後蠶卵用皮革用膠(無毒)封口。共注射蠶卵380粒，孵化165頭蟻蠶(GO)，飼養後結繭125個，獲雌蛾48頭，經交配後產卵獲卵圈45個。45個卵圈分別催青孵化(G1)，螢光雙筒解剖鏡下觀察G1代蟻蠶單眼色。挑選單眼顯示紅色的蟻蠶2區，幼蟲繼續飼養、制種。轉座率大約為4％。
實施例3G2世代後以同樣方法以單眼紅色為標記挑選飼養並繼代。以紅色螢光陽性的G1蛾和G2第5齡第3天幼蟲後部絲腺為材料，抽提基因組DNA，並用ISOGENE(日本)提供的RNA抽提試劑盒抽提總RNA，分別以Northern，Southern方法檢測蜘蛛絲基因轉座情況。實施結果表明蜘蛛絲橫絲基因已正確導入家蠶絲素基因中，其導入位點為1-2個。將轉蜘蛛絲基因家蠶絲與對照N4繭絲作絲質檢定，其強度和彈性分別增加6-8％。
本發明方案的優點是蠶卵注射方法簡便，注射成功率高，較大地提高了轉基因效率。
權利要求
1.一種用於家蠶轉基因的方法，其特徵在於以下步驟(1)將強生粉配製成60％重量比的水劑，蒸成糨糊狀，均勻塗抹於蠶連紙上，自然晾乾，取剛羽化交配雌蛾，按1小時間隔分批在蠶連紙上產卵，每隔1小時將雌蛾移至另一蠶連紙上繼續產卵，直至產卵完畢；(2)用70％酒精噴灑卵面，進行消毒處理，然後用清水水洗蠶卵到容器中，用細毛筆將蠶卵逐顆整齊排列於載玻片上，蠶卵卵孔部位朝上，卵窩部位朝右，自然晾乾，利用蠶連紙上的糨糊將蠶卵粘於載玻片上，自然晾乾；(3)將外源基因克隆到轉座子載體上構建成重組轉座子piggy Bac-DsRed-FigH-外源基因-LBS，將純化的重組轉座子與Helper質粒按1∶1的重量比例用注射緩衝液調整濃度為0.4μg/μl，在實體顯微鏡下實施顯微注射，注射卵齡為產卵後2-4小時，注射量為15-20ng DNA，注射後蠶卵用皮革用膠封口；(4)將注射後的蠶卵連同載玻片移入催青容器，25℃催青，孵化飼養G0代幼蟲；(5)螢光雙筒解剖鏡下觀察G1代蟻蠶單眼色，挑選單眼顯紅色幼蟲繼續飼養、制種，G2世代後以同樣方法以單眼紅色為標記挑選飼養並繼代，同時以Northern，Southern和Western blot方法檢測外源基因轉座及表達情況。
全文摘要
本發明涉及用於家蠶轉基因的方法。包括家蠶產卵、注射胚胎時期、排卵方法、注射和封口、催青等，可以提高顯微注射的效率和轉基因效率。方案中使用強生粉配製糨糊將蠶卵固定，用70％酒精消毒處理蠶卵，用細毛筆將蠶卵逐顆排列，將外源基因克隆到轉座子載體上構建成重組轉座子，將純化的重組轉座子與Helper質粒按1∶1的重量比例用注射緩衝液調整濃度為0.4μg/μl，在實體顯微鏡下實施顯微注射，注射量為15－20ng DNA，注射後蠶卵用皮革用膠封口；將注射後的蠶卵連同載玻片移入催青容器，25℃催青，孵化飼養、挑選繼代、檢測。
文檔編號A01K67/00GK101016556SQ20071006666
公開日2007年8月15日 申請日期2007年1月10日 優先權日2007年1月10日
發明者繆雲根, 李廣李 申請人:浙江大學