一種抗F2卵黃抗體的製備方法與流程
2024-04-01 06:09:05
本發明屬於免疫學技術領域，具體涉及一種抗F2卵黃抗體的製備方法。
背景技術：
F2毒素又稱玉米赤黴烯酮，是由多種鐮刀菌產生的一種類雌激素樣的真菌毒素。穀物(如玉米、小麥等)是F2產生的最好基質，其次為豆類及其製品。近年來的調查顯示，中國飼料和原料汙染黴菌毒素超標的比例高達95％以上，主要汙染物為F2和嘔吐毒素。近十年來，人們廣泛認識到水環境中內分泌物失衡對人類的危害，其中F2汙染可能是其中因素之一，相關學者對波蘭地表水、地下水及廢水檢測發現，F2濃度範圍在0-43.7ng/L。
F2具有較強生殖毒性及致畸作用，可引起動物不孕或流產，對畜牧業造成較大經濟損失，此外，F2還具有免疫毒性、細胞毒性、肝毒性、促進腫瘤的發生等，嚴重威脅人畜健康。我國飼料衛生標準規定飼料中F2檢出量≤500ppb，而糧食衛生標準規定F2檢出量≤60ppb。因此，建立快速、準確、簡便適合大面積樣品篩選的檢測F2的方法非常重要。同時，目前針對畜禽黴菌毒素中毒，通常採用脫黴劑，是否可利用抗原抗體反應，將黴菌毒素進行中和，還未見有相應報導。所以，本發明也將為解決黴菌毒素中毒症提供參考方向。
目前檢測F2的主要方法有薄層色譜法(Thin-layer chromatography,TLC)、高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)、高效液相色譜-質譜聯用法(High performance liquid chromatography-mass spectrum,HPLC-MS)、氣相色譜法(Gas chromatography,GC)、氣相色譜-質譜聯用法(Gas chromatography-mass spectrum,GC-MS)、毛細管電泳法(Capillary electrophoresis,CE)、酶聯免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)等。這些檢測方法有些需要昂貴的儀器設備、專業的操作人員，樣品需進行複雜的處理過程，而有些如ELSIA，操作雖然簡單，但其檢測的關鍵技術需要人工製備針對F2的單克隆抗體，而單克隆抗體的製備複雜、生產成本高，因而很大程度上限制了F2ELISA檢測體系的建立。
卵黃抗體(IgY)是從產蛋雞中提取的針對特異性抗原的免疫球蛋白，在雞蛋的形成過程中，血清IgY通過卵黃囊膜上特殊受體選擇性的從循環系統經卵膜運至成熟卵母細胞。IgY結構與哺乳動物IgG類似，其已用於生物診斷試劑盒、治療製劑的製備，其與IgG相比，主要優勢有以下：①抗體收集無需屠宰動物，只要每天收集雞蛋即可；②雞與哺乳動物親緣性較遠，異種物質刺激能產生更強的免疫應答反應；③抗體產量高，一隻雞每年大概產300隻蛋，而每隻蛋含50-100mg IgY，其中2-10％的為特異抗體，相比40ml血液含200mg IgG，產量大大提高；④成本低。
但在F2的檢測技術範圍內，還未見有抗F2卵黃抗體的應用，本發明將提供一種抗F2卵黃抗體的製備方法，為開發快速檢測且實惠的試劑盒如膠體金、ELISA方法等提供支撐，同時為研究F2毒理機制及預防黴菌毒素中毒提供參考。
技術實現要素：
本發明的目的在於促進F2快速檢測反應體系的構建，提供一種抗F2毒素卵黃抗體的製備方法。
本發明採用的技術方案如下：一種抗F2卵黃抗體的製備方法，包括：
將含有F2毒素和甲醛的溶液加入到含有牛血清白蛋白BSA、pH為7.5～8.0的溶液中，在室溫反應，使F2與BSA偶聯，製備免疫抗原F2-BSA；
將製備的F2-BSA對蛋雞免疫接種，然後收集雞蛋；
從雞蛋中提取純化抗F2卵黃抗體。
在一個具體實施例中，將含有F2毒素和甲醛的甲醇溶液滴加到含有BSA的醋酸鉀溶液中，室溫反應。
在一個具體實施例中，含有F2毒素和甲醛的甲醇溶液採用F2、甲醇和甲醛水溶液配成，甲醇與甲醛水溶液體積比0.8～1.2:1，配成後F2濃度為0.4～0.6mg/mL；醋酸鉀溶液濃度0.8～1.2mol/L，BSA濃度為2～3mg/mL。
在一個具體實施例中，所述室溫反應是15～35℃反應20～30h。
在一個具體實施例中，偶聯產物用PBS進行透析。
在一個具體實施例中，將F2-BSA與佐劑乳化，製備成油乳劑疫苗，用於免疫接種。
在一個具體實施例中，將F2-BSA免疫接種蛋雞三次，收集第三次免疫一周後所產的雞蛋。
在一個具體實施例中，採用濃鹽水法提純卵黃抗體。
在一個具體實施例中，所述濃鹽水法是蛋黃與水攪拌均勻後，調整pH至5.0～5.5，-15℃以下預凍，融化後抽濾，在抽濾液體中加入1.2～1.8mol/L氯化鈉，使之終濃度為8.5～9.0％，調整pH至4.0～4.5，室溫沉澱，離心棄上清，PBS懸浮沉澱。
在一個具體實施例中，採用與製備F2-BSA同樣的方法將F2毒素與卵清白蛋白OVA進行偶聯，製備檢測抗原F2-OVA，用於後續抗體滴度檢測。
本發明所提供的抗F2卵黃抗體的製備方法能夠產生活性高的特異性抗體，抗體吸附F2毒素的能力強，抗體效價高，產量大，方法簡易，成本低，可替代現有的鼠源性單克隆抗體。所提供的偶聯方法相對於其他方法要簡便，無需對F2進行修飾。該方法利於F2快速反應檢測體系的建立，在農產品及食品中對F2的監測具有積極的應用意義。同時可利用抗原抗體反應原理，用於F2毒素毒理機制的研究，及臨床F2毒素中毒的防控。
附圖說明
圖1為F2-BSA偶聯產物SDS-PAGE電泳圖(1、F2-BSA；2、BSA；3、F2-OVA；4、OVA；M為marker)；
圖2為F2-BSA偶聯後紫外掃描光譜圖；
圖3為F2-OVA偶聯後紫外掃描光譜圖；
圖4為抗F2卵黃抗體SDS-PAGE電泳圖(1、2為抗F2卵黃抗體，M為marker)；
圖5為F2毒素濃度評測標準曲線。
具體實施方式
本發明的抗F2卵黃抗體的製備工藝流程為：
1)抗原的製備：採用醛縮法，將F2毒素與牛血清白蛋白(BSA)及卵清白蛋白(OVA)進行偶聯，製備免疫抗原(F2-BSA)及檢測抗原(F2-OVA)；其中F2-OVA用於後續抗體滴度檢測。
2)免疫產蛋雞：將F2-BSA與佐劑乳化製備成疫苗，免疫產蛋雞。
3)卵黃抗體提取：免疫3次後收集雞蛋，提取純化出高滴度的抗F2卵黃抗體。
抗F2卵黃抗體的純度、滴度、特異性檢測方法為SDS-PAGE、ELISA。
以下通過具體實施例對本發明技術方案做進一步解釋說明。
本發明所述「室溫」是指15-35℃，優選20-30℃，更優選20-25℃。
實施例1
本實施例為抗F2卵黃抗體的製備方法，具體步驟如下：
1、F2完全抗原的製備
1mg F2(美國Sigma公司)溶入1ml甲醇中，加入1ml 37％甲醛水溶液，混勻為A液；5mg BSA(或5mg OVA)溶於2ml 1mol/L醋酸鉀溶液中，為B液；將F2溶液緩慢加入蛋白質溶液中，室溫反應24h。
對偶聯產物進行SDS-PAGE電泳及紫外分光光度掃描，結果見圖1至圖3，當蛋白偶聯上一定數量的F2後，分子量會增大，在電泳圖上會產生滯後現象；在紫外分光掃描下，偶聯產物需既具備F2特徵吸收峰又具備BSA/OVA吸收峰(F2吸收峰為314nm，BSA/OVA為278nm)，結果表明偶聯成功。
然後偶聯產物用0.01mol/L pH7.4PBS進行透析，透析72h後，離心，-20℃保存備用。
2、免疫產蛋雞
①疫苗製備：將F2-BSA與佐劑(法國Seppic公司，MONTANIDETM ISA71VG)按質量比4:6混合乳化10min，製備成油乳劑疫苗，並加入體積濃度1％疊氮鈉溶液使之終濃度為萬分之一，搖勻備用。
②免疫接種：將上述所得疫苗，以腿部肌肉注射處於產蛋高峰期的20羽健康蛋雞，首免劑量為150μg/羽，每隔三周加強免疫一次，共兩次，劑量調整為100μg/羽，第三次免疫後一周開始收集雞蛋；此後當抗體滴度低於104時加強免疫，劑量為100μg/羽。同時採用相同程序對相同數量的雞接種PBS，作為陰性對照。
3、卵黃抗體提取
收集第三次免疫一周後所產的雞蛋，用10％聚維酮碘浸泡20min對蛋殼進行消毒，待蛋殼表面乾燥後，打蛋收集蛋黃；
採用濃鹽水法提純卵黃抗體，具體為：蛋黃與水按體積比1:7攪拌均勻後，調整pH至5.0，-20℃預凍72h，融化後採用布氏漏鬥進行抽濾，在抽濾液體中加入1.5mol/L氯化鈉，使之終濃度為8.8％，調整pH至4.0，室溫沉澱2h，5000rpm離心20min，棄上清，PBS懸浮沉澱，即為抗F2卵黃抗體。冷凍乾燥後將抗體乾粉凍存。
實施例2
本實施例為實施例1得到的抗F2卵黃抗體的檢測：
1、卵黃抗體純度分析
取10μl實施例1中純化的抗F2卵黃抗體，加入含有β巰基乙醇的蛋白電泳上樣緩衝液，通過12％SDS-PAGE電泳檢測其純度；凝膠用考馬斯亮藍染色。結果：顯示68kD和27kD兩條主帶，說明抗體純度高(圖3)。
2、卵黃抗體蛋白濃度測定
用Bradford蛋白濃度測定法測定實施例1中得到的抗F2卵黃抗體的濃度。結果：卵黃抗體含量為6mg/ml。
3、抗體滴度檢測(間接酶聯免疫實驗ELISA)
將F2-OVA用包被液(50mM碳酸鹽緩衝液，pH9.6)稀釋至2μg/ml，加100μl/孔到酶標反應板，4℃包被24h。將包被好的酶標板甩去孔內液體，加PBST洗滌液250μl/孔，重複洗滌2次，在吸水紙上拍幹，加入含5％脫脂奶粉的PBST封閉液，250μl/孔，放入溫箱內37℃封閉2h。重複洗滌步驟4次(下同)，洗滌後，用含5％脫脂奶粉的PBST將實施例1中得到的抗F2卵黃抗體進行不同倍數稀釋(1:5000、1:10000、1:20000、1:40000)，l00μl/孔，37℃作用1h，洗滌後，每孔加入用PBST稀釋好的酶標二抗(l:10000)100μl，37℃作用30min，洗滌後，加入底物50μl/孔，避光顯色10min，加1mol/L的硫酸50μl/孔終止液終止反應，在酶聯檢測儀上讀出OD450值，每個樣品每次平行做3孔，取平均值。判定標準：C＝AV陰性+3SD陰性，樣品值大於C即判為陽性。結果見表1，由表可見本發明抗F2毒素卵黃抗體平均效價高達1:40000，表明用醛縮法製備的免疫抗原能夠產生活性高的特異性抗體。
表1抗F2毒素IgY效價的檢測結果
4、抗體特異性評估
將F2毒素與卵黃抗體進行互作，然後評估F2毒素的含量，通過評測毒素含量判定抗體的有效吸附性能。
將F2毒素標準液(5mg/ml，美國Sigma公司)稀釋至1000ppb，取50μl毒素標準液，加入50μl實施例1中提取的IgY，對照為50μl毒素標準液，加50μlPBS，在25℃互作1h，然後採用Romer公司提供的檢測F2毒素試劑盒(AgraQuant Zearalenone Test Kit)檢測F2濃度，毒素標準曲線見圖5，檢測結果見表2，從表中可看出，與IgY互作後，樣品中毒素濃度大大下降，下降94.26％，表明抗體的特異性非常好，可為臨床飼料或食品中用於毒素防控提供參考。
表2 F2毒素與IgY互作後濃度評測
結合上述實驗結果，本發明方法與碳二亞胺法相比，優勢有：
1)採用醛縮法製備抗原產生的抗體效價高，F2毒素卵黃抗體平均效價高達1:40000，表明用醛縮法製備的免疫抗原能夠產生活性高的特異性抗體；
2)所產生的抗體吸附F2毒素的能力強，樣品中毒素濃度大大下降，下降94.26％，表明抗體的特異性非常好，可為臨床飼料或食品中用於毒素防控；
3)蛋黃中抗體水平高而且穩定，持續監測抗體水平，兩個月不免疫都能保持較高的的抗體水平，抗體效價達到1:40000。