抗黑脛病菸草品種紅花大金元的培育方法
2024-03-25 18:19:05
專利名稱：抗黑脛病菸草品種紅花大金元的培育方法
技術領域：
本發明涉及植物育種和細胞工程領域，具體地涉及一種抗黑脛病菸草品種紅花大金元的培育方法。
黑脛病(Phytophythora Parasitica Via Nicotina)是病原菌侵入菸草植株後，分泌毒素、酶等毒物，殺死寄主細胞，從死亡細胞中吸取營養使菸草致病的真菌性病害。菸草黑脛病是由菸草疫黴引起的，借土壤及流水傳播的真菌病，是世界範圍內對菸草生產威脅最嚴重的病害之一。「紅花大金元」是菸草的主栽品種，但高感黑脛病，因此，需要培育既保持了「紅花大金元，，優良品性又具有對黑脛病抗性的優良品系。現有技術中植物品種的培育方法常用的雜交法、系統選育法存在著以下缺點雜交法選擇所需要的親本進行有性雜交，周期長、選擇性差，到目前為止，尚未用此法育出抗黑脛病的紅花大金元品種。系統選育法在大田中選擇抗黑脛病較強的單株，後代分離也十分嚴重，目前也未能用系統選育法選擇出抗病新品種。由於目前尚未分離到有效抗真菌的基因，因此採用細胞工程方法篩選抗病突變體是切實可行的。
為了克服現有技術存在的上述缺點，本發明的目的在於提供一種抗黑脛病菸草品種紅花大金元的培育方法，該方法培育時間短、效率高、分析結果靈敏度高。
為了實現本發明的目的，本發明提供了下述技術方案
抗黑脛病菸草品種紅花大金元的培育方法，採用細胞突變法，將菸草品種紅花大金元的體細胞和花葯經γ-射線處理後，在含有黑脛病毒素的培養基上篩選抗病株系，通過黑脛病毒素的誘變篩選即分離黑脛病病原體、提取黑脛病毒素、體細胞抗性篩選、單倍體篩選得抗黑脛病株系，具體地，在感病的菸草莖杆內分離純化黑脛病病原體，並建立黑脛病病原體繁殖條件，然後從直接感病的「紅花大金元」植株分離到黑脛病病原菌菌種，進行培養和和純化；體細胞抗性篩選是將分離到的黑脛病病原體接種於黃氏合成培養基中，28℃黑暗條件下培養2周，調節PH5.7-5.8，用0.45μ微機濾膜過濾，得粗毒素，用含粗毒素60％的MS＋6BAlmg/l培養基接種預培養1周的二倍體葉片外植體，2個月後得到抗性小芽，將抗性小芽轉入MS培養基上，一個月後轉至含黑脛病毒素濾液的培養基上，然後進行單倍體篩選途徑，用含粗毒素80％的「菸草一號」培養基大量接種花葯進行篩選，通過抗病篩選，得到了抗黑脛病株系；將上述抗病體細胞突變體株系進行病圃篩選，在M2代發生了分離現象，M3代得到穩定株系，進行病圃抗病篩選；單倍體突變體病圃抗病篩選採用含有黑脛病原菌的菌谷，施放在菸草基部，篩選抗病株系。
本發明採用細胞突變法，將菸草品種紅花大金元的體細胞和花葯經γ-射線處理後，在含有黑脛病毒素的培養基上篩選抗病株系。本法分兩大部分建立黑脛病毒素的誘變篩選條件分離黑脛病病原體，在感病的菸草莖杆內分離純化黑脛病病原體，並建立黑脛病病原體繁殖條件；提取黑脛病毒素從直接感病的「紅花大金元」植株分離到黑脛病病原菌(ppn)菌種，進行了培養和純化；體細胞抗性篩選將分離到的ppn接種於黃氏合成培養基中，28℃黑暗條件下培養2周，調節PH5.7-5.8，用0.45μ微機濾膜過濾，得粗毒素。用含粗毒素60％的MS(6BAlmg/l)培養基接種預培養1周的二倍體葉片外植體。2個月後得到抗性小芽，選擇效率為0.5％，將抗性小芽轉入MS培養基上，一個月後轉至含毒濾液的培養基上，發現用前者選出的抗性小苗對後者同樣具有抗性。單倍體篩選途徑用含粗毒素80％的「菸草一號」培養基大量接種花葯進行篩選，在培養基中發現具有毒素因子，經高壓處理仍不變性或失活成分，初步認為是耐高溫的非蛋白組份，通過抗病篩選，得到了抗黑脛病株系。
大田病圃篩體細胞突變體大田篩選，在M2代發生了分離現象，M3代得到穩定株系；單倍體突變體病圃抗病篩選用含有黑脛病原菌的菌谷，施放在菸草基部，篩選抗病株系。
本發明與現有技術相比的優異之處1、培育周期短本發明誘變方法培育抗病品種時間短，一般3-5年，而傳統方法時間較長，一般需用年以上；2、效率高細胞誘變法採用花葯培養，由於花葯內花粉小孢子群體數量大，可佔用較小的空間進行大量篩選，篩選出的突變體為單倍體，可通過染色體加倍迅速純合，因定優良性狀，可在短期內高效選擇突變體。
3、單倍體的RAPD分析對選出的單倍體以感病親本為對照進行RAPD分析，找到了抗性單基因(CYA-170-100和Sangon 03-350)，為抗黑脛病RAPD標記基因。
下面用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但本發明的內容並不局限於此。
實施例1首先進行黑脛病原分離，將菸草品種紅花大金元的體細胞和花葯經γ-射線處理後，在含有黑脛病毒素的培養基上篩選抗病株系，對感病植株進行表面消毒，取莖杆內未被其它菌感染的組織，在無菌條件下培養，得到菌絲體，經純化後大量培養；取紅花大金元花葯進行離體培養，培養條件25℃，光照2000LUX。配製含黑脛病素培養基，培養花葯；對培育的突變體組培苗進行抗病篩選，在室溫接種黑脛病原，選出抗性植株；對選出抗病突變體進行抗性分析(RAPD分析)，也稱隨機擴增DNA多態性分析，提取紅花大金元親本及抗病突變體DNA進行RAPD分析，找出差異條帶，用近等基因與親本回交F1代經自交形成F2代，應出現感病與抗病分離，取F2代感病與抗病株的DNA進行隨機擴增，抗病株出現共分離，證明抗病性是遺傳上的改變，即由基因控制的。菸草單倍體加倍本來是很容易的。但突變體的加倍卻十分困難，本發明單倍體加倍採用0.1％秋水仙鹼，用5％甘油配製，處理菸草項芽，還要不斷噴水，保持一定溼度。
第二步進行突變體後代田間病圃篩選突變體後代抗病性出現奇特現象，即不按孟德爾遺傳規律分離，每個株系中出現了抗病單株，又經系統選育，得到三個穩定抗病株系A1-5體細胞抗病突變體，DH5-1，DH5-2單倍體抗病突變體，其抗病指數接近抗病品種革新三號，抗性評價為R(抗)。
實施例2驗證實施例1體細胞突變方法的可靠性(1)、對轉座因子的轉座活性進行分析，採用標記基因的表型檢測。本發明用農桿菌雙元載體PSLH721(ACGUS)轉化菸草紅花大金元，然後對轉基因菸草的愈傷組織進行GUS酶活性的組織化學分析，通過GUS活性變化來分析轉座活性。結果表明組織培養可以增強轉座子的活性，間接證明轉座子活化是體細胞無性系變異的原因之一。(2)本發明從雲南菸草產地分離到黑脛病0號小種和1B生理小種，並將其強化。得到菌種毒素。(3)以50％以及80％的黑脛病毒素的選擇壓力，篩選出抗黑脛病毒素的菸草株系，用離體葉片方法和莖部接種法進一步鑑定其對黑脛病病原菌的抗性。(4)利用隨機引物擴增多態DNA(RAPD)分析技術，對選擇到的九個抗病株系和六個對照的DNA進行分析，在使用的70種隨機引物中，共有57個引物產生可檢測擴增產物，產生306條擴增帶。其中，有多態性的條帶為51條，突變體的平均RAPD條帶變異為1.85％其中有兩個RAPD條帶(CYA—17—100和SANGON03—350)為突變體所獨有，初步判斷為抗黑脛病和RAPD單基因分子標記。(5)遺傳穩定性和分離規律。
在實驗室條件下篩選抗病突變體，有時還面臨實驗室條件下的抗病性與田間抗病性不對應性的問題，這可能由於病原菌對寄主植物的侵染還受氣候條件的影響，而實驗室條件與田間氣候條件相比存在很大不同所致，本發明篩選到的抗性突變體，在實驗室經離體葉片法和莖部接種法都證實了抗性存在。
本發明對獲得抗病突變體後代的抗毒素能力進行了檢測，發現後代抗性以7∶1∶4(抗性∶中間∶敏感)進行分離，不符合單基因的孟得爾遺傳規律，推測抗毒素性狀可能是多基因不完全顯性控制，這說明了培育抗黑脛病菸草的複雜性，不同品種間的抗性可能不完全一致。(6)抗病株系田間篩選a、二倍體株系篩選第一代在網室內種植；實驗材料都生長良好，很類似雜交一代種的雜種優勢現象；第二代在試驗地篩選，種植面積三畝，結果是發生極大的分離現象，只從數千株中選出A、B、C、D四個單株，這四個單株F3代進行種植，結果生長基本一致，這樣初步得到來自體細胞的遺傳表型穩定的四個株系A、B、C、D(F4)代。將這四個株系在抗黑脛病圃中進行抗性篩選。
b、單倍體株系的篩選種植對6個單倍體株系，H1、H2代遺傳表型都無分離現象，證明得到遺傳純合二倍體。將穩定的H3代在病圃內進行抗病篩選，結果出現了分離現象。這種抗性分離現象主要表現是每個株系中都有抗性很強的單株和不抗病單株，這種分離現象與實驗室的抗性分離規律7∶1∶4有些近似，通過三年病圃抗性篩選，從二倍體和單倍體後代中都選出了抗性較好的株系(見表1)表1本發明篩選出的單倍體抗病株系
權利要求
1.抗黑脛病菸草品種紅花大金元的培育方法，採用細胞突變法，將菸草品種紅花大金元的體細胞和花葯經γ-射線處理後，在含有黑脛病毒素的培養基上篩選抗病株系，通過黑脛病毒素的誘變篩選即分離黑脛病病原體、提取黑脛病毒素、體細胞抗性篩選、單倍體篩選得抗黑脛病株系，其特徵是在感病的菸草莖杆內分離純化黑脛病病原體，並建立黑脛病病原體繁殖條件，然後從直接感病的「紅花大金元」植株分離到黑脛病病原菌菌種，進行培養和純化；體細胞抗性篩選是將分離到的黑脛病病原體接種於黃氏合成培養基中，28℃黑暗條件下培養2周，調節PH5.7-5.8，用0.45μ微機濾膜過濾，得粗毒素，用含粗毒素60％的MS＋6BAlmg/1培養基接種預培養1周的二倍體葉片外植體，2個月後得到抗性小芽，將抗性小芽轉入MS培養基上，一個月後轉至含黑脛病毒素濾液的培養基上，然後進行單倍體篩選途徑，用含粗毒素80％的「菸草一號」培養基大量接種花葯進行篩選，通過抗病篩選，得到了抗黑脛病株系；將上述抗病體細胞突變體株系進行病圃篩選，在M2代發生了分離現象，M3代得到穩定株系，進行病圃抗病篩選；單倍體突變體病圃抗病篩選採用含有黑脛病原菌的菌谷，施放在菸草基部，篩選抗病株系。
全文摘要
提供一種抗黑脛病菸草品種紅花大金元的培育方法,採用細胞突變法,將菸草品種紅花大金元的體細胞和花葯經γ－射線處理後,在含有黑脛病毒素的培養基上篩選抗病株系,通過黑脛病毒素的誘變篩選即分離黑脛病病原體、提取黑脛病毒素、體細胞抗性篩選、單倍體篩選得抗黑脛病株系,該方法培育時間短、效率高、分析結果靈敏度高。
文檔編號C12N7/00GK1331914SQ0110871
公開日2002年1月23日 申請日期2001年8月6日 優先權日2001年8月6日
發明者何靜波, 朱至清, 喻長惠, 李銀心, 張志宏, 王玉秀, 孔光輝, 段玉琪, 李天飛 申請人:中國科學院昆明植物研究所