減毒的痘苗病毒的克隆毒株及其使用方法

2023-04-22 15:39:26

減毒的痘苗病毒的克隆毒株及其使用方法
【專利摘要】本發明提供痘苗病毒的克隆毒株。還提供從病毒製備物中鑑別及分離減毒的溶瘤克隆毒株的方法。還提供克隆毒株的修飾的重組形式。所述克隆毒株及病毒製備物可以用於診斷和治療方法，特別是治療和診斷或者監測增生性病症的治療，包括腫瘤疾病，例如但不限於實體腫瘤和血液癌症。
【專利說明】減毒的痘苗病毒的克隆毒株及其使用方法
[0001] 相關申請
[0002] 本申請要求2011年4月15日申請的美國臨時申請系列號61/517,297、2011 年11月4日申請的美國臨時申請系列號61/628,684的優先權，每個申請屬於Aladar A. Szalay，Nanhai Chen，Yong A. Yu and Qian Zhang並且發明名稱是"Clonal Strains of Attenuated Vaccinia Viruses and Methods of Use Thereof，'。
[0003] 本申請與同日申請的美國專利申請號（Attorney Dkt. No. 33316. 04832. US03/4832)，發明名稱為"Clonal Strains ofTUtenuated Vaccinia Viruses and Methods ofUse Thereof"相關，該申請要求美國臨時申請系列號61/517, 297和61/628, 684的優先 權。
[0004] 當允許時，每個上述申請的主題全文引入本文。
[0005] 援引引入電子形式的序列表
[0006] 在此提交序列表電子版本，其內容全部引入本文。電子文件大小4. 44Mb，名稱為 4832seqPCl. txt〇 發明領域
[0007] 痘苗病毒分離株。
[0008] 發明背景
[0009] 痘苗病毒是一種溶瘤病毒，在腫瘤中積聚。針對治療性和診斷性應用已經開發了 減毒的痘苗病毒毒株。例如，減毒的病毒包括修飾重組病毒，其一或多個病毒基因被修飾導 致病毒基因的表達喪失或降低或者病毒蛋白質失活。然而，減毒病毒的方法可降低或減弱 該病毒的溶瘤性質。因此，仍需要減毒的溶瘤病毒及鑑別減毒的溶瘤病毒的方法。
[0010] 發明概述
[0011] 本發明提供來自LIVP製備物的分離的克隆毒株。本發明提供基本上同質的LIVP 病毒製備物的製備物。本發明還提供通過繁殖分離的克隆毒株而獲得的製備物。本發明特 別提供了分離的克隆LIVP毒株，其基因組含有核苷酸序列，該核苷酸序列不同於基因組中 含有SEQ ID N0 :10所示序列的克隆毒株。在一些實例中，本發明提供的LIVP克隆毒株具 有與SEQ ID N0:10所示核苷酸序列具有至少85%序列相同性但是不包括SEQ ID N0:10所 示核苷酸序列的核苷酸序列。例如，本發明提供的分離的克隆LIVP毒株具有與SEQ ID NO: 10 所示核苷酸序列具有至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或 99. 9 %序列相同性的核苷酸序列。在這樣的實例中，序列相同性是指通過比對含有相應於 反向末端重複序列（ITR)(如果其存在的話）的核苷酸的核苷酸序列及使用GAP全局比對 並且末端缺口不罰分而確定的序列相同性。特別地，本發明提供的LIVP克隆毒株與具有 SEQ ID N0 :9所示核苷酸序列的稱作GLV-lh68的LIVP毒株相比具有較高的抗腫瘤發生能 力和/或降低的毒性。
[0012] 在本發明提供的LIVP克隆毒株的實例中，分離的克隆LIVP毒株是存在於LIVP分 離株中或者存在於從LIVP中繁殖的病毒製備物中的毒株，所述克隆毒株與具有SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列的稱作GLV-lh68的病毒毒株相比具有降低的毒性和/或較高的抗腫瘤發 生能力。
[0013] 在本發明提供的LIVP克隆毒株的其它實例中，分離的克隆LIVP毒株是具有如後 述的基因組的毒株，所述基因組不含有非病毒異源核酸，該非病毒異源核酸具有編碼非病 毒異源蛋白質的開放讀框，所述分離的克隆LIVP毒株與具有SEQ ID N0 :9所示核苷酸序列 的稱作GLV-lh68的病毒毒株相比還呈現出降低的毒性和/或改良的抗腫瘤發生能力。
[0014] 本發明提供的LIVP克隆毒株包括與具有SEQ ID N0 :9所示核苷酸序列的稱作 GLV-lh68的病毒相比具有降低的毒性的克隆毒株。在其它實例中，本發明提供的LIVP克隆 毒株包括與具有SEQ ID N0 :9所示核苷酸序列的稱作GLV-lh68的病毒相比具有更高抗腫 瘤發生能力的克隆毒株。在進一步的實例中，本發明提供的LIVP克隆毒株包括與具有SEQ ID N0 :9所示核苷酸序列的稱作GLV-lh68的病毒相比具有降低的毒性及更高的抗腫瘤發 生能力的克隆毒株。
[0015] 在本發明提供的任何LIVP克隆毒株中，所述LIVP克隆毒株的基因組具有與SEQ ID N0 :10所示核苷酸序列具有至少85%序列相同性的核苷酸序列，但是不含有SEQ ID NO :10所示完整核苷酸序列。例如，所述分離的克隆LIVP毒株具有至少86187188%、 89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94%,95 %,96 %,97%,98 %,99 %,99. 1 % ,99. 2%,99. 3 %, 99. 4%、99. 5%、99. 6%、99. 7%、99. 8%或99. 9%的序列相同性。在這樣的實例中，序列相 同性是指通過比對含有相應於反向末端重複序列（ITR)的核苷酸的核苷酸序列及使用與 SEQ ID N0 :10所示核苷酸序列進行GAP全局比對並且末端缺口不罰分而確定的。
[0016] 在本發明提供的呈現出降低的毒性的任何LIVP克隆毒株中，降低的毒性可以在 施用於對象時顯現。例如，所述對象可以是人或非人動物，特別是馴化動物。降低的毒性可 以通過任何評估毒性作用的方法確定，例如但不限於指示毒性的參數，如對象的存活降低、 體重降低、發熱、皮疹、過敏反應、疲勞、腹痛、對象體內免疫應答的誘發、痘痕形成和/或所 述病毒在非腫瘤組織的積累顯著低於LIVP(具有SEQ ID N0 :10所示或者基本如SEQ ID NO :10所示基因組的病毒，典型為至少99%)或者GLV-lh68(具有SEQ ID NO :9所示或者 基本如SEQ ID N0 :9所示基因組的病毒，典型為至少99%)。積累可以通過任何合適方法 檢測，如對所述對象進行成像以檢測病毒積累，特別是在其中所述病毒表達可檢測蛋白質 或者誘導可檢測信號或其它這種標誌物的情況下。積累也可以通過對身體組織和/或體液 取樣進行檢測。在一些實例中，降低的毒性是指對象與施用了具有SEQ ID N0 :9所示核苷 酸序列的稱作GLV-lh68的病毒的對象相比經歷較低的毒性作用或者無毒性作用，其中稱 作GLV-lh68的病毒以與所述克隆毒株相似的量及在相同給藥方案下施用。在其它實例中， 降低的毒性是指對象不死於施用病毒的施用所誘導的毒性作用。
[0017] 在一些情況中，所述LIVP克隆毒株與參照LIVP毒株相比呈現出降低的毒性及較 高的抗腫瘤活性或者這些活性的組合，所述參照LIVP毒株如具有SEQ ID N0 :9所示基因 組的毒株，特別是稱作GLV-lh68的毒株，也稱作GL-0NC1。對於任何提供的呈現出較高的 抗腫瘤發生能力的LIVP克隆毒株，其抗腫瘤發生能力可以在施用對象時在體外或體內顯 示或評估。較高的抗腫瘤發生能力可以通過在體外或體內評估指示抗腫瘤發生能力的參數 而確定，所述參數選自如腫瘤細胞的感染性、病毒在腫瘤組織中的積累、病毒核酸複製、病 毒產生、病毒基因表達、對宿主細胞的影響、細胞毒性、腫瘤細胞選擇性、腫瘤細胞類型選擇 性、免疫原性以及在腫瘤細胞中的複製量。在一些實例中，較高的抗腫瘤發生能力是指，在 相同或相似條件下進行相同的體外或體內實驗，該實驗對指示抗腫瘤發生能力的參數（例 如在給定時間內改變腫瘤大小）進行評估，所述克隆毒株呈現出與具有SEQ ID NO :9所示 核苷酸序列的稱作GLV-lh68的病毒的抗腫瘤發生能力相比至少或大約至少110%、120%、 130 %U40 %U50 %U60 %U70 %U80 %U90 %,200 %,250 %,300 %A00 %>500 600 %、700 %、800 %或更高的抗腫瘤發生能力。
[0018] 與SEQ ID NO :10所示核苷酸序列中相應開放讀框（0RF)的核苷酸序列相比，本發 明提供的LIVP克隆毒株包括在0RF中具有一或多個核苷酸差異的任何毒株。其它的可以在 其它區域中有差異。例如，一或多個核苷酸差異是一或多個核苷酸缺失、取代或添加（即插 入），特別是改變編碼的蛋白質的序列的核苷酸改變。在另一實例中，所述差異是在0RF的 啟動子區域中缺失、取代或添加一或多個核苷酸。在進一步的實例中，與SEQ ID N0 :10所 示核苷酸序列中相應0RF不同的0RF編碼截短的蛋白質，失活蛋白質或者消除所述病毒產 生的該蛋白質。在任何上述實例中，所述差異可以是在選自名稱如下的0RF中：gl001/290、 gl009/283、gl010/282、gl011/280、gl015、gl032、gl034、gl035、gl037、gl069、gl077、 gl079、gl082、gl084、gl088、gl093、gl225、gl230、gl239、gl241、gl257、gl264、gl270、 gl273、gl274、gl277/105、gl280/010及gl283/009。可以存在多個差異。關於精確差異的 知識不是必需的，關鍵的是所述毒株是呈現出降低的毒性和/或抗腫瘤活性或者這二者的 組合，使得所述病毒作為腫瘤治療或診斷劑的性質優於GLV-lh68 (即由於所述性質之一明 顯改進或者由於這兩種性質組合相比於GLV-lh68的性質有所改良）。
[0019] 作為克隆毒株的實例，本發明提供LIVP克隆毒株，其含有SEQ ID N0 :1的 10, 073-180, 095 位核苷酸序列、SEQ ID N0 :2 的 11，243-182, 721 位核苷酸序列、SEQ ID NO :4 的 6, 264-181，390 位核苷酸序列、SEQ ID NO :5 的 7, 044-181，820 位核苷酸序列、SEQ ID NO :6的6, 674-181，409位核苷酸序列、SEQ ID NO :7的6, 716-181，367位核苷酸序列 或者SEQ ID N0 :8的6, 899-181，870位核苷酸序列。本發明還提供LIVP克隆毒株，其含 有與如下核苷酸序列具有至少大約或至少99%序列相同性的核苷酸序列：SEQ ID N0 :1的 10, 073-180, 095位核苷酸序列、SEQ ID N0 :2 的 11，243-182, 721 位核苷酸序列、SEQ ID N0: 4 的 6, 264-181，390 位核苷酸序列、SEQ ID NO :5 的 7, 044-181，820 位核苷酸序列、SEQ ID NO :6的6, 674-181，409位核苷酸序列、SEQ ID NO :7的6, 716-181,367位核苷酸序列或者 SEQ ID N0 :8 的 6, 899-181，870 位核苷酸序列。
[0020] 在其它實例中，本發明提供的LIVP克隆毒株含有包括左側和/或右側反向末端重 復的核苷酸序列。例如，本發明提供含有SEQ ID N0:l、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列的 LIVP克隆毒株。本發明還提供含有與SEQ ID N0:l、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列具有至 少99%序列相同性的核苷酸序列的LIVP克隆毒株。在LIVP克隆毒株中，本發明提供的是 含有SEQ ID N0 :1所示核苷酸序列或者與SEQ ID N0 :1所示核苷酸序列具有至少99%相 同性的核苷酸序列的LIVP克隆毒株。在其它實例中，在LIVP克隆毒株中，本發明提供的是 含有SEQ ID N0 :5所示核苷酸序列或者與SEQ ID N0 :5所示核苷酸序列具有至少99%序 列相同性的核苷酸序列的LIVP克隆毒株。在本發明提供的LIVP克隆毒株的任何實例中， 所述LIVP克隆毒株可以通過從細胞培養物中分離LIVP克隆而獲得，在所述細胞培養物中 繁殖了具有SEQ ID N0:l、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列或者具有與SEQ ID N0:l、2、4、 5、6、7或8所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列的毒株。
[0021] 本發明提供LIVP病毒製備物或者病毒，其含有本發明提供的上述任何LIVP克隆 毒株的基因組。
[0022] 本發明提供重組或修飾的LIVP病毒毒株，其含有上述任何LIVP克隆毒株的基 因組，上述LIVP克隆毒株被修飾為在基因組中還含有異源核酸，如編碼異源基因產物的 核酸。在一些實例中，所述異源核酸（如編碼異源基因產物的核酸）被插入或置換病毒 基因組中非必需基因或區域中。例如，編碼異源基因產物的核酸被插入在病毒基因組中 的血凝素（HA)、胸腺激酶（TK)、F14. 5L、痘苗病毒生長因子（VGF)、A35R、NIL、E2L/E3L、 K1L/K2L、過氧化物歧化酶基因座、7. 5K、C7-K1L、B13R+B14R、A26L或者I4L基因座。本發 明提供的病毒通過本領域技術人員已知的任何方法修飾和/或使用，如治療腫瘤，作為針 對來自插入基因組中的抗原的病原體的疫苗，用於診斷以及用於診斷和治療，所述方法包 括例如國際PCT申請No. W02009/054996、國際PCT申請No. W02009/139921、美國專利申 請 No. US-2009-0081639、US-2009-0053244、US-2009-0098529 和美國專利 No. 7, 754, 221、 7, 588, 767、7, 588, 771和7, 662, 398中所描述的修飾以及方法/用途。
[0023] 在本發明提供的重組或修飾的LIVP病毒毒株中，異源基因產物包括一或多種治 療和/或診斷的製劑或試劑。在一些實例中，所述異源基因產物是抗癌劑、抗轉移劑、抗血 管發生劑、免疫調節分子、抗原、細胞基質降解基因、組織再生及人類體細胞多能性重塑基 因、修飾底物以產生可檢測產物或信號或者通過抗體可檢測的酶、可結合造影劑的蛋白質、 光學成像或檢測的基因、PET成像的基因及MRI成像的基因。例如，抗轉移劑是抑制轉移 或者在體外細胞侵襲測定中抑制細胞侵襲的物質。在另一實例中，抗血管發生劑是抑制腫 瘤中血管形成的物質。在進一步的實例中，組織再生和人類體細胞多能性重塑基因是newt AG (nAG)、0ct4、NANOG、Ngn3、Pdxl 或 Mafa。
[0024] 在本發明提供的重組或修飾的LIVP病毒毒株的實例中，異源基因產物是選自如 下的一種治療劑：激素、生長因子、細胞因子、共刺激分子、核酶、轉運蛋白、單鏈抗體、反義 RNA、前體藥物轉化酶、siRNA、microRNA、毒素、抗腫瘤寡肽、有絲分裂抑制劑蛋白、抗有絲分 裂寡肽、抗癌多肽抗生素、血管發生抑制劑、腫瘤阻抑物、細胞毒性蛋白、細胞抑制蛋白和組 織因子。例如，所述異源基因產物是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)、單核細胞趨 化蛋白-1 (MCP-1)、白細胞介素-6 (IL-6)、白細胞介素-24(IL-24)、幹擾素-γ誘導的蛋白 質10(IP-10)、與HSV糖蛋白D競爭T-淋巴細胞上表達的受體HVEM的淋巴毒素誘導表達 物（LIGHT)、p60超抗原、OspF、OspG、信號轉導及轉錄激活蛋白（STATlalpha)、STATlbeta、 血纖蛋白溶酶原k5結構域（hK5)、色素上皮細胞-分化因子（PEDF)、單鏈抗-VEGF抗體、單 鏈抗-DLL4抗體、單鏈抗成纖維細胞激活蛋白（FAP)、匪23、鈣粘著蛋白1 (ECAD或cdhl)、 鬆弛肽1 (RLN1)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、紅細胞生成素（ΕΡ0)、microRNA126(miR-126)、 microRNA181、microRNA335、錳超氧化物歧化酶（MnSOD)、E3泛素蛋白連接酶l(HACEl)、 鈉尿肽前體蛋白A(nppal)、羧肽酶G2(CPG2)、醇脫氫酶（ADH)、CDC6、或者骨形態生成蛋白 4 (BMP4)。例如、單鏈抗-VEGF抗體稱作G6。
[0025] 在本發明的含有編碼診斷劑的異源基因產物的重組或修飾的LIVP毒株的實例 中，所述診斷劑是可檢測蛋白或者誘導可檢測信號的蛋白質。例如，所述診斷劑是螢光素 酶、螢光蛋白、生物發光蛋白、結合和/或轉運造影劑、生色團、可檢測的化合物或配體的受 體或轉運蛋白。在這樣的實例中，結合和/或轉運造影劑的受體或轉運蛋白是鐵受體、鐵轉 運蛋白、或者銅攝取轉運蛋白。在特定的實例中，所述診斷劑是綠色痛頭蟲（click beetle) 螢光素酶、lux操縱子、紅外線螢光蛋白、黃素還原酶蛋白、mNeptune遠紅光螢光蛋白、綠色 螢光蛋白（GFP)、紅色螢光蛋白（RFP)、腔腸素結合蛋白（CBP)、人腎上腺素受體（hNET)、碘 化鈉同向轉運（NIS)蛋白、細胞色素 p450家族酶、allostatin A受體（AlstR)、Pepl受體 (PEPR-1)、LAT-4、固醇14 α -去甲基化酶（Cyp51)，轉移受體（TR)、鐵蛋白、二價金屬轉運蛋 白（DMT)、趨磁性蛋白A(MagA)或者順鉬內流轉運蛋白（CTR1)。
[0026] 在本發明提供的重組或修飾的LIVP病毒毒株中，編碼異源基因產物的核酸與啟 動子可操縱地連接。例如，所述啟動子是哺乳動物啟動子，包括病毒啟動子。在一些實例 中，所述啟動子是 P7.5k、Pllk、PSE、PSEL、P SL、H5R、TK、P28、Cl 1R、G8R、F17R、I3L、I8R、AIL、A2L、 A3L、H1L、H3L、H5L、H6R、H8R、DIR、D4R、D5R、D9R、D11L、D12L、D13L、MIL、N2L、P4b 或者 K1 啟動子。
[0027] 本發明提供含有上述本發明提供的任何克隆毒株或病毒毒株的組合物。本發明 還提供含有上述本發明提供的任何克隆毒株或病毒毒株的藥物組合物。在其它實例中，本 發明提供的組合物或藥物組合物可含有一或多種不同的病毒毒株。在一些實例中，所述藥 物組合物含有藥物學可接受的載體。本發明提供的藥物組合物可以配製用於局部或全身施 用。在其它實例中，所述藥物組合物配製物用於抗病毒或抗癌疫苗或者抗癌治療施用。
[0028] 本發明提供含有本發明提供的任何克隆毒株或病毒毒株與治療劑或診斷劑的組 合。在一些實例中，所述治療劑選自化療劑、免疫抑制劑和抗病毒劑。例如，所述化療劑是 抗轉移劑或抗血管發生劑。在一些實例中，所述化療劑是細胞因子、趨化因子、生長因子、光 增敏劑、毒素、抗癌抗生素、化療化合物、放射性同位素、血管發生抑制劑、信號調節劑、抗代 謝物、抗癌疫苗或治療劑、抗癌寡肽、有絲分裂抑制劑蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌抗體、抗 癌抗生素、免疫治療劑或者前述任何化療劑的組合。在其它實例中，所述化療劑是順鉬、卡 鉬、吉西他濱、伊立替康、抗-EGFR抗體或者抗-VEGF抗體。在一些實例中，所述免疫抑制 劑是糖皮質激素、烷化劑、抗代謝物或抗體。在其它實例中，所述抗病毒劑是西多福韋、格列 衛、更昔洛韋、阿昔洛韋或ST-246。例如，所述抗病毒劑是化療劑。在本發明提供的藥劑組 合的任何實例中，所述病毒和化療劑和/或抗病毒劑配製為單一組合物或者分別配製為兩 或多個組合物。
[0029] 本發明提供試劑盒，其含有上述任何LIVP病毒毒株，上述任何組合物或藥物組合 物或者上述任何組合，以及選擇性包含所述組合物的施用說明書。
[0030] 本發明提供用於治療對象中增生性病症的方法、用途或組合物，所述治療通過施 用上述任何藥物組合物進行，例如含有本發明提供的任何克隆毒株或病毒毒株的上述任何 藥物組合物。所述增生性疾病可以是癌症。例如，所述癌症可以是乳腺癌、前列腺癌、卵巢 癌、肺癌、結腸癌或者胰腺癌。所述增生性病症可以是腫瘤或轉移。在本發明的方法中，所 述對象可以是人或者非人對象。
[0031] 在用於治療增生性病症的典型的方法、用途或組合物的實例中，所述病毒可以施 用或者配製為一個量施用，所述量為至少或者大約或者是1X 105pfu，在施用周期至少一 次。例如，施用的或者配製的病毒的量為至少或者至少大約或者是1X 105pfu、1X 106pfu、 1 X 107pfu、1 X 108pfu、1 X 109pfu、1 X 101Qpfu、1 X 10upfu、1 X 1012pfu、1 X 1013pfu 或 IX 1014pfu，施用至少一次或者在一個施用周期至少一次。例如，用於本發明的方法、用 途或組合物的配製物中的病毒毒株的濃度可以是1X10 6至lXl〇16pfu/ml，或者至少或 者大約或者是 lX106pfu/ml、lX107pfu/ml、lX108pfu/ml、lX10 9pfu/ml、lX10lclpfu/ ml、1 X 10npfu/ml、1 X 1012pfu/ml、1 X 1013pfu/ml、1 X 1014pfu/ml、1 X 1015pfu/ml 或者 IX 1016pfu/ml。在這樣的實例中，在施用周期中施用所述量的病毒2次，3次、4次、5次、6 次或7次。例如，所述量的病毒在施用周期第一天、周期的第一天和第二天、周期的連續前 三天的每一天、周期的連續前四天的每一天、周期的連續前五天的每一天、周期的連續前六 天的每一天或者周期的連續前七天的每一天施用。所述施用周期可以是7天、14天、21天 或者28天。
[0032] 在本發明的方法中，也可以施用治療增生性病症的第二種治療劑。其可以與所述 病毒單獨、相繼或相間施用。技術人員熟知治療增生性病症如癌症的各種治療劑。例如，在 本發明的方法中，對增生性病症的進一步治療包括但不限於手術、放射性治療、免疫抑制治 療或者施用抗癌劑。例如，抗癌劑包括細胞因子、趨化因子、生長因子、光增敏劑、毒素、抗癌 抗生素、化療化合物、放射性同位素、血管發生抑制劑、信號調節劑、抗代謝物、抗癌疫苗或 治療、抗癌寡肽、有絲分裂抑制劑蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌抗體、抗癌抗生素、免疫治療 劑或者前述任何物質的組合。所述抗癌劑可以是順鉬、卡鉬、吉西他濱、伊立替康、抗-EGFR 抗體或者抗-VEGF抗體。在這樣的實例中，所述病毒和抗癌劑是相繼、同時或者相間施用 的。
[0033] 在上述方法或使用中，包括但不限於用於治療增生性病症，所述病毒是在局部 (locally)、體表（topically)或全身性施用，包括靜脈內、動脈內、腫瘤內、經內窺鏡、病變 內（intralesionally)、肌肉注射、皮內、腹膜內、囊內（intravesicularly)、關節內、胸膜 內、經皮、皮下、口服、胃腸外、鼻內、氣管內、通過吸入、顱內、前列腺內、玻璃體內、體表、目艮 內、陰道或者直腸。例如，所述病毒是靜脈內或者腹膜內施用的。
[0034] 本發明提供檢測對象體內腫瘤或者轉移的方法，通過給對象施用本發明提供的任 何LIVP病毒或者克隆毒株或者含有本發明提供的任何LIVP病毒毒株或克隆毒株的組合 物或藥物組合物進行檢測。為了進行診斷或檢測，所述病毒含有編碼可檢測蛋白或者誘導 可檢測信號的蛋白質的核酸，檢測所述可檢測的蛋白或者誘導可檢測信號的蛋白質，通過 檢測表明對象體內腫瘤或轉移的存在情況。在本發明的檢測方法中，所述可檢測蛋白或者 誘導可檢測信號的蛋白質選自螢光素酶、螢光蛋白、生物發光蛋白、受體或轉運蛋白，所述 受體或轉運蛋白結合和/或轉運造影劑、生色團、可被檢測的化合物或配體。例如，所述可 檢測蛋白或者誘導可檢測信號的蛋白質是綠色螢光蛋白（GFP)、紅色螢光蛋白（RFP)、鐵受 體、鐵轉運蛋白、鈉或其它離子轉運蛋白如人腎上腺素受體（hNET)或者碘化鈉同向轉運蛋 白（NIS)。在本發明提供的檢測方法中，所述可檢測蛋白或可檢測信號是通過微光成像、熒 光光譜、X-光成像、磁共振成像（MRI)、磁共振光譜（MRS)、正電子成像術（PET)或者單光子 發射計算機斷層掃描（SPECT)。
[0035] 本發明提供檢測宿主體內病毒活性的方法，該方法通過給對象施用本發明提供的 任何LIVP病毒或克隆毒株進行。所述病毒含有編碼可檢測蛋白或者誘導可檢測信號的蛋 白質的核酸，檢測所述可檢測蛋白或者誘導可檢測信號的蛋白質，通過檢測表明所述病毒 是活化的或者具有溶瘤活性。在這樣的實例中，所述對象患有腫瘤或癌症。在所述方法的 實例中，檢測可檢測蛋白或者誘導可檢測信號的蛋白質的步驟是來自對象的體液樣品。例 如，所述體液是尿，血液，淚或者腦脊液。
[0036] 本發明提供含有本發明提供的任何LIVP病毒毒株或克隆毒株的宿主細胞。
[0037] 本發明提供一種選擇用於癌症治療和診斷的LIVP克隆毒株的方法，包括（i)提供 第一個LIVP病毒樣品，其含有具有不同基因組序列的病毒顆粒的混合物；（ii)從所述樣品 中選擇及分離單個克隆分離株；（iii)測定每個克隆分離株的毒性；（iv)測定每個克隆分 離株的抗腫瘤發生能力；及（v)選擇與參照LIVP病毒毒株相比呈現出更高抗腫瘤發生能 力和降低的毒性的克隆毒株，其中將呈現出降低的毒性和更高的抗腫瘤發生能力的克隆分 離株鑑定為用於癌症治療或診斷的LIVP克隆毒株。在選擇LIVP克隆毒株的方法中，參照 LIVP病毒可以是第一個LIVP病毒樣品。在一些實例中，參照LIVP病毒是減毒的重組LIVP 病毒。例如，參照LIVP病毒是稱作GLV-lh68的病毒，其基因組具有SEQ ID N0:9所示核苷 酸序列（GLV-lh68)。
[0038] 在選擇或鑑定本發明提供的LIVP克隆毒株的方法中，第一個LIVP病毒樣品可 以是LIVP病毒毒株或者任何其它本發明提供的其他毒株，所述LIVP病毒毒株具有SEQ ID N0:10所示基因組或者與SEQ ID N0:10至少99%相同的基因組。在其它實例中，第 一個LIVP病毒樣品是一種混合物，其通過繁殖用LIVP毒株及另一病毒毒株、基因組DNA 或克隆的DNA感染的細胞，隨後從培養物中分離病毒樣品而獲得，其中所述樣品包含通 過感染產生的後代病毒。例如，另一病毒毒株可以是DNA病毒、雙鏈RNA病毒、單鏈正義 (single-stranded positive sense) RNA病毒或者單鏈負義RNA病毒。所述DNA病毒可以 是痘病毒，如禽痘病毒、粘液瘤病毒或者痘苗病毒；皰疫病毒如單純皰疫病毒（HSV)、巨細 胞病毒（CMV)、Epstein_Barr病毒（EBV)、嗜肝DNA病毒（例如B型肝炎病毒）、多瘤病毒、乳 頭瘤病毒、腺病毒和腺相關病毒；或者單鏈DNA病毒，如細小病毒。例如，另一病毒毒株是痘 苗病毒毒株。在一些實例中，另一病毒是雙鏈RNA病毒，所述雙鏈RNA病毒是呼腸孤病毒如 輪狀病毒。在實例中，其中另一病毒是單鏈正義RNA病毒，所述單鏈正義RNA病毒是小RNA 病毒（picornoviruses)如Seneca valley病毒、柯薩奇病毒或脊髓灰質炎病毒、腸道病毒； 披膜病毒如西門利克森林病毒；以及逆轉錄病毒如人免疫缺陷病毒（HIV)、鼠 Maloney白血 病病毒（MMLV)或者慢病毒。在進一步的實例中，其中另一個病毒是單鏈負義RNA病毒，所 述單鏈負義RNA病毒是正粘病毒，如流感病毒；副粘病毒如新城疫病毒、麻疹病毒或腮腺炎 病毒；或者棒狀病毒如水泡性口炎病毒（VSV)。
[0039] 在本發明的選擇或鑑別克隆毒株的方法中，從樣品中選擇單個克隆分離株的步驟 可以通過噬斑測定進行。例如，選擇噬斑測定中最大的噬斑。在這樣的實例中，可以選擇最 大的 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 個噬斑，並分離為克隆分離 株，在所述方法的步驟（iii)和（iv)中測定每個噬斑的毒性和抗腫瘤發生能力。在其它實 例中，選擇的噬斑大於由LIVP病毒樣品產生的噬斑的平均大小。
[0040] 在本發明提供的選擇克隆毒株的方法的步驟iii)中，毒性是在將選擇的克隆分 離株施用於第一個對象及將參照病毒施用第二個對象時在體內評估的，其中第一個和第二 個對象是相同物種、大小和性別的，所述病毒是以相同或相似量在相同或相似給藥方案下 施用於每個對象的；在對象中評估及測量指示毒性的參數，作為毒性作用的指示。例如，指 示毒性的參數是對象的存活降低或變弱、體重降低、發熱、皮疹、過敏反應、疲勞、腹痛、對象 體內免疫應答誘導或者痘痕形成。在本發明的選擇克隆毒株的方法的步驟V)中，選擇呈現 出毒性降低的病毒包括：a)在第一個和第二個對象之間對比測量的指示毒性的參數，及b) 鑑定或選擇與參照病毒呈現的毒性作用相比呈現出毒性作用降低的克隆分離株。例如，呈 現出毒性降低的克隆分離株是第一個對象的體重不降低，或者與第二個對象對比第一個對 象的體重降低減少。在其它實例中，呈現出毒性降低的克隆分離株是第一個對象與第二個 對象相比在治療過程中的存活增加。在另外的實例中，選擇呈現出毒性降低的克隆分離株， 其在治療過程中不導致對象死亡。
[0041] 在本發明提供的選擇克隆病毒毒株的方法的步驟iv)中，選擇的克隆分離株和參 照病毒的抗腫瘤發生能力是在施用於對象時在體外或體內評估的；評估及測量指示抗腫瘤 發生能力的參數。例如，當施用以在體內評估其抗腫瘤發生能力時，將選擇的克隆分離株施 用於第一個對象，並將參照病毒施用於第二個對象，其中第一個和第二個對象是相同物種、 大小和性別，所述病毒以相同或相似量及在相同或相似給藥方案下施用於每個對象。指示 抗腫瘤發生能力的參數可包括腫瘤的感染性、病毒在腫瘤組織內的積累、腫瘤細胞內的病 毒核酸複製、腫瘤細胞內的病毒產生、腫瘤細胞內的病毒基因表達、腫瘤細胞的細胞毒性、 腫瘤細胞選擇性、腫瘤細胞類型選擇性、降低的腫瘤大小、增加的腫瘤體積、降低的腫瘤重 量或者特異性和非特異性抗腫瘤免疫應答的起始。在本發明提供的選擇克隆病毒毒株的方 法的步驟v)中，選擇呈現出更高抗腫瘤發生能力的病毒包括：c)對比由選擇的克隆分離株 及參照病毒呈現的指示抗腫瘤發生能力的參數；及d)鑑定或選擇與參照病毒呈現的抗腫 瘤發生能力相比呈現出更高抗腫瘤發生能力的克隆分離株。例如，更高的抗腫瘤發生能力 是指，在評估指示抗腫瘤發生能力的參數的體外或體內實驗中，在相同測定中並在相同或 相似條件下，所述克隆分離株與參照病毒的抗腫瘤發生能力相比呈現出至少或大約或大約 至少 120 %、130 %、140 %、150 %、160 %、170 %、180 %、190 %、200 %、250 %、300 %、400 %、 500 %、600 %、700 %、800 %或更高的抗腫瘤發生能力。
[0042] 在本發明的選擇克隆病毒毒株的方法中，施用於對象以在體內評估毒性或抗腫瘤 發生能力的步驟的對象是非人動物或者是人。在本發明的方法中，所述對象可具有腫瘤或 癌症。例如，所述腫瘤是乳腺腫瘤、前列腺腫瘤、卵巢腫瘤、肺腫瘤、結腸腫瘤或者胰腺腫瘤。 所述腫瘤可以是異種移植物、同種異體移植物或者自發/天然腫瘤。
[0043] 在本發明的選擇克隆病毒毒株的方法中，可以分析選擇的克隆毒株的基因組，以 評估序列的同源性，由此僅選擇具有同源基因組序列的那些分離株。例如，通過如測序、限 制性分析、PCR、Southern印跡或者蛋白質表達等方法分析基因組。
[0044] 本發明提供通過本發明的任何選擇克隆毒株的方法產生或選擇的克隆毒株。
[0045] 發明詳述
[0046] 大綱
[0047] A.定義
[0048] B.分離克隆痘苗病毒毒株的方法
[0049] 1.親代病毒製備物或混合物
[0050] 2.分離克隆毒株
[0051] 3.抗腫瘤發生
[0052] a.腫瘤相關複製指示物
[0053] b.細胞毒性
[0054] c.腫瘤生長
[0055] 4.毒性/安全性
[0056] 5.基因組分析
[0057] C.分離的克隆病毒毒株
[0058] 1. LIVP
[0059] 2. LIVP克隆毒株
[0060] 典型的LIVP克隆毒株
[0061] D. LIVP毒株的修飾
[0062] 1.異源核酸
[0063] 2.典型的修飾
[0064] a.診斷性基因產物
[0065] b.治療性基因產物
[0066] c.抗原
[0067] d.改變病毒的減毒的修飾
[0068] 3.異源基因表達的控制
[0069] 4.產生修飾的病毒的方法
[0070] E.病毒的繁殖和產生
[0071] 1.繁殖的宿主細胞
[0072] 2.濃度確定
[0073] 3.保藏方法
[0074] 4.病毒的製備
[0075] F.藥物組合物、組合和試劑盒
[0076] 1.藥物組合物
[0077] 2.宿主細胞
[0078] 3.組合
[0079] 4.試劑盒
[0080] G.治療、診斷和監測方法
[0081] 1.治療方法
[0082] 2.診斷和監測方法
[0083] 3.施用
[0084] a.施用所述病毒之前的步驟
[0085] b.施用模式
[0086] c.劑量和給藥方案
[0087] d.共同施用
[0088] i.施用多個病毒
[0089] ii.治療性化合物
[0090] iii.免疫治療和生物治療
[0091] e.對象狀態
[0092] 4.監測
[0093] a.監測病毒基因表達
[0094] b.監測腫瘤大小
[0095] c.監測抗體效價
[0096] d.監測一般健康狀況診斷
[0097] e.監測協同治療
[0098] H.實施例 [00"] A.定義
[0100] 除非特別指出，本發明所用的所有技術和學術用語均與本發明所屬領域技術人員 通常理解的含義相同。除非特別指出，在本申請書中提及的所有專利、專利申請、公開的申 請和出版物、網站及其他公開的材料均通過引用的方式以其全部內容併入本文。當本文術 語有多個定義時，本章節中的定義優先。當述及URL或其它這種標示符或地址時，應理解為 這種標示符可改變並且網際網路上的特定信息可以出現或消失，但是等價信息是已知的並且 可以容易獲得，例如通過搜索網際網路和/或合適資料庫。其引用表明這種信息的可獲得性 和公共傳播。
[0101] 如本文所用，病毒製備物研究所的李斯特毒株（LIVP)或者LIVP病毒毒株是指減 毒的李斯特毒株（ATCC Catalog No. VR-1549)，由俄羅斯莫斯科的病毒製備物研究所通過 適應小牛皮而產生（Al'tshtein et al. (1985) Dokl.Akad.Nauk USSR285 :696-699)。所述 LIVP毒株可例如得自俄羅斯莫斯科的病毒製備物研究所（見例如Kutinova et al. (1995) Vaccinel3 :487-493) ；the Microorganism Collection of FSRI SRC VB Vector(Kozlova et al· (2010)Environ. Sci.Technol. 44 :5121-5126);或者可以得自莫斯科伊萬諾夫斯基 病毒學研究所（C0355K0602;Agranovski et al· (2006)Atmospheric Environment 40: 3924-3929)。其也為本領域技術人員熟知，其是在USSR及亞洲和印度用於免疫接種的疫 苗毒株。所述毒株目前由研究人員使用並熟知（見例如Altshteyn et al. (1985)Dokl. Akad. Nauk USSR285 :696-699 ；Kutinova et al. (1994)Arch. Virol. 134：l-9 ；Kutinova et al. (1995)Vaccinel3 :487-493 ；Shchelkunov et al. (1993)Virus Research28 :273-283 ； Sroller et al. (1998)Archives Virologyl43 ： 1311-1320 ；Zinoviev et al. , (1994) Genel47 :209-214 ;and Chkheidze et al· (1993) FEBS336 :340-342)。在 LIVP 毒株中有一 種毒株，其含有具有SEQ ID NO :10所示核苷酸序列或者與SEQ ID NO :10所示核苷酸序列 至少或者至少大約99%相同的序列的基因組。LIVP病毒毒株涵蓋了通過在細胞系中重複 傳代繁殖LIVP獲得的任何病毒毒株或者病毒製備物。
[0102] 如本文所用，LIVP克隆毒株或LIVP克隆分離株是指源於通過噬斑分離或者繁殖 單個克隆的其它方法得到的LIVP病毒毒株的病毒，其具有序列同源的基因組。因此，LIVP 克隆毒株包括一種病毒，該病毒的基因組存在於從LIVP中繁殖的病毒製備物中。LIVP克 隆毒株不包括通過重組方式使用重組DNA方法遺傳工程化導入異源核酸的重組LIVP病毒。 特別地，LIVP克隆毒株的基因組不含有具有編碼異源蛋白質的開放讀框的異源核酸。例如， LIVP克隆毒株的基因組不含有具有編碼非病毒異源蛋白質的開放讀框的非病毒異源核酸。 然而，如本文所述，應理解為本發明提供的任何LIVP克隆毒株在其基因組中可以通過重組 方式修飾以產生重組病毒。例如，可以修飾LIVP克隆毒株以產生重組LIVP病毒，其含有具 有編碼異源蛋白質的開放讀框的插入的核苷酸。
[0103] 如本文所用，LIVP 1. 1. 1是具有SEQ ID N0 :1所示核苷酸序列的基因組或者具有 與SEQ ID N0 :1所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列的基因組的LIVP 克隆毒株。
[0104] 如本文所用，LIVP2. 1. 1是具有SEQ ID N0 :2所示核苷酸序列的基因組或者具有 與SEQ ID N0 :2所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列的基因組的LIVP 克隆毒株。
[0105] 如本文所用，LIVP4. 1. 1是具有SEQ ID N0 :4所示核苷酸序列的基因組或者具有 與SEQ ID N0 :4所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列的基因組的LIVP 克隆毒株。
[0106] 如本文所用，LIVP5. 1. 1是具有SEQ ID N0 :5所示核苷酸序列的基因組或者具有 與SEQ ID N0 :5所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列的基因組的LIVP 克隆毒株。
[0107] 如本文所用，LIVP6. 1. 1是具有SEQ ID N0 :6所示核苷酸序列的基因組或者具有 與SEQ ID N0 :6所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列的基因組的LIVP 克隆毒株。
[0108] 如本文所用，LIVP7. 1. 1是具有SEQ ID N0 :7所示核苷酸序列的基因組或者具有 與SEQ ID N0 :7所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列的基因組的LIVP 克隆毒株。
[0109] 如本文所用，LIVP8. 1. 1是具有SEQ ID N0 :8所示核苷酸序列的基因組或者具有 與SEQ ID N0 :8所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列的基因組的LIVP 克隆毒株。
[0110] 如本文所用，修飾的LIVP病毒毒株是指具有在LIVP中不含有的基因組的LIVP病 毒，而是通過修飾衍生自LIVP的毒株的基因組產生的病毒。典型地，所述病毒的基因組通 過核苷酸的取代（置換）、插入（添加）或者缺失（截短）進行修飾。修飾可以使用本領域 技術人員已知的任何方法進行，如遺傳工程和重組DNA方法。因此，修飾的病毒是其基因組 與親代病毒的基因組相比有改變的病毒。典型的修飾的病毒具有插入病毒基因組中的一或 多個異源核酸序列。典型地，異源核酸含有編碼異源蛋白質的開放讀框。例如，本發明的修 飾的病毒可含有基因表達盒形式的一或多個異源核酸序列以表達異源基因。
[0111] 如本文所用，"通過重組方法產生"或者"使用重組DNA方法的方法"或者其變化用 語是指使用公知的分子生物學方法以表達由克隆的DNA編碼的蛋白質。
[0112] 如本文所用，"基因表達盒"或者"表達盒"是一種核酸構建體，含有能引起基因在 與這種序列相容的宿主中表達的核酸元件。表達盒包括至少啟動子及可選地，轉錄終止信 號。典型地，表達盒包括與啟動子可操縱地連接的被轉錄的核酸。表達盒可含有編碼如治 療性基因廣物或者可檢測的蛋白質或者可選擇的標記基因的基因。
[0113] 如本文所用，LIVP GLV-lh68是一種LIVP病毒，其含有ruc-gfp (螢光素酶和綠色 螢光蛋白融合基因（見例如美國專利No. 5, 976, 796)，β -半乳糖苷酶（LacZ)和β -葡糖 苷酸酶（gusA)報導基因，分別插入在F14. 5L、J2R(胸苷激酶）和A56R(血凝素）基因座 中。GLV-lh68的基因組具有SEQIDN0:9所示核苷酸序列，或者與SEQIDN0:9所示核苷 酸序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列。
[0114] 如本文所用，病毒製備物，如LIVP病毒製備物，是指通過病毒毒株如LIVP病毒毒 株、LIVP克隆毒株或者修飾或重組的病毒毒株在體內或體外在培養系統中繁殖獲得的病毒 組合物。例如，LIVP病毒製備物是指通過在宿主細胞中繁殖病毒毒株獲得的病毒組合物，典 型是通過從培養系統中使用本領域已知的標準方法進行純化。病毒製備物通常由許多病毒 顆粒或毒粒組成。如果需要，樣品或製備物中病毒顆粒的數目可以使用噬斑實驗確定，該實 驗假定每個形成的噬斑代表一種感染性病毒顆粒，計算每單位體積的樣品噬斑形成單位的 數目（pfu/mL)。製備物中每個病毒顆粒或毒粒與其它病毒顆粒相比可具有相同的基因組序 列（即所述製備物的序列是同源的），或者可具有不同的基因組序列（即所述製備物的序列 是異源的）。本領域技術人員已知在不存在克隆分離的情況中，病毒基因組的異源性或多樣 性可隨著病毒的再生而發生，如通過在病毒毒株的天然選擇過程中發生的同源重組事件而 發生（Plotkin&Orenstein(eds) "Recombinant Vaccinia Virus Vaccines，'in Vaccines， 3rd edition (1999))。
[0115] 如本文所用，病毒混合物是一種病毒製備物，其含有基因組序列不同的許多病毒 顆粒。所述病毒混合物可以通過用兩或多個不同病毒毒株或者一個病毒毒株和基因組DNA 或克隆的DNA感染培養系統如宿主細胞，隨後對所得病毒進行繁殖和純化而獲得。對於本 發明而言，LIVP病毒製備物可包括通過繁殖用LIVP毒株及另一病毒、基因組DNA或克隆的 DNA感染細胞，及隨後從培養物中分離病毒製備物而獲得的病毒混合物，其中所述製備物含 有通過感染產生的後代病毒。例如，另一病毒毒株可以是痘病毒，如禽痘病毒，粘液瘤病毒 或其它痘苗病毒；皰疹病毒如單純皰疹病毒（HSV)、巨細胞病毒（CMV)、Epstein-Barr病毒 (EBV)、嗜肝DNA病毒（如B型肝炎病毒）、多瘤病毒、乳頭瘤病毒、腺病毒和腺相關病毒；以 及單鏈DNA病毒，如細小病毒。另一病毒可以是減毒的病毒、溶瘤病毒或者具有已知的抗腫 瘤活性和/或中等至輕度毒性的其它病毒。
[0116] 如本文所用，"病毒"是指離開宿主細胞不能生長或複製的任何一大群感染性實 體。病毒典型含有在遺傳物質RNA或DNA核心周圍的蛋白質外殼，但是沒有半透膜，僅能在 活細胞中生長和增殖。病毒包括但不限於痘病毒、皰疹病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒、 逆轉錄病毒、棒狀病毒、乳頭瘤病毒、水泡性口炎病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、小核糖核酸 病毒、辛德畢斯病毒、乳頭瘤病毒、細小病毒、呼腸孤病毒、柯薩基病毒、流感病毒、腮腺炎病 毒、脊髓灰質炎病毒、及西門利克森林病毒。
[0117] 如本文所用，溶瘤病毒是指在患有腫瘤的對象中在腫瘤細胞中選擇性複製的病 毒。一些溶瘤病毒在感染腫瘤細胞之後可殺死該腫瘤細胞。例如，溶瘤病毒可通過裂解腫 瘤細胞或者誘導腫瘤細胞死亡而導致腫瘤細胞死亡。
[0118] 如本文所用，參照LIVP病毒的"減毒的LIVP病毒"是指與LIVP相比呈現出降低 的或減少的毒力、毒性或者致病原性的病毒。
[0119] 如本文所用，病毒的"毒性"（在本文也稱作毒力或致病原性）是指在施用該病毒 時對宿主的有害或毒性作用。對於溶瘤病毒，如LIVP，病毒的毒性與其在非腫瘤器官或組織 中的積累相關，該積累可影響宿主的存活或者導致有害或毒性作用。毒性可以通過評估指 示毒性的一或多個參數進行測量。這些參數包括在非腫瘤組織中的積累及對於已經施用該 病毒的對象的存活或健康的影響，如對體重的影響。
[0120] 如本文所用，"指示毒性的參數"是指與其毒性、毒力或致病原性相關的由病毒介 導的性質。指示毒性的參數通常在施用對象時在體內評估。典型的指示毒性的參數包括但 不限於對象的存活降低，體重降低，發熱，皮疹，過敏反應，疲乏，腹痛，對象體內免疫應答的 誘導及痘痕形成。評估任何上述參數或本領域技術人員已知的其它毒性性質的測定或測量 法在本說明書中描述或者為本領域技術人員已知。因此，在宿主中介導任一或多種上述活 性或性質的病毒呈現出一定程度的毒性。
[0121] 如本文所用，"降低的毒性"是指在將病毒施用宿主時的毒性或有害作用與未用該 病毒處理的宿主相比或者與施用另一參照或對照病毒的宿主相比減弱或減少。對於本發明 的目的，典型的參照或對照病毒是稱作GLV-lh68的LIVP病毒。毒性是否降低或減少可以 通過評估病毒及如果需要也評估對照或參照病毒對於指示毒性的參數的作用而確定。應理 解為當對比兩或多個病毒的活性時，在體外測定中使用的或者在體內施用的病毒的量（例 如pfu)是相同或相似的，並且體外測定或體內評估的條件（例如體內給藥方案）是相同或 相似的。例如，當對比在體內施用病毒和對照或參照病毒的作用時，所述對象是相同物種、 大小、性別的，並且所述病毒是在相同或相似給藥方案下以相同或相似量施用的。特別地， 具有降低的毒性的病毒可意味著當將該病毒施用於宿主時，如治療疾病，該病毒在宿主的 非腫瘤器官和組織中不積累至導致損害或傷害宿主的程度，或者其使宿主的存活與對照或 參照病毒相比至更高程度。例如，具有降低的毒性的病毒包括在治療期間不導致對象死亡 的病毒。
[0122] 如本文所用，病毒在特定組織中的積累是指在將病毒施用於宿主足以感染宿主器 官或組織的一段時間之後，該病毒在宿主生物體的特定組織的分布。正如本領域技術人員 所知，病毒的感染時間根據病毒、器官或組織、宿主的免疫活性劑病毒的劑量而變化。通常 地，積累可以在病毒感染後少於1天、大約1天至大約2、3、4、5、6或7天，大約1周至大約 2、3或4周，大約1個月至大約2、3、4、5、6個月或更長時間的時間點確定。對於本發明，病 毒優先在宿主的免疫豁免的組織中積累，如炎症組織或腫瘤組織，但是從其它組織和器官 如非腫瘤組織中清除，該病毒的毒性是輕度或者可耐受程度，至多也不致命。
[0123] 如本文所用，"優先積累"是指病毒在第一個位置比在第二個位置以更高水平積累 (即在第一個位置病毒顆粒的濃度或效價高於在第二個位置病毒顆粒的濃度）。因此，相對 於正常組織或器官優先在免疫豁免組織（躲避免疫系統的組織）如炎症組織和腫瘤組織中 積累的病毒，是指與在正常組織或器官中的病毒積累相比，在免疫豁免組織如腫瘤中以更 高水平（即濃度或病毒效價）積累的病毒。
[0124] 如本文所用，"抗腫瘤活性"或者"抗腫瘤發生的"是指病毒毒株在對象中在體外或 體內阻止或抑制腫瘤形成或生長。抗腫瘤活性可以通過評估指示抗腫瘤活性的一或多個參 數而確定。
[0125] 如本文所用，"指示抗腫瘤活性或抗腫瘤發生活性的參數"是指由病毒介導的與抗 腫瘤活性相關的性質。指示抗腫瘤活性的參數可以在施用於對象時在體外或體內評估。典 型的指示抗腫瘤活性的參數包括但不限於腫瘤細胞的感染性，病毒在腫瘤組織中的積累， 腫瘤細胞中病毒核酸複製，腫瘤細胞中病毒產生，腫瘤細胞中病毒基因表達，腫瘤細胞的細 胞毒性，腫瘤細胞選擇性，腫瘤細胞類型選擇性，降低的腫瘤大小，增加的腫瘤體積，降低的 腫瘤重量及特異性和非特異性抗腫瘤免疫應答的起始。評估任何上述參數或其它抗腫瘤發 生性質的實驗是本領域技術人員已知的。本文描述了典型的典型的實驗。因此，呈現出任 一或多種上述活性或性質的病毒呈現出抗腫瘤活性。
[0126] 如本文所用，"更高的"或"改良的"抗腫瘤活性或抗腫瘤發生能力是指病毒毒株能 在體外或體內阻止或抑制對象中腫瘤的形成或生長至高於參照或對照病毒的程度或者高 於未用病毒處理的程度。對於本發明，典型的參照或對照病毒是稱作GLV-lh68的LIVP病 毒。抗腫瘤活性是否"更高"或"改良"可以通過評估病毒，如果需要也評估對照或參照病 毒對指示抗腫瘤活性的參數的作用而確定。應理解為當對比兩或多個不同病毒的活性時， 體外測定中使用的或者體內施用的病毒的量（如pfu)是相同或相似的，及在體外測定或體 內評估的條件（如體內給藥方案）是相同或相似的。
[0127] 如本文所用，異源核酸（也稱作外源核酸或外來核酸）是指不是由表達其的生 物體或病毒在體內正常產生的，或者由生物體或病毒在不同的基因座產生的核酸，或者該 核酸介導或編碼中介物，通過影響轉錄、翻譯或者其它可調生物化學過程而改變內源核酸 (如DNA)表達。因此，異源核酸通常對於其導入的病毒而言不是天然內源的。異源核酸可 以是指來自另一病毒的核酸分子，該病毒在相同生物體或另一生物體中，包括相同物種或 另一物種。然而，異源核酸可以是內源的，不過是在不同基因座中表達的或者其表達或序列 改變了的核酸（如質粒）。因此，異源核酸包括不與基因組中發現的對應的核酸分子（如 DNA)精確定向或定位存在的核酸分子。通常地，但是非必然，這種核酸編碼不是由所述病 毒正常產生的或者同樣不是其表達的病毒中的RNA和蛋白質。任何核酸（如DNA)在病毒 中表達，而本領域技術人員承認或認為該核酸相對於該病毒是異源、外源或外來的，則該核 酸在本文涵蓋在異源核酸範圍內。異源核酸的範例包括但不限於編碼外源肽/蛋白質的核 酸，該肽/蛋白包括診斷劑和/或治療劑。由異源核酸編碼的蛋白質可以在病毒內表達，分 泌或表達在已經導入異源核酸的病毒的表面上。
[0128] 如本文所用，含有異源核酸的病毒克隆毒株或病毒毒株製備物是指這樣的毒株， 其含有在親代克隆毒株中不存在的核酸。例如，其序列如SEQ ID N0 :10所示的病毒是克隆 毒株，但是稱作GLV-lh68的SEQ ID N0 :9所示的病毒含有異源核酸，如稱作RUC-GFP的插 入體。
[0129] 如本文所用，異源蛋白質或異源多肽（也稱作外源蛋白質、外源多肽、外來蛋白質 或外來多肽）是指不是由病毒正常產生的蛋白質。
[0130] 如本文所用，異源核酸與核苷酸序列的調節子和效應子如啟動子、增強子、轉錄和 反義終止位點及其它信號序列的可操縱連接，是指這種核酸（如DNA)與這種核苷酸序列之 間的關係。因此，可操縱地連接或操縱關聯是指核酸如DNA與核苷酸的調節或效應序列如 啟動子、增強子、轉錄和反義終止位點及其它信號序列的功能關係。例如，異源DNA與啟動 子的可操縱連接是指DNA與啟動子之間的物理關係，於是這個DNA的轉錄通過特異性識別、 結合及轉錄該DNA的RNA聚合酶從該啟動子起始。為了優化表達和/或轉錄，必須除去、添 加或改變克隆的5'非翻譯區，以消除額外的、潛在不合適的可變翻譯起始（即開始）密碼 子或者在轉錄或翻譯水平可幹擾或降低表達的其它序列。此外，共有的核糖體結合位點可 以直接地插入在起始密碼子的5'端，並且可以增強表達（見例如Kozak J. Biol. Chem. 266 : 19867-19870(1991)及 Shine and Delgarno, Nature254 (5495) :34-38(1975))。這種修飾 的可取性（或者需求）可以根據經驗確定。
[0131] 如本文所用，異源啟動子是指不是在野生型生物體或病毒中正常發現的或者與野 生型生物體或病毒相比在不同基因座的啟動子。異源啟動子通常對於其導入之中的病毒不 是內源的，而是得自另一病毒或者是合成製備的。異源啟動子可以是指來自相同生物體或 另一生物體、包括相同物種或另一物種的另一病毒的啟動子。然而，異源啟動子可以是內源 的，但是其序列有改變的或者在不同基因座（例如在基因組中不同位置或在質粒上）出現 的啟動子。因此，異源啟動子包括與基因組中發現的對應啟動子相比其精確方向或位置不 完全相冋的啟動子。
[0132] 合成的啟動子是異源啟動子，其具有非天然發現的核苷酸序列。合成的啟動子可 以是具有合成的序列或者衍生自天然啟動子或其一部分的序列的核酸分子。合成的啟動子 也可以是雜種啟動子，由衍生自不同的天然啟動子的不同元件組成。
[0133] 如本文所用，給藥方案是指如病毒或其它物質的施用量，以及在施用周期過程中 的施用頻率。所述給藥方案與治療的疾病或病症相關聯，因此是可變的。
[0134] 如本文所用，施用頻率是指在施用周期期間施用的物質的次數。例如，施用頻率可 以是天、周或月。例如，頻率可以是在施用期間施用一次，兩次，三次，四次，五次，六次或七 次。所述頻率可以是指在施用周期期間的連續天數。特定的頻率與治療的特定疾病或病症 相關。
[0135] 如本文所用，"施用周期"是指重複的施用病毒的給藥方案，其在連續的施用中重 復。例如，典型的施用周期是28天循環。
[0136] 如本文所用，治療患有病症、失調或疾病的對象是指改善或者另外有益地改變所 述病症、失調或疾病的症狀的任何方式。治療涵蓋本發明描述和提供的病毒的任何藥物學 應用。
[0137] 如本文所用，疾病或失調是指生物體中得自如感染或遺傳缺陷的病理學狀況，特 徵在於可鑑別的症狀。如本發明所述典型的疾病是腫瘤疾病，如癌症。
[0138] 如本文所用，腫瘤疾病是指包括癌症的任何病症，包括腫瘤發生、生長、轉移和進 展。
[0139] 如本文所用，癌症是以任何類型惡性腫瘤為原因或者特徵的疾病，包括轉移癌，淋 巴腫瘤和血癌。典型的癌症包括但不限於白血病，淋巴瘤，胰腺癌，肺癌，卵巢癌，乳腺癌， 子宮頸癌，膀胱癌，前列腺癌，膠質瘤，腺癌，肝癌和皮膚癌。在人體中的癌症例如包括膀胱 癌，乳腺癌，前列腺癌，基底細胞癌，膽管癌，膀胱癌，骨癌，腦癌和CNS癌（如膠質瘤），子宮 頸癌，絨毛膜癌結腸癌和直腸癌，結締組織癌，消化系統癌症；子宮內膜癌，食管癌；眼癌； 頭頸癌；胃癌；上皮內腫瘤；腎癌；喉癌；白血病；肺癌（如小細胞和非小細胞肺癌）；淋巴 瘤，包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤，成神經細胞瘤，口腔癌（如唇、舌、口和 咽）；卵巢癌；胰腺癌，眼癌；橫紋肌肉瘤；直腸癌，腎癌，呼吸系統癌；肉瘤，皮膚癌；胃癌， 睪丸癌，甲狀腺癌；子宮癌，泌尿系統癌，以及其它癌和肉瘤。通常在狗、貓及其它寵物中診 斷的癌症例如包括但不限於淋巴肉瘤，骨肉瘤，乳腺腫瘤，肥大細胞瘤，腦腫瘤，黑素瘤，腺 鱗癌，肺類癌，支氣管腺癌，細支氣管腺癌，纖維瘤，粘液軟骨瘤，肺肉瘤，神經肉瘤，骨瘤，乳 頭瘤，眼癌，Ewing' s肉瘤，Wiln^ s腫瘤，BurkitC s淋巴瘤，小神經膠質細胞瘤，成神 經細胞瘤，破骨細胞瘤，口腔瘤形成，纖維肉瘤，骨肉瘤和橫紋肌肉瘤，生殖器鱗狀細胞癌， 可傳染性性病瘤，睪丸腫瘤，精原細胞瘤，睪丸支持細胞瘤，血管外皮細胞瘤，組織細胞瘤， 綠色瘤（如粒細胞性肉瘤），角膜乳頭瘤，角膜鱗狀細胞癌，血管肉瘤，胸膜間皮瘤，基底細 胞瘤，胸腺瘤，胃腫瘤，腎上腺癌，口腔乳頭瘤病，血管內皮瘤和囊腺瘤，濾泡性淋巴瘤，腸道 淋巴肉瘤，纖維肉瘤和肺鱗狀細胞癌。典型的在嚙齒類動物如雪貂中診斷的癌症包括但不 限於胰島瘤，淋巴瘤，肉瘤，神經瘤，胰島細胞腫瘤，胃MALT淋巴瘤及胃腺癌。典型的影響農 業牲畜的瘤形成包括但不限於白血病，血管外皮細胞瘤和牛眼瘤形成（在牛中）；包皮纖維 肉瘤，潰瘍性鱗狀細胞癌，包皮癌，結締組織瘤形成和肥大細胞瘤（在馬中）；肝細胞性肝癌 (在豬中）；淋巴瘤和肺腺瘤病（在綿羊中）；肺肉瘤，淋巴瘤，Rous肉瘤，網狀內皮組織增殖 症，纖維肉瘤，腎母細胞瘤，B細胞淋巴瘤和類淋巴白血病（在禽類中）；眼癌，肝臟瘤形成， 淋巴肉瘤（成淋巴細胞性淋巴瘤），漿細胞樣白血病和魚鰾肉瘤（在魚中），乾酪樣淋巴結 炎（CLA):由假結核棒狀桿菌（Corynebacterium pseudotuberculosis)細菌導致的綿羊和 山羊的慢性，傳染性，接觸性疾病，及由南非羊肺炎導致的綿羊的傳染性肺部腫瘤。
[0140] 如本文所用，"轉移"是指癌症從身體的一部分至另一部分的傳播。例如，在轉移的 過程中，惡性細胞可以在惡性細胞從中出現的原發腫瘤部位傳播，移動至淋巴管和血管中， 其將細胞轉運至生物體內的正常組織，在此所述細胞繼續增殖。由已經轉移傳播的細胞形 成的腫瘤稱作"轉移瘤"、"繼發腫瘤"或者"轉移"。
[0141] 如本文所用，對患有腫瘤疾病、包括腫瘤或轉移瘤的對象的治療，是指其中腫瘤病 的症狀得以減輕或另外有益地改變的任何治療方式。典型地，對象中腫瘤或轉移瘤的治療 涵蓋了導致如下改變的任何治療方式：腫瘤生長減緩、腫瘤細胞裂解、腫瘤大小降低、預防 新腫瘤生長、或者預防原發轉移，包括已知腫瘤血管化、腫瘤細胞分化、腫瘤細胞遷移或者 基底I吳或胞外基質降解。
[0142] 如本文所用，特定病症的改善或減輕，如通過施用特定的藥物，是指任何減輕，無 論永久還是暫時的，持久還是短暫的，其可歸因於或者與所述組合物的施用相關。
[0143] 如本文所用，病毒或化合物治療特定疾病的有效量或者治療有效量是改善或者以 某些方式減輕與該疾病相關症狀的量。所述有效量根據個體不同而變化，依賴於許多因素， 包括但不限於年齡、體重、患者的整體身體狀況以及疾病的嚴重度。治療有效量可以作為單 一劑量施用，或者可以根據給藥方案以多劑量施用，所述劑量是有效的。所述劑量可以治癒 疾病，但是典型是為了改善疾病的症狀而施用的。可需要重複施用以實現希望的症狀減輕。
[0144] 如本文所用，治療腫瘤病、包括腫瘤或轉移瘤的病毒或化合物的有效量或者治療 有效量是改善或者以某些方式減輕與腫瘤病相關症狀的量，包括但不限於減緩腫瘤生長， 腫瘤細胞裂解，腫瘤大小降低，預防新腫瘤生長，或者預防原發腫瘤的轉移。
[0145] 如本文所用，關於腫瘤治療的"治療指數"是指治療的能力，包括用本發明提供的 病毒治療或者與本發明提供的病毒的組合治療，以導致腫瘤生長減慢和/或腫瘤體積降 低。典型地，治療指數以與對照治療如未用病毒治療的比率表示。治療指數越高，表示減慢 腫瘤生長和/或降低腫瘤體積的治療更有效。
[0146] 如本文所用，"延遲的複製"是指治療性病毒在腫瘤中不能有效複製。呈現出延遲 複製的治療性病毒可具有在腫瘤細胞中複製的能力，但是以較慢的複製速度複製。在感染 腫瘤之後在腫瘤中呈現出延遲複製的病毒與未呈現出延遲複製的病毒的治療效力不一樣。
[0147] 如本文所用，術語"治療性病毒"是指用於治療疾病或病症如腫瘤病如癌症、腫瘤 和/或轉移瘤或者炎症或者創傷或者用於診斷或者用於治療和診斷這二者而施用的病毒。 通常地，本發明的治療性病毒是呈現出抗腫瘤活性和最小毒性的病毒。
[0148] 如本文所用，腫瘤（tumor)，也稱作瘤（neoplasm)，是當細胞以異常高速度增殖時 產生的一種異常組織團塊。腫瘤可示出部分或全部缺失正常組織的結構組構及與功能協 調。腫瘤可以是良性（非癌性）或者惡性的（癌性）。如本文所用，腫瘤是指涵蓋了造血組 織腫瘤以及實體腫瘤。
[0149] 惡性腫瘤可以大體分為三種主要類型。癌瘤是從上皮結構（如乳腺、前列腺、肺、 結腸、胰腺）中產生的惡性腫瘤。肉瘤是源自結締組織或者間充質細胞如肌肉、軟骨、脂肪 或骨的惡性腫瘤。白血病和淋巴瘤是影響造血組織（關於血細胞形成的結構）包括免疫系 統成分的惡性腫瘤。其它惡性腫瘤包括但不限於神經系統腫瘤（例如纖維神經瘤），生殖細 胞腫瘤，及母細胞（blastic)腫瘤。
[0150] 如本文所用，增生性病症包括涉及細胞異常增殖的任何病症（即與正常組織生長 相比細胞增殖更快速），例如但不限於腫瘤疾病。
[0151] 如本文所用，"腫瘤細胞"是腫瘤細一部分的任何細胞。典型地，本發明提供的病毒 優先感染對象中的腫瘤細胞而非正常細胞。
[0152] 如本文所用，"轉移細胞"是具有轉移潛力的細胞。轉移細胞具有從對象的第一個 轉移的能力及可以在不同部位植入組織，在此部位形成第二個腫瘤。
[0153] 如本文所用，"腫瘤發生細胞"是當導入對象的合適部位中時可以形成腫瘤的細 胞。所述細胞可以是非轉移或轉移的。
[0154] 如本文所用，"正常細胞"是非衍生自腫瘤的細胞。
[0155] 如本文所用，術語"細胞"是指活的生物體的結構和功能的基本單位，與生物科學 中的通常理解相同。細胞可以是單細胞生物，其是自足的及可以獨立於其它細胞的功能整 體而存在。細胞也可以是當未分離自其天然存在的環境中時，是由一種以上類型細胞組成 的多細胞生物體的一部分。這種細胞，可被認為是"非生物體"或"非生物"細胞，通常是專 門化的，其僅履行多細胞生物作為整體所履行的功能的亞集合。因此，這種類型的細胞不是 單細胞生物。這種細胞可以是原核細胞或真核細胞，包括動物細胞，如哺乳動物細胞，人細 胞和非人動物細胞或者非人哺乳動物細胞。動物細胞可包括可在動物中發現的任何動物來 源細胞。因此，動物細胞包括如組成動物的各種器官、組織和系統的細胞。
[0156] 如本文所用，"分離的細胞"是在體外存在的細胞，與其最初衍生自之中的生物體 分離。
[0157] 如本文所用，"細胞系"是衍生自在體外能穩定生長許多世代的原代細胞的一群細 胞。細胞系通常被稱作"永生化"細胞系以描述其在體外持續增殖的能力。
[0158] 如本文所用，"腫瘤細胞系"是最初衍生自腫瘤的一群細胞。這種細胞典型已經經 歷了在體內的一些改變，由此其理論上在培養中具有無限生長能力；與原代細胞不同，其僅 可以培養有限的一段時間。此外，這種細胞在被注射進易感動物體內之後優選可以形成腫 瘤。
[0159] 如本文所用，"原代細胞"是已經分離自對象的細胞。
[0160] 如本文所用，"宿主細胞"或"靶細胞"可互換使用，是指可以由病毒感染的細胞。
[0161] 如本文所用，術語"組織"是指通常起作用以在生物體內進行特定功能的相似細胞 的組合、集合或聚集體。
[0162] 如本文所用，術語免疫豁免的細胞和免疫豁免的組織是指這樣的細胞和組織，如 實體腫瘤，其從免疫系統中逃脫。通常地，將病毒施用對象激發從該對象清除病毒的免疫應 答。然而，免疫豁免的部位是免疫應答屏蔽或逃脫的，使得病毒存活及通常進行複製。免疫 豁免的組織包括增殖中的組織，如腫瘤組織。
[0163] 如本文所用，治療劑是改善疾病或病症的症狀或改善疾病或病症的物質。治療劑、 治療性化合物或者治療方案包括常規的藥物和藥物療法，包括進行治療或預防的疫苗（即 降低獲得特定疾病或病症的危險），這些物質為本領域技術人員已知的且在本文中也有描 述。治療腫瘤病的治療劑包括但不限於抑制細胞生長或促進細胞死亡的成分，其可以被激 活以抑制細胞生長或促進細胞死亡，或者激活另一製劑以抑制細胞生長或促進細胞死亡。 用於本發明提供的方法中的治療劑可以是例如抗癌劑。典型的治療劑包括例如治療性微 生物，如治療性病毒和細菌、細胞因子、生長因子、光增敏劑、放射性同位素、毒素、抗轉移劑 物、信號調節物、抗癌抗生素、抗癌性抗體、血管發生抑制劑、放射性治療、化療化合物或者 其組合。
[0164] 如本文所用，抗癌劑或化合物（可與"抗腫瘤或抗瘤劑"互換使用）是指用於抗癌 治療的任何物質或化合物。這些物質包括當單獨使用或者與其它化合物或治療組合使用時 可減輕、降低、改善、預防或者穩定或維持臨床症狀或者與腫瘤病、腫瘤和癌症相關的診斷 標記的緩和狀態，並可用於本發明提供的方法、組合和組合物中。抗癌劑包括抗轉移劑。典 型的抗癌劑包括但不限於化療化合物（如毒素、烷化劑、亞硝基脲、抗癌抗生素、抗轉移制 齊IJ、抗有絲分裂劑、局部異構酶抑制劑）、細胞因子、生長因子、激素、光增敏劑、放射性同位 素、信號調節物、抗癌抗體、抗癌寡肽、抗癌寡核苷酸（如反義RNA和siRNA)、血管發生抑制 齊U、放射性治療或者其組合。典型的化療化合物包括但不限於Ara-C、順鉬、卡鉬、紫杉醇、阿 黴素、吉西他濱、喜樹鹼、伊立替康、環磷醯胺、6-巰基嘌呤、長春新鹼、5-氟尿嘧啶及氨甲 喋呤。如本文所用，除非特別指出，提及的抗癌或化療劑包括多種抗癌或化療劑的組合。
[0165] 如本文所用，"化療敏化劑"是調節、減弱、逆轉或者影響細胞或生物體對指定化療 藥物或化合物的抗性的物質。術語"調節物"、"調節劑"、"減毒物"、"減毒劑"或者"化療增 敏劑"可互換使用，是指"化療敏化劑"。在一些實例中，化療敏化劑也可以是化療劑。典 型的化療敏化劑包括但不限於放射，鈣通道阻斷劑（如異搏定），鈣調蛋白抑制劑（如三氟 批啦嗪（trifluoperazine))，卩引哚生物鹼（如利血平），喹啉（如奎寧），親溶酶體劑（如 氯喹），類固醇（如孕酮），三苯乙醇類似物（如三苯氧胺），洗漆劑（如Cremophor EL)， texaphyrins，及環形抗生素（如環孢菌素）。
[0166] 如本文所用，在腫瘤或其它免疫豁免部位產生的化合物是指在腫瘤或腫瘤環境中 由於導入的病毒、通常是表達一或多個基因產物的重組病毒的存在而產生的任何化合物。 例如，在腫瘤中產生的化合物可例如是由重組多肽產生的編碼的多肽或RNA，代謝物，或者 由重組多肽及腫瘤或免疫豁免的組織或細胞的細胞機構產生的化合物。
[0167] 如本文所用，對象包括任何生物體，包括考慮對其進行診斷、篩選、監測或治療的 動物。動物包括哺乳動物如靈長類動物和馴化動物。典型的靈長類動物是人。患者是指患 有疾病或者其疾病待確定或者經確定處於疾病危險中的對象，如哺乳動物、靈長類動物、人 或家畜對象。
[0168] 如本文所用，施用的輸送載體是指基於脂質的或者其它基於聚合物的組合物，如 脂質體、膠團（micelle)或反膠團，其與如本發明提供的病毒等製劑結合，輸送至宿主對象 體內。
[0169] 如本文所用，載體（或者質粒）是指核酸構建體，其含有用於將異源核酸導入細胞 中以表達所述核酸或核酸複製的分立的元件。所述載體典型保持附加型，但是可以設計為 實現基因或其一部分穩定整合進基因組染色體中。這種載體的選擇和使用為本領域技術人 員熟知。表達載體包括能表達與調節序列可操縱地連接的DNA的載體，如啟動子區域，其能 實現所述DNA片段的表達。因此，表達載體是指重組DNA或RNA構建體，如質粒、噬菌體、重 組病毒或其它載體，在導入合適的宿主細胞中時使得克隆的DNA表達。合適的表達載體為 本領域技術人員熟知，包括在真核細胞和/或原核細胞中可複製的那些載體，及保持附加 型的那些載體，或者整合進宿主細胞基因組中的那些載體。
[0170] 如本文所用，術語"病毒載體"根據其在本領域公認的含義使用。其是指核酸載 體，包括至少一個病毒源元件，並可以包裝進病毒載體顆粒中。所述病毒載體顆粒可用於將 DNA、RNA或者其它核酸轉移至在體外或體內的細胞中。病毒載體包括但不限於痘病毒載體 (如痘苗病毒載體）、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、皰疹病毒載體（如HSV)、杆狀病毒載體、 巨細胞病毒（CMV)載體、乳頭瘤病毒載體、猿猴病毒（SV40)載體、西門利克森林病毒載體、 噬菌體載體、腺病毒載體及腺相關病毒（AAV)載體。
[0171] 如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其類似物，包括肽核酸（PNA)及其混合物。核 酸可以是單鏈或雙鏈的。核酸可編碼基因產物，如多肽、調節RNA、microRNA、siRNA和功能 RNA。
[0172] 如本文所用，在提及反義寡核苷酸時，與RNA的至少一部分互補的序列是指具有 足夠互補性的能與所述RNA雜交、通常在中等或高嚴格條件下雜交形成穩定雙鏈體的核苷 酸序列；在雙鏈反義核酸的情況中，可因此測定雙鏈DNA(即dsRNA)的單一鏈，或者可以測 定三鏈體形成。雜交的能力依賴於互補程度及反義核酸的長度。通常地，雜交核酸越長，與 其可含有的編碼RNA的鹼基錯配越多，仍形成穩定的雙鏈體（或者三鏈體，根據具體情況而 定）。本領域技術人員可以確定錯配的可耐受程度，通過使用標準程序確定雜交的複合物的 解鏈點而確定。
[0173] 如本文所用，可檢測的標記或者可檢測的組分或者診斷組分（也稱作成像標記、 成像劑或者成像組分）是指一種原子、分子或者組合物，其中所述原子、分子或組合物的存 在可以直接或間接測量到。可檢測標記可用於使本發明提供的任一或多個病毒成像。可檢 測標記可用於本發明提供的任何方法中。可檢測標記包括例如化學發光組分，生物光組分， 螢光組分，放射性同位素和金屬。檢測標記的方法為本領域熟知。這種標記可以例如通過 目測、螢光光譜、反射測量、流式細胞計量術、X-射線、各種磁共振方法如磁共振成像（MRI) 和磁共振波譜（MRS)檢測。檢測方法也包括任何多種的斷層X光攝影方法包括計算機斷 層掃描（CT)，軸向計算層析成象技術（CAT)，電子束計算機體層攝影（EBCT)，高解析度計算 機斷層掃描（HRCT),內擺線斷層X射線照相術（hypocycloidal tomography)、正電子成像 術（PET)、單一光子發射計算機斷層X射線照相術（SPECT)、螺旋計算機斷層X射線照相術 和超聲斷層X射線照相術。可檢測標記的直接檢測是指例如可檢測標記自身的物理現象的 測量，如所述標記自身的能量或離子發射或吸收，例如通過X-射線或MRI測量。間接檢測 是指測量原子、分子或組合物直接或間接結合可檢測標記的物理現象，如直接或間接結合 可檢測標記的原子、分子或組合物的能量和離子發射或吸收。在間接檢測的非限制性實例 中，可檢測標記可以是生物素，其可以通過與抗生物素蛋白的結合進行檢測。非標記的抗生 物素蛋白可以全身性施用以阻斷非特異性結合，隨後全身性施用標記的抗生物素蛋白。因 此，可檢測標記或可檢測組分的範圍包括可結合的標記或者可結合的組分，其是指原子、分 子或組合物，其中所述原子、分子或組合物的存在可以根據所述標記或組分結合另一原子、 分子或組合物的結果進行檢測。典型的可檢測標記包括例如金屬如膠態金，鐵，釓和鎵-67， 螢光組分，及放射性同位素。典型的螢光組分和放射性同位素在本文別處提供。
[0174] 如本文所用，放射性核素、放射性同位元素或者放射性同位素可互換使用，是指具 有不穩定核的原子。所述核特徵在於可用於傳遞給核內新產生的放射粒子或者傳遞給原 子電子的過量的能量。所述放射性同位素在這個過程中經歷放射活性衰退，並發射Y射 線和/或亞原子粒子。這種發射可以在體內檢測，通過例如但不限於正電子成像術（PET)， 單光子發射計算機斷層掃描（SPECT)或者平面γ射線成像等方法進行。放射性同位素可 以天然存在，但是也可以是人工產生的。用於體內成像的典型的放射性同位素包括但不限 於 nC，13C，13N，15N，150, 18F，19F，32P，52Fe，51Cr， 55Co, 55Fe，57Co, 58Co, 57Ni，59Fe6°Co, 64Gu，67G^^ 188Re，192Ir，198AU，211At， 212Bi，213Bi和241Am。放射性同位素可以摻入或者附著於化合物，如代 謝化合物。可以摻入或者與代謝化合物如核苷類似物連接的典型的放射性同位素包括但不 限於231，1241， 1251，1311，18F，19F，nC， 13C，14C，75Br，76Br和3H。典型的放射標記的化合物包括核苷 類似物，例如但不限於放射標記形式的1-(2'-脫氧-2'-氟-β-D-阿糖呋喃基）-5-碘 尿嘧啶（FIAU)，l-(2'-脫氧-2'-氟-β-D-阿糖呋喃基）-5-乙基尿嘧啶（FEAU)， 1_(2'-脫氧-2'-氟-β-D-阿糖呋喃基）-5-甲基尿嘧啶（FMAU)，3'-脫氧-3'-氟代 胸苷（FLT)，9-[4'-氟-3'-(羥基甲基）丁基]鳥嘌呤（FHBG)和9-[(3'-氟-1'-羥 基-2'-丙氧基）甲基]鳥嘌呤（FHPG)，例如[ 1251]-1-(2'-脫氧-2'-氟-β-D-阿 糖呋喃基）-5_碘尿嘧啶（[125I]_FIAU)，[ 1241]-1-(2'-脫氧-2'-氟-β-D-阿糖呋喃 基）-5-碘尿嘧啶（[124I] -FIAU)，[18F] -1- (2'-脫氧-2'-氟-β -D-阿糖呋喃基）-5-碘 尿嘧啶（[18F]_FIAU)，[18F]-l-(2'-脫氧-2'-氟-β-D-阿糖呋喃基）-5-乙基尿嘧 啶（[ 18F]-FEAU)，[18F]-l-(2'-脫氧-2'-氟-β-D-阿糖呋喃基）-5-甲基尿嘧啶 ([ 18F] -FMAU)，[18F] -3'-脫氧-3'-氟代胸苷（[18F] -FLT)，[18F] -9- [4'-氟-3'-(羥 基甲基）丁基]鳥嘌呤（[18F]-FHBG)及[18F]-9-[(3'-氟-1'-羥基-2'-丙氧基）甲 基]鳥嘌呤（[ 18f]-fhpg)。
[0175] 如本文所用，磁共振成像（MRI)是指使用核磁共振光譜儀在固體、特別是在人細 胞、組織和器官中產生特異原子和分子結構的電子圖像。MRI是一種非侵入性診斷技術，其 使用核磁共振產生器官及其它身體內部結構的橫切面圖像。所述對象躺在含有強電磁鐵的 大的空心圓筒內部，這樣導致身體中某些原子的核（如 1H、13C和19F)磁性排列。然後施予所 述對象無線電波，這導致排成一列的核跳躍；當收回無線電波時，所述核恢復其原始位置， 發射的無線電波然後通過接受儀檢測，並由計算機翻譯成二維圖片。對於一些MRI程序，使 用造影劑如釓以增加成像的精確性。
[0176] 如本文所用，X-射線是指許多高能的光子，或者一束這樣的光子，其波長為大約 0. 01-10納米。X-射線也是指用X-射線拍攝的照片。
[0177] 如本文所用，與一種組分綴合的化合物稱作複合物，其包括與組分結合的化合物， 其中所述化合物與組分之間的結合可以產生自一或多個共價鍵或者非共價相互作用如氫 鍵，或者靜電相互作用。綴合物也可包含連接化合物與組分的接頭。典型的化合物包括但 不限於納米粒子和含鐵細胞。典型的組分包括但不限於可檢測的組分和治療劑。
[0178] 如本文所用，發光是指可檢測的電磁（EM)射線，一般是當釋能的化學過程的激發 態產物伴隨光發射而恢復其基態時產生的紫外線（UV)、紅外線（IR)或可見的EM射線。化 學發光是得自化學反應的發光。生物發光是得自使用生物分子（或者其合成形式或類似 物）作為底物和/或酶的化學反應的化學發光。螢光是其中在光或其它形式射線刺激或激 發下從一種物質中發射的可見光，如紫外線（UV)、紅外線（IR)或可見的EM射線。
[0179] 如本文所用，化學發光是指一種化學反應，其中能量被特異性導向分子，導致其變 為電子激發態並隨後釋放光子，從而發出可見光。溫度對這種能量導向無作用。因此，化學 發光包含化學能直接轉變為光能。
[0180] 如本文所用，生物發光是化學發光的一種類型，是指由生物分子特別是蛋白質發 射光。生物發光的基本條件是分子氧，其在存在加氧酶（一種螢光素酶）的情況下是結合 的或游離的，所述螢光素酶作用於底物-螢光素。生物發光是由酶或是一種加氧酶的其他 蛋白質（螢光素酶）產生的，所述加氧酶在存在分子氧的情況中作用於底物螢光素（一種 生物發光底物），並將底物轉化為激發態，當恢復至較低能量水平時以光的形式釋放能量。
[0181] 如本文所用，產生生物發光的底物和酶一般分別是指螢光素和螢光素酶。當對於 特殊物種提及時，為清楚起見，每個專業術語與其衍生自其中的生物的名稱一起使用，例如 痛頭蟲螢光素酶或螢火蟲螢光素酶。
[0182] 如本文所用，螢光素酶是指催化發光反應的加氧酶。例如，細菌螢光素酶催化黃 素單核苷酸（FMN)和脂族醛的氧化，這個反應產生光。在海洋節肢動物中發現的另一類螢 光素酶催化海螢（Cypridina)(Vargula)螢光素的氧化，另一類螢光素酶催化鞘翅目昆蟲 (Coleoptera)螢光素的氧化。因此，螢光素酶是指催化生物發光反應（產生生物發光的反 應）的一種酶或發光蛋白。螢光素酶如螢火蟲和角尖水蚤（Gaussia)及海腎（Renilla)螢 光素酶是在產生生物發光反應期間起催化作用並且無變化的酶。螢光素酶發光蛋白如螢光 素非共價結合的水母發光蛋白在產生生物發光反應期間被改變，如通過螢光素的釋放而改 變。螢光素酶是一種在生物體中天然存在的蛋白質或蛋白質混合物（如細菌螢光素酶）或 其變體或突變體，所述變體或突變體例如是通過誘變產生的具有一或多種與天然存在的蛋 白質不同的性質如熱穩定性的變體。螢光素酶及其修飾的突變體或變體形式為本領域所熟 知。對於本發明的目的，提及的螢光素酶是指發光蛋白或螢光素酶。
[0183] 例如海腎（Renilla)螢光素酶是指分離自海腎屬成員的一種酶或者得自任何其 他來源如另一種相關橈足類動物或者合成製備的一種等價分子。其涵蓋具有保守胺基酸取 代而基本不改變活性的海腎螢光素酶。本領域技術人員已知合適的保守胺基酸取代，通常 不改變所得分子的生物學活性而產生。本領域技術人員意識到通常在多肽的非必需區域中 的單胺基酸取代基本不改變生物學活性（見例如Watsonet al. Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987, TheBenjamin/Cummings Pub. co. , p.224)〇
[0184] 如本文所用，生物發光底物是指在存在螢光素酶及任何必需的激活物的情況中被 氧化並產生光的化合物。這些底物在本文中是指例如螢光素，是在生物發光反應中經歷 氧化的底物。這些生物發光底物包括任何螢光素或其類似物或者螢光素酶與之相互作用 產生光的任何合成的化合物。典型的底物包括在產生光的反應中在存在螢光素酶或蛋白 質的情況中被氧化的那些底物。生物發光底物因此包括本領域公認為螢光素的那些化合 物。螢光素例如包括螢火蟲螢光素、海螢（Cypridina,也稱作Vargula)螢光素（腔腸素 (coelenterazine))、細菌螢光素，以及這些底物的合成類似物或者在產生生物發光的反應 中在存在螢光素酶的情況中被氧化的其他化合物。
[0185] 如本文所用，能轉變為生物發光底物是指易受化學反應如氧化或還原反應影響， 由此產生生物發光底物。例如，生物發光細菌的發光反應包含黃素單核苷酸基團（FMN)通 過黃素還原酶還原為還原的黃素單核苷酸（FMNH 2)的反應。還原的黃素單核苷酸（底物） 然後與氧（激活物）和細菌螢光素酶反應，形成一種中間狀態的過氧化黃素，其在存在長鏈 醛的條件下經歷進一步反應產生光。對於這個反應，還原的黃素和長鏈醛是生物發光底物。
[0186] 如本文所用，生物發光產生系統是指進行生物發光反應所需要的一系列試劑。因 此，完成生物發光反應需要的特異性螢光素酶、螢光素及其他底物、溶劑及其他試劑組成生 物發光系統。因此，生物發光產生系統是指在合適的反應條件下產生生物光的任何系列試 齊U。適當的反應條件是指發生生物發光反應必需的條件，如pH、鹽濃度及溫度。通常地， 生物發光系統包括生物發光底物、螢光素、螢光素酶（包括螢光素酶及發光蛋白），及一或 多種激活物。特定的生物發光系統可參考衍生螢光素酶的特異生物體而鑑別；例如海腎 (Renilla)生物發光系統包括海腎螢光素酶，如分離自海腎或者使用重組方式或者對這些 螢光素酶進行修飾產生的螢光素酶。這個系統還包括完成生物發光反應必需的特定激活 物，如氧和在存在氧的條件下螢光素酶與之反應產生光的底物。
[0187] 如本文所用，螢光蛋白（FP)是指具有發出螢光能力的蛋白質（即在一個波長吸收 能量並在另一個波長發射能量）。例如，綠色螢光蛋白（GFP)是指發射光譜峰值為510nm 或大約510nm的一種多肽。本領域已知在不同波長發射的多種FP。典型的FP包括但不限 於綠色螢光蛋白（GFP)、黃色螢光蛋白（YFP)、橙色螢光蛋白（0FP)、青色螢光蛋白（CFP)、藍 色螢光蛋白（BFP)、紅色螢光蛋白（RFP)、遠紅外螢光蛋白或者近紅外螢光蛋白。從有關光 蛋白的可用色光譜擴展至藍色、青色、橙色、黃色和紅色變體提供了多色跟蹤融合蛋白的方 法。
[0188] 如本文所用，Aequorea GFP是指來自Aequorea屬的GFP及其突變體或變體。 來自其它物種的這種變體和GFP如Anthozoa造礁珊瑚、Anemonia海葵、Renilla海腎、 Galaxea珊瑚、Acropora褐色珊瑚、Trachyphyllia及Pectiniidae石珊瑚及其它物種是 熟知的，可為本領域技術人員利用和已知。典型的GFP變體包括但不限於BFP、CFP、YFP和 0FP。典型的突光蛋白及其變體包括GFP蛋白，如Emerald(Invitrogen，Carlsbad, CA)， EGFP(Clontech,Palo Alto,CA),Azami-Green(MBL International,Woburn,MA),Kaede(MBL International, Woburn, MA), ZsGreenl(Clontech, Palo Alto, CA)和 CopGFP(Evrogen/ Axxora，LLC，San Diego, CA) ;CFP 蛋白，如 Cerulean (Rizzo, Nat Biotechnol. 22(4): 445-9 (2004)) , mCFP(ffang et al. , PNAS US. A. 101 (48) :16745-9 (2004)), AmCyanl(Clontech, Palo Alto, CA) , MiCy (MBL International, Woburn, MA),及 CyPet(Nguyen and Daugherty, Nat Biotechnol. 23(3) :355-60(2005)) ;BFP 蛋白，如 EBFP(Clontech，Palo Alto，CA) ;YFP 蛋白如 EYFP(Clontech，Palo Alto，CA)，YPet(Nguyen and Daugherty, Nat Biotechnol.23 (3) :355-60(2005)), Venus(Nagai et al. , Nat. Biotechnol. 20(1) :87-90(2002))，ZsYellow(Clontech，Palo Alto,CA)，及mCitrine(Wang et al..，PNAS U S A. 101(48) :16745-9(2004)) ;0FP 蛋白如 cOFP(Strategene，La Jolla， 〇八），1111(0(]\0兒11^61'仙1：；[01^1，￥013111'11，嫩），及1110四1^6;以及其它蛋白（見例如311311611^, Steinbach PA,and Tsien RY·, Nat Methods. 2(12) :905-9 (2005))。
[0189] 如本文所用，紅色突光蛋白或RFP是指已經分離自corallimorph Discosoma的 Discosoma RFP(DsRed) (Matz et al. , Nature Biotechnologyl7 :969-973 (1999)),及來自 任何其它物種的紅色或遠紅突光蛋白，如Heteractis造礁珊瑚和Actinia或Entacmaea海 葵，以及其變體。RFP包括例如Discosoma變體，如單體紅色突光蛋白1 (mRFPl)，mCherry， tdTomato,mStrawberry,mTangerine(Wang et al. ,PNAS USA. 101(48) :16745-9(2004)), DsRed2(Clontech, Palo Alto, CA)及 DsRed_Tl(Bevis and Glick, Nat. Biotechnol. ,20 : 83-87(2002)), Anthomedusa J-Red(Evrogen)和 Anemonia AsRed2(Clontech, Palo Alto, CA)。遠紅外突光蛋白包括例如 Actinia AQ143(Shkrob et al.，Biochem J.392(Pt3): 649-54 (2005)), Entacmaea eqFP611(ffiedenmann et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99(18) :11646-51(2002)), Discosoma 變體如mPlum 和mRasberry(Wang et al..，PNAS U S A. 101(48) :16745-9(2004)),以及Heteractis HcRedl和t-HcRed(Clontech，Palo Alto， CA)。
[0190] 如本文所用，體內方法是指在活的對象的身體內進行的方法。
[0191] 如本文所用，遺傳治療或者基因治療包括將異源核酸如DNA或RNA轉移至患有嘗 試用這種療法治療的病症或病變的哺乳動物、特別是人的某些細胞、靶細胞中。如本文所 用，遺傳治療或基因治療可包括將異源核酸如DNA轉移至微生物（如病毒）中，該微生物 可以被轉移至患有嘗試用這種療法治療的病症或病變的哺乳動物、特別是人體中。核酸如 DNA以某種方式被導入選擇的靶細胞中，如直接或間接導入，由此所述異源核酸如DNA被表 達及由其編碼的治療性產物產生。或者，異源核酸如DNA可以以某些方式介導編碼治療性 產物的DNA的表達，或者其可編碼在某些方式中是治療性產物的一種產物如肽或RNA (如 RNAi，包括siRNA)，或者其直接或間接介導治療性產物的表達。基因治療也可用於輸送編碼 基因產物的核酸，其置換缺陷的基因或者增補由哺乳動物或者之中導入其的細胞產生的基 因產物。導入的核酸可以編碼治療性化合物。所述編碼治療性產物的異源核酸如DNA可以 在導入受累宿主的細胞之前修飾，以增強或者另外改變所述產物或其表達。基因治療法也 可包括輸送基因表達的抑制劑或阻抑物或其它調節劑。
[0192] 如本文所用，術語過產生或者過表達當用於描述在細胞中產生的一種物質、分子、 化合物或組合物時，是指以高於所述細胞產生所述物質、分子、化合物或組合物的基線、正 常或一般的水平產生或者表達。產生或表達的基線、正常或一般水平包括無產生/表達或 者有限的、限制的或調節的產生/表達。這種過產生或過表達典型通過細胞的修飾實現。
[0193] 如本文所用，調節蛋白質活性或者基因或核酸的表達的物質或化合物降低或增加 或者另外改變所述蛋白質的活性，或者以某些方式正調節或負調節或者另外改變核酸在細 胞中的表達。
[0194] 如本文所用，"核酸"包括DNA、RNA及其類似物，包括肽核酸（PNA)及其混合物。核 酸可以是單鏈或雙鏈的。當提及探針或引物時，涵蓋單鏈分子，所述探針或引物任選是標記 的，如用可檢測標記如螢光標記或放射性標記物標記。這種分子的長度典型是統計學唯一 的或者是低拷貝數的（典型少於5個，通常少於3個）以探查或引發文庫。通常地，探針或 引物含有與感興趣的基因互補或相同的序列的至少14、16或30個連續核苷酸。探針和引 物的長度可以是10、20、30、50、100或更多個核酸。
[0195] 如本文所用，肽是指長度大於或等於2個胺基酸及少於或等於40個胺基酸的多 肽。
[0196] 如本文所用，在本發明提供的胺基酸的各個序列中出現的胺基酸根據其已知的三 字母或單字母縮寫方式識別（表1)。在各個核酸片段中出現的核苷酸以本領域常規使用的 標準命名法命名。
[0197] 如本文所用，"胺基酸"是指含有氨基基團和羧基基團的有機化合物。多肽含有兩 或多個胺基酸。對於本發明，胺基酸包括20種天然存在的胺基酸、非天然胺基酸和胺基酸 類似物（即其中α-碳具有側鏈的胺基酸）。
[0198] 如本文所用，"胺基酸殘基"是指多肽在其肽鍵經化學消化（水解）時形成的氨基 酸。本文描述的胺基酸殘基推定為是"L"異構形式。如此命名的"D"異構體形式中的殘基 可以取代任何L-胺基酸，只要所述多肽保留希望的功能性質即可。ΝΗ 2是指在多肽的氨基末 端存在的游離氨基基團。C00H是指在多肽的羧基末端存在的羧基基團。為了與在J. Biol. Chem. 243 :3557-3559 (1968)及採用的 37C. F. R. § § 1. 821-1. 822 中描述的標準多肽命名 法一致，胺基酸殘基的縮寫在表1中示出：
[0199] 表1 :對應表
【權利要求】
1. 分離的克隆LIVP毒株，其不同於基因組包含SEQ ID N0:10所示核苷酸序列的克隆 毒株。
2. 權利要求1的分離的克隆LIVP毒株，其與GLV-lh68相比具有更高的抗腫瘤發生能 力和/或降低的毒性，其中GLV-lh68具有SEQ ID NO :9所示核苷酸序列。
3. 權利要求1或2的分離的克隆LIVP毒株，其基因組中進一步包含非病毒異源核酸或 者包含開放讀框的缺失。
4. 權利要求1-3任一項的分離的克隆LIVP毒株，其與名稱為GLV-lh68並具有SEQ ID NO :9所示核苷酸序列的病毒相比具有降低的毒性。
5. 權利要求1-3任一項的分離的克隆LIVP毒株，其與名稱為GLV-lh68並具有SEQ ID NO :9所示核苷酸序列的病毒相比具有更高的抗腫瘤發生能力。
6. 權利要求1-3任一項的分離的克隆LIVP毒株，其與名稱為GLV-lh68並具有SEQ ID NO :9所示核苷酸序列的病毒相比具有降低的毒性及更高的抗腫瘤發生能力。
7. 權利要求1-6任一項的分離的克隆LIVP毒株，其包含與SEQ ID NO : 10所示核苷酸 序列具有至少85 %序列相同性的核苷酸序列，但是不包含SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列。
8. 權利要求7的分離的克隆LIVP毒株，其包含與SEQ ID NO :10所示核苷酸序列具 有至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、 99. 1%、99· 2%、99· 3%、99· 4%、99· 5%、99· 6%、99· 7%、99· 8%或 99. 9%序列相同性的核 苷酸序列。
9. 權利要求7或8的分離的克隆毒株，其中序列相同性是通過比對含有相應於反向末 端重複（ITR)的核苷酸的核苷酸序列並使用由GAP序列比對程序確定的全局比對而確定 的，其中末端缺口不罰分。
10. 權利要求1-9任一項的分離的克隆毒株，其包含選自如下的核苷酸序列： a) SEQ ID NO: 1 的核苷酸 10, 073-180, 095、SEQ ID NO :2 的核苷酸 11，243-182, 721、 SEQIDN0:4的核苷酸6,264-181，390、SEQIDN0:5的核苷酸7,044-181，820、SEQIDN0 : 6的核苷酸6,674-181，409、SEQIDN0:7的核苷酸6,716-181，367 或者SEQIDN0:8的核 苷酸 6, 899-181，870 ;或者 b) 與SEQIDN0:l的核苷酸10,073-180,095、SEQIDN0:2的核苷酸ll，243-182,721、 SEQIDN0:4的核苷酸6,264-181，390、SEQIDN0:5的核苷酸7,044-181，820、SEQIDN0 : 6的核苷酸6,674-181，409、SEQIDN0:7的核苷酸6,716-181，367 或者SEQIDN0:8的核 苷酸6, 899-181，870的序列具有至少99%序列相同性的核苷酸序列。
11. 權利要求10的分離的克隆毒株，其包含左側和/或右側反向末端重複。
12. 權利要求1-11任一項的分離的克隆毒株，其包含SEQ ID N0:l、2、4、5、6、7或8所 示核苷酸序列，與SEQ ID N0:l、2、4、5、6、7或8所示核苷酸序列具有至少99%序列相同性 的核苷酸序列。
13. 通過繁殖權利要求1-12任一項的分離的克隆LIVP毒株產生的LIVP製備物。
14. 細胞培養物或分離的細胞，其包含權利要求1-12任一項的克隆毒株。
15. 分離的克隆毒株，其如下產生： 繁殖權利要求14的細胞或細胞培養物；及 從所得細胞中分離LIVP克隆。
16. 重組LIVP病毒株，包含： 權利要求1-12或15任一項的LIVP克隆毒株的基因組；及 在所述基因組中的編碼異源基因產物的核酸。
17. 權利要求16的重組LIVP病毒株，其中編碼異源基因產物的核酸被插入或者置換病 毒基因組中的非必需基因或區域。
18. 權利要求16或17的重組LIVP病毒株，其中編碼異源基因產物的核酸被插入在病 毒基因組中的血凝素（HA)、胸苷激酶（TK)、F14. 5L、痘苗病毒生長因子（VGF)、A35R、NIL、 E2L/E3L、K1L/K2L、過氧化物歧化酶基因座、7· 5K、C7-K1L、B13R+B14R、A26L 或 I4L 基因座 中。
19. 權利要求16-18任一項的重組LIVP病毒株，其中所述異源基因產物是治療劑或診 斷劑。
20. 權利要求16-19任一項的重組LIVP病毒株，其中所述異源基因產物選自抗癌劑、 抗轉移劑、抗血管發生劑、免疫調節分子、抗原、細胞基質降解基因、組織再生及人類體細胞 多能性重塑基因、修飾底物產生可檢測產物或信號的酶或者可被抗體檢測的酶、可以結合 造影劑的蛋白質、用於光學成像或檢測的基因、用於PET成像的基因以及用於MRI成像的基 因。
21. 權利要求20的重組LIVP病毒株，其中抗轉移劑抑制轉移定植或者在體外細胞侵襲 測定中抑制細胞侵襲。
22. 權利要求20的重組LIVP病毒株，其中抗血管發生劑抑制腫瘤中血管形成。
23. 權利要求16-22任一項的重組LIVP病毒株，其中異源基因產物是治療劑，其選自激 素、生長因子、細胞因子、趨化因子、共刺激分子、核酶、轉運蛋白、單鏈抗體、反義RNA、前體 藥物轉化酶、siRNA、microRNA、毒素、抗腫瘤寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗 癌多肽抗生素、血管發生抑制劑、腫瘤抑制物、細胞毒性蛋白、細胞抑制蛋白和組織因子。
24. 權利要求16-23任一項的重組LIVP病毒株，其中異源基因產物是治療劑，其選自 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)、單核細胞趨化蛋白-1 (MCP-1)、白介素-6 (IL-6)、 白介素-24(IL-24)、幹擾素 γ誘導的蛋白質10(IP-10)、與HSV糖蛋白D競爭T-淋巴細胞 上表達的受體HVEM的淋巴毒素誘導表達物（LIGHT)、p60超抗原、OspF、OspG、信號轉導及 轉錄激活蛋白（STATlalpha)、STATlbeta、血纖維蛋白溶酶原k5結構域（hK5)、色素上皮分 化因子（PEDF)、單鏈抗VEGF抗體、單鏈抗DLL4抗體、單鏈抗成纖維細胞活化蛋白（FAP)、 匪23、鈣粘著蛋白1 (ECAD或cdhl)、鬆弛素1 (RLN1)、基質金屬肽酶9 (MMP9)、紅細胞生成素 (EPO)、microRNA126(miR-126)、microRNA181、microRNA335,錳過氧化物歧化酶（MnSOD)、E3 泛素蛋白連接酶1 (HACE1)、鈉尿肽前體A(nppal)、羧肽酶G2 (CPG2)、醇脫氫酶（ADH)、CDC6 和骨形態發生蛋白4(BMP4)。
25. 權利要求24的重組LIVP病毒株，其中單鏈抗VEGF抗體命名為G6。
26. 權利要求16-20任一項的重組LIVP病毒株，其中異源基因產物是診斷劑，其為可檢 測蛋白質或者誘導可檢測信號的蛋白質。
27. 權利要求16-20或26任一項的重組LIVP病毒株，其中異源基因產物是診斷劑，其 選自螢光素酶、螢光蛋白、生物發光蛋白、受體或轉運蛋白，所述受體或轉運蛋白結合於和/ 或轉運可檢測的造影劑、生色團、化合物或配體。
28. 權利要求27的重組LIVP病毒株，其中結合於和/或轉運造影劑的受體或轉運蛋白 是鐵受體、鐵轉運蛋白、銅攝取轉運蛋白。
29. 權利要求27或28的重組LIVP病毒株，其中異源基因產物是診斷劑，其選自綠色磕 頭蟲螢光素酶、lux操縱子、紅外突光蛋白、黃素還原酶蛋白，mNeptune遠紅光突光蛋白、綠 色螢光蛋白（GFP)、紅色螢光蛋白（RFP)、腔腸素結合蛋白（CBP)、人腎上腺素受體（hNET)、 碘化鈉同向轉運蛋白（NIS)、細胞色素 p450家族酶、allostatinA受體（AlstR)、Pepl受體 (PEPR-1)、LAT-4、固醇14 α -去甲基酶（Cyp51)、轉移受體（TR)、鐵蛋白、二價金屬轉運蛋白 (DMT)、趨磁性蛋白A(MagA)和順鉬內流轉運蛋白（CTR1)。
30. 權利要求20的重組LIVP病毒株，其中組織再生及人類體細胞多能性重塑基因選自 newt AG(nAG)、0ct4、NANOG、Ngn3、Pdxl 和 Mafa。
31. 權利要求16-30任一項的重組LIVP病毒株，其中編碼異源基因產物的核酸可操縱 地與啟動子連接。
32. 權利要求31的重組LIVP病毒株，其中啟動子是哺乳動物啟動子或病毒啟動子。
33. 權利要求31或32的重組LIVP病毒株，其中啟動子選自Ρ7.51?、Ρη1?、Ρ 3Ε、Ρι、Ρ^Η5Κ、 ΤΚ、Ρ28、Cl 1R、G8R、F17R、I3L、I8R、AIL、A2L、A3L、H1L、H3L、H5L、H6R、H8R、DIR、D4R、D5R、 D9R、DllL、D12L、D13L、MlL、N2L、P4b 或 K1 啟動子。
34. 組合物，包含權利要求1-33任一項的病毒株。
35. 藥物組合物，包含權利要求1-33任一項的病毒株。
36. 權利要求35的藥物組合物，進一步包含藥物學可接受的載體。
37. 權利要求35或36的藥物組合物，其被配製用於局部或全身施用。
38. 權利要求34-37任一項的組合物或藥物組合物，包含一或多種不同病毒株。
39. 權利要求35-38任一項的藥物組合物，其被配製為用作抗病毒或抗癌疫苗施用。
40. 治療對象中的增生性病症的方法，包括施用權利要求35-39任一項的藥物組合物。
41. 權利要求40的方法，進一步包括施用用於治療增生性病症的第二種治療劑。
42. 權利要求40或41的方法，其中增生性疾病是癌症。
43. 權利要求42的方法，其中癌症是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌或胰腺 癌。
44. 權利要求40-42任一項的方法，其中增生性病症是腫瘤或轉移。
45. 權利要求40-44任一項的方法，其中對象是人類或非人類動物。
46. 權利要求45的方法，其中非人類動物選自馬、貓、犬、牛、豬、綿羊、山羊、小鼠、兔、 雞、大鼠和豚鼠。
47. 權利要求40-46任一項的方法，其中病毒的施用量是至少或者大約或者是 lxl05pfu，在一個施用周期至少一次。
48. 權利要求40-47任一項的方法，其中病毒的施用量是至少或者大約或者是 lxl05pfu> lxl06pfu> lxl07pfu> lxl08pfu> Ixl09pfu>lxl0icipfu>lxl0npfu>lxl0 12pfu> lxl013pfu或lxl014pfu，在一個施用周期至少一次。
49. 權利要求47或48的方法，其中所述量的病毒在一個施用周期施用二次、三次、四 次、五次、六次或七次。
50. 權利要求47-49任一項的方法，其中所述量的病毒在周期的第一天、周期的第一和 第二天、周期的前三個連續日子的每一天、周期的前四個連續日子的每一天、周期的前五個 連續日子的每一天、周期的前六個連續日子的每一天或者周期的前七個連續日子的每一天 施用。
51. 權利要求47-50任一項的方法，其中施用周期是7天、14天、21天或28天。
52. 權利要求47-51任一項的方法，其中施用周期重複多次。
53. 權利要求40-52任一項的方法，進一步包括另一種治療，其選自外科手術、放療、免 疫抑制治療和施用抗癌劑，其中所述進一步治療是在病毒之前、之後、同時或相間進行。
54. 權利要求53的方法，其中所述進一步治療是施用抗癌劑，所述抗癌劑選自細胞因 子、趨化因子、生長因子、光增敏劑、毒素、抗癌抗生素、化療化合物、放射性同位素、血管發 生抑制劑、信號傳導調節劑、抗代謝物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分 裂寡肽、抗癌抗體、抗癌抗生素、免疫治療劑及前述任何抗癌劑的組合。
55. 權利要求53或54的方法，其中抗癌劑選自順鉬、卡鉬、吉西他濱、伊立替康、抗 EGFR抗體和抗VEGF抗體。
56. 權利要求54或55的方法，其中病毒和抗癌劑相繼、同時或者相間施用。
57. 權利要求40-56任一項的方法，其中病毒經全身性、靜脈內、動脈內、腫瘤內、內窺 鏡、病變內、肌肉內、皮內、腹膜內、囊內、關節內、胸膜內、經皮、皮下、口服、胃腸外、鼻內、氣 管內、經吸入、顱內、前列腺內、玻璃體內、局部、眼部、陰道或直腸施用。
58. 權利要求40-57任一項的方法，其中病毒經靜脈內施用。
59. 檢測對象中的腫瘤或轉移的方法，包括： 給對象施用權利要求1-33任一項的LIVP病毒或克隆毒株，其中所述病毒包含編碼可 檢測蛋白質或者誘導可檢測信號的蛋白質的核酸；以及 檢測所述可檢測蛋白質或者誘導可檢測信號的蛋白質，其中檢測指示對象中腫瘤或轉 移的存在。
60. 權利要求59的方法，其中檢測通過給對象成像而實現。
61. 權利要求59的方法，其中檢測通過檢測組織或體液樣品中的蛋白質或信號而實 現。
62. 權利要求59-61任一項的方法，其中所述可檢測蛋白質或者誘導可檢測信號的蛋 白質選自螢光素酶、螢光蛋白、生物發光蛋白、受體或者轉運蛋白，所述受體或者轉運蛋白 結合和/或轉運可檢測的造影劑、生色團、化合物或配體。
63. 權利要求62的方法，其中所述可檢測蛋白質或者誘導可檢測信號的蛋白質選自綠 色螢光蛋白（GFP)、紅色螢光蛋白（RFP)、鐵受體、鐵轉運蛋白、人腎上腺素受體（hNET)和碘 化鈉同向轉運蛋白（NIS)。
64. 權利要求59-63任一項的方法，其中所述可檢測蛋白質或者可檢測信號通過微光 成像、螢光光譜、X-光成像、磁共振成像（MRI)、磁共振光譜（MRS)、正電子成像術（PET)或 單光子發射計算機斷層掃描（SPECT)檢測。
65. 檢測宿主中病毒複製的方法，包括： 給對象施用權利要求1-33任一項的病毒，其中所述病毒包含編碼可檢測蛋白質或者 誘導可檢測信號的蛋白質的核酸；以及 檢測所述可檢測蛋白質或者誘導可檢測信號的蛋白質，其中檢測指示病毒在對象中復 制。
66. 權利要求65的方法，其中所述對象具有腫瘤或者癌症。
67. 權利要求65或66的方法，其包括在施用病毒後，從所述對象獲得體液樣品；及檢 測體液中的可檢測蛋白質或信號。
68. 權利要求67的方法，其中所述體液選自尿、血液、淚或者腦脊液。
69. 分離的宿主細胞或細胞培養物，包含權利要求1-33任一項的LIVP病毒株。
70. 用於治療對象中的增生性疾病的組合物，其中所述組合物包含權利要求1-33任一 項的LIVP病毒或克隆毒株。
71. 權利要求1-33任一項的LIVP病毒或克隆毒株在製備用於治療對象中的增生性病 症的藥物組合物中的用途。
72. 權利要求70或71的組合物或用途，其中病毒株的濃度是Ixl06_lxl016pfu/ml或者 是至少或者大約或者是 lxl〇6pfu/ml、lxl07pfu/ml、lxl08pfu/ml、lxl0 9pfu/ml、lxl01Qpfu/ ml、lxlOnpfu/ml、lxl012pfu/ml、lxl013pfu/ml、lxl0 14pfu/ml、lxl015pfu/ml 或 lxl016pfu/ ml〇
73. 權利要求70-72任一項的組合物或用途，其中所述組合物進一步包含抗癌劑。
74. 權利要求73的組合物或用途，其中所述抗癌劑選自細胞因子、趨化因子、生長因 子、光增敏劑、毒素、抗癌抗生素、化療化合物、放射性同位素、血管發生抑制劑、信號傳導調 節劑、抗代謝物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有絲分裂抑制蛋白、抗有絲分裂寡肽、抗癌抗體、抗癌 抗生素、免疫治療劑及前述任何抗癌劑的組合。
75. 權利要求73或74的組合物或用途，其中抗癌劑選自順鉬、卡鉬、吉西他濱、伊立替 康、抗EGFR抗體和抗VEGF抗體。
76. 權利要求70-75任一項的組合物或用途，其中所述增生性病症是癌症。
77. 權利要求76的組合物或用途，其中癌症是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌 或胰腺癌。
78. 權利要求70-77任一項的組合物或用途，其中癌症是實體瘤癌症或者轉移癌。
79. 權利要求78的組合物或用途，其中腫瘤或轉移是乳腺腫瘤、前列腺腫瘤、卵巢腫 瘤、肺腫瘤、結腸腫瘤或胰腺腫瘤。
80. 權利要求70-79任一項的組合物或用途，其中所述組合物配製為用於全身或局部 施用。
81. 權利要求70-80任一項的組合物或用途，其中所述組合物配製為用於靜脈內施用。
82. 選擇用於癌症治療和診斷的LIVP克隆毒株的方法，包括： (i) 提供第一個LIVP病毒樣品，其含有具有不同基因組序列的病毒顆粒的混合物； (ii) 從所述樣品選擇和分離單個克隆分離株； (iii) 測定每個克隆分離株的毒性； (iv) 測定每個克隆分離株的抗腫瘤發生能力；及 (v) 選擇與參照LIVP病毒株相比顯示更高的抗腫瘤發生能力及降低的毒性的克隆毒 株，其中將顯示降低的毒性和更高的抗腫瘤發生能力的克隆分離株鑑定為用於癌症治療和 診斷的LIVP克隆毒株。
83. 權利要求82的方法，其中所述參照LIVP病毒是減毒重組LIVP病毒。
84. 權利要求82或83的方法，其中所述參照LIVP病毒是命名為GLV-lh68的病毒，其 基因組包含SEQ ID NO :9所示核苷酸序列（GLV-lh68)。
85. 權利要求82-84任一項的方法，其中所述第一個LIVP病毒樣品是LIVP病毒株，其 包含具有SEQ ID N0:10所示基因組或者與SEQ ID N0:10至少99%相同的基因組的LIVP。
86. 權利要求82-85任一項的方法，其中第一個LIVP病毒樣品是通過繁殖用LIVP毒株 和另一種病毒株、基因組DNA或克隆的DNA感染的細胞，隨後從培養物中分離病毒樣品而獲 得的混合物，其中所述樣品包含由感染產生的子代病毒。
87. 權利要求86的方法，其中另一種病毒株選自DNA病毒、雙鏈RNA病毒、單鏈正義RNA 病毒和單鏈負義RNA病毒。
88. 權利要求87的方法，其中DNA病毒選自痘病毒，如禽痘病毒、粘液瘤病毒或痘苗 病毒；皰疹病毒如單純皰疹病毒（HSV)、巨細胞病毒（CMV)、Epstein-Barr病毒（EBV)、嗜肝 DNA病毒、多瘤病毒、乳頭瘤病毒、腺病毒和腺相關病毒；以及單鏈DNA病毒如細小病毒。
89. 權利要求86-88任一項的方法，其中另一種病毒株是痘苗病毒株。
90. 權利要求87的方法，其中雙鏈RNA病毒是呼腸孤病毒如輪狀病毒。
91. 權利要求87的方法，其中單鏈正義RNA病毒選自小RNA病毒如Seneca valley病 毒、柯薩基病毒或脊髓灰質炎病毒、腸道病毒；披膜病毒如西門利克森林病毒；和逆轉錄病 毒如人類免疫缺陷病毒（HIV)、鼠 Maloney白血病病毒（MMLV)和慢病毒。
92. 權利要求91的方法，其中單鏈負義RNA病毒選自正粘病毒如流感病毒；副粘病毒 如新城疫病毒、麻疹病毒或腮腺炎病毒；以及棒狀病毒如水泡性口炎病毒（VSV)。
93. 權利要求82-92任一項的方法，其中通過噬斑測定選擇來自樣品的單個克隆分離 株。
94. 權利要求93的方法，其中選擇噬斑測定中最大的噬斑。
95. 權利要求94的方法，其中至少選擇最大的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20個噬斑並且作為克隆分離株而分離，每一個均在步驟（iii)和（iv)中測定 毒性和抗腫瘤發生能力。
96. 權利要求93-95任一項的方法，其中所選擇的噬斑大於LIVP病毒樣品產生的噬斑 的平均噬斑大小。
97. 由權利要求82-96任一項的方法產生的克隆毒株。
【文檔編號】C12N7/00GK104093830SQ201280029139
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2012年4月13日 優先權日:2011年4月15日
【發明者】A·A·紹洛伊, N·G·陳, Y·A·於, Q·張 申請人:吉恩勒克斯公司