食品及加工品中蘿蔔源性成分pcr檢測引物的製作方法
2024-02-29 16:23:15 1
專利名稱：食品及加工品中蘿蔔源性成分pcr檢測引物的製作方法
技術領域：
本發明屬於一種利用聚合酶鏈式反應技術對食品加工品中植物源成分一蘿蔔進行快速篩選與檢測的引物，蘿蔔源成分快速檢測具體的是針對蘿蔔特異性基因所用引物進行DNA檢查。應用該引物能夠擴增出食品及食品加工品中摻加的蘿蔔源性成分，反應特異性強、靈敏度高、操作簡便、重複性好。
背景技術：
蘿蔔是一種質脆味美的蔬菜，具有辛辣氣味，屬於十字花科。在食品未加工前，根據形態很容易將蘿蔔和其他物種進行鑑別，但食品在進行加工處理後中，往往失去可鑑別的形態特徵，一些企業為了節約成本以次充好甚至摻雜相近成分，經多次混合加工後消費者難以目測辨別食品是否已摻加了蘿蔔。食品中是否混有蘿蔔源性成分，沒有一個公認的判定方法或標準，降低消費者的生活質量。2010年9月，韓國駐華大使館向國家質檢總局有關部門通報了我國輸韓蒜泥製品中有摻雜蘿蔔原料進行加工的情況，輸韓蒜泥製品中有檢出蘿蔔成分摻假。為保障消費者權益，避免出現用蘿蔔進行摻假的情況，需要開發一種快速有效的檢測蘿蔔的方法。
發明內容
本發明的目的是針對蘿蔔中orf B基因設計一組特異性引物，建立一種快速篩選和檢測蘿蔔中基因成分PCR檢測方法，克服基於外部形態或蛋白的檢測方法在蘿蔔等深加工產品檢測中的局限性，為食品加工品中可能含蘿蔔的產品檢測提供有效工具，確保產品標籤的一致性，保護消費者的合法權益。本發明的主要原理為設計一組可以特異的識別蘿蔔序列的兩個引物，通過普通PCR反應在一小時內該循環反應可使靶DNA累積到IO9 IOltl拷貝。擴增結果經過瓊脂糖凝膠電泳結果判別。本發明涉及的PCR擴增檢測用的蘿蔔引物，其序列如下(I)上遊引物5，-TCACCTGGGCATTCTTTC-3 ；(2)下遊引物5』 -CTGACTTCGITCGTTAGAAG-3』 ；在實際應用中，上遊引物、下遊引物體積比為1 I。使用上述引物，檢測可能含有蘿蔔源性食品加工產品中蘿蔔成分的方法，依次包括下列步驟(1)-(3)(I)待檢樣品DNA的提取DNA提取可採用普通酚-氯仿提取法或使用相同提取方法的DNA提取試劑盒。(2) PCR 擴增A.在擴增反應管中加入在擴增反應管中加入dNTP 2 u LUOXBuffer 2. 5 U L ；10 u mol/L 上遊引物 0. 5 ii L、10 u mol/L 下遊引物 0. 5 y L、Taq 酶 0. 5 y L、待檢樣品 DNA2 ii L (約200ng)、ddH20 (滅菌雙蒸水)補足至總體積25u I,混勻；
B.在普通PCR儀中進行PCR反應35-40個循環，程序為940C 3min ； (94°C 30s ；58°C 30s ；) X35-40cycles ；(3)結果檢測通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶，製備濃度I %的瓊脂糖凝膠，按比例混勻電泳上樣緩衝液和PCR擴增產物，然後將混有上樣緩衝液的PCR產物，加入樣品孔中，並用DL2000Marker分子質量標記,進行電泳分析。電泳結束後,在凝膠成像系統的紫外投射光下觀察IOObp處是否有擴增儲預期的特異性條帶拍攝並記錄。
用PCR技術檢測某待測含蘿蔔樣品DNA，樣品的電泳圖譜。具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步說明。實施例按照以下程序進行檢測(I)待測可能含蘿蔔成分混合樣品DNA的提取A.稱取0. Ig樣品，轉至I. 5mL離心管中。加入600 U L預熱的裂解緩衝液，輕輕混勻後，65°C水浴保溫IOmin ；B.在管中加入等體積酚/氯仿600 u L，上下顛倒充分混勻，抽提2min ；C. 12000g離心5min,吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉澱液，混勻，常溫放置IOmin後，12000g離心5min,去上清,保留沉澱；D.在沉澱中加入60 ii L RNA酶，37°C放置2min後，用槍頭將其充分混勻，於37°C溶解沉澱，5min後加入300 u L緩衝液,上下顛倒混勻10次；E.取出離心柱，將離心柱放置在I個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加A 200 u L洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重複此步驟一次；G.在離心柱中加入200ii L70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重複此步驟一次；H. 12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；I.將離心柱放置在一個新的I. 5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50ii L洗脫緩衝液，37°C放置2min後，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作PCR反應的模板。(2)待測含蘿蔔成分混合樣品PCR擴增A.在擴增反應管中加入 dNTP 2 U LUOXBuffer 2. 5 ii L ;10 ii mol/L 上遊弓丨物 0. 5 ii LUO u mol/L 下遊引物 0. 5 y L、Taq 酶 0. 5 y L、待檢樣品 DNA2 y L(約 200ng)、ddH20(滅菌雙蒸水)補足至總體積25 u 1，混勻；B.在普通PCR儀中進行PCR反應35_40個循環程序為940C 3min ； (94°C 30s ；58°C 30s ；) X35-40cycles ；(3)結果檢測
根據濃度約I %的瓊脂糖電泳條帶進行判斷，待測樣品的擴增條帶片段大小在lOObp，陽性對照和空白對照結果正常 ，判斷為樣品中檢出蘿蔔基因。
權利要求
1. 一種蘿蔔源性成分快速檢測用的上遊引物和下遊引物，其特徵在於上遊引物序列 rad F :5，-TCA CCT GGG CAT TCT TTC-3，；下遊引物序列 rad R:5，-CTG ACT TCG TTC GTTAGAAG-3』。
全文摘要
本發明屬於蘿蔔源性成分基因快速篩查與檢測技術，具體地是用於檢測蘿蔔基因orfB片段的引物組。本發明針對orfB基因根據其保守區，設計特異性引物。使用該對引物採用PCR擴增技術，可快速、靈敏、特異地檢測蘿蔔源性基因，從而篩選產品中是否含食品及加工品中是否含有植物源成分蘿蔔。該引物也可以試劑盒的形式和其他試劑一起提供，用於核酸擴增反應。該法操作簡便、重複性好。
文檔編號C12N15/11GK102732611SQ201210142309
公開日2012年10月17日 申請日期2012年5月1日 優先權日2012年5月1日
發明者劉彩霞, 孫敏, 徐彪, 林超, 梁成珠, 高宏偉 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心