一種以銀納米線為基底的螢光納米溫度計及其製備方法與流程
2024-03-29 08:42:05 2
本發明涉及納米溫度計領域。更具體地，涉及一種以銀納米線為基底的螢光納米溫度計及其製備方法。
背景技術：
溫度作為一個重要的參數，對很多化學反應和生物過程具有調控作用。準確測量微小體系的溫度，對調控微化學反應和從細胞水平認知生命過程具有重要意義。常用的溫度計(如熱耦溫度計)由於空間解析度低等問題，使其不能滿足微小體系(如細胞內特定區域)內溫度的測定。隨著納米材料製備方法的完善和納米技術的不斷發展，納米溫度計已被廣泛研究(Qi,Li.Surface-Modified Silicon Nanoparticles with Ultrabright Photoluminescence and Single-Exponential Decay for Nanoscale Fluorescence Lifetime Imaging of Temperature.Journal of the American Chemical Society,2013,135:10372-14927)。這些納米溫度計大都是以納米顆粒為基底對溫度進行測量，納米顆粒在進入微小體系如細胞時通過被動擴散，或者需要靶向性修飾進入細胞特定部位。一維納米材料由於可以藉助微操作插入特定微小體系(如細胞特定部位)(Junho,Lee.Quantitative Probing of Cu2+Ions Naturally Present in Single Living Cells.Advanced Materials,2016,(28):4071-4076)實現對微小體系的主動檢測，使其在微小體系溫度計研究中有明顯優勢。
因此，發展基於一維納米材料的溫度計對微小體系溫度的準確檢測具有重要意義。
技術實現要素：
本發明的一個目的在於提供一種以銀納米線為基底的螢光納米溫度計，可用於微小體系溫度的檢測。
本發明的另一個目的在於提供一種上述螢光納米溫度計的製備方法。
為達到上述目的，本發明採用下述技術方案：
一種以銀納米線為基底的螢光納米溫度計，所述螢光納米溫度計以銀納米線為基底，銀納米線表面組裝帶有螢光分子的特定DNA片段和輔助鏈T的一維納米溫度計。
進一步，所述特定DNA片段的序列為3』端修飾有-(CH2)3-SH的ATCTAATCATTATTGTTTTTTTTTTTTTTTACTATTATGTTTAGATTTTTTTTTTT(如SEQ ID No.1所示)(即ATCTAATCATTATTGTTTTTTTTTTTTTTTACTATTATGTTTAGATTTTTTTTTTT-(CH2)3-SH)。
進一步，所述螢光分子為5』TEXAs-red。
進一步，所述的輔助鏈T的序列為3』端修飾有-(CH2)3-SH的TTTTTTTTTT(如SEQ ID No.2所示)(即TTTTTTTTTT-(CH2)3-SH)。
進一步，所述銀納米線的直徑為100-200nm，長度為50-100μm。
一種以銀納米線為基底的螢光納米溫度計的製備方法，包括以下步驟：
(1)利用多元醇法製備銀納米線
a、配製0.1M AgNO3的溶液，0.15M PVP溶液，0.3mM FeCl3溶液，以上溶劑均為乙二醇；
b、將1ml 0.3mM FeCl3溶液加入到9ml 0.15M PVP溶液中，混合均勻後滴加入劇烈攪拌的10ml 0.1M AgNO3的溶液中；待反應渾濁後停止攪拌(約4h)轉入高壓釜中保持160℃3小時；將產物取出，分別用丙酮、乙醇和水洗滌，得銀納米線；
(2)將帶有螢光分子的特定DNA片段(20μL，100μM)和輔助鏈T(10μL，100μM)與還原劑(30μL，100μM)混合孵育1-1.5小時，進行還原反應，以打開DNA序列中的二硫鍵；將還原好的特定DNA片段和輔助鏈T與2-3mg/ml的銀納米線混合，使得還原好的特定DNA片段和輔助鏈T的濃度分別為2μM和1μM，震蕩孵育10-12小時後加入1-2M NaCl溶液，使體系達到0.1M NaCl，並繼續孵育10-12小時；得到的產物用緩衝液洗滌三次，即得。
進一步，將以銀納米線為基底的螢光納米溫度計分散在測試緩衝液(0.1M NaCl,10mM PB,pH＝7.4)中，在螢光光譜儀上進行測試，激發波長為585nm，發射波長為612nm。
進一步，所述還原劑為pH＝5.2的三(2-甲醯乙基)膦鹽酸鹽的醋酸緩衝液。
進一步，所述緩衝液為0.1M NaCl,10mM PB,pH＝7.4。
本發明以銀納米線為基底的螢光納米溫度計利用一定溫度下，DNA序列解鏈改變發光分子與銀納米線之間的距離，調控銀納米線與螢光分子之間的能量轉移，利用螢光強度的變化實現銀納米線對溫度的檢測。
本發明的有益效果如下：
1、本發明銀納米線具有製備簡單、容易表面功能化、對螢光分子具有很好的猝滅效應的特點，使其在作為一維納米材料溫度計的基底中有很好的前景。
2、本發明以銀納米線為基底，通過對溫度有響應的特定DNA片段將螢光分子組裝在銀納米線表面，構建了基於銀納米線的螢光溫度計，該溫度計可用於微小體系溫度的檢測，進一步發展有望用於細胞特定部位溫度的檢測。
附圖說明
下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步詳細的說明。
圖1示出基於銀納米線的螢光納米溫度計的結構以及工作原理示意圖；
圖2示出銀納米線的掃描電鏡圖；
圖3示出基於銀納米線的螢光納米溫度計螢光強度隨溫度的變化，溫度變化範圍為20℃-50℃；
圖4示出基於銀納米線的螢光納米溫度計螢光強度隨溫度的變化，溫度變化範圍為30℃-35℃，間隔為0.5℃；
圖5示出基於銀納米線的螢光納米溫度計螢光強度隨溫度循環的變化，溫度變化為20℃到50℃；
圖6示出螢光分子-DNA片段在沒有銀納米線存在時同樣條件下螢光強度隨溫度的變化，溫度變化範圍為20℃-50℃。
具體實施方式
為了更清楚地說明本發明，下面結合優選實施例和附圖對本發明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領域技術人員應當理解，下面所具體描述的內容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發明的保護範圍。
實施例1以銀納米線為基底的螢光納米溫度計的製備方法
(1)利用多元醇法製備銀納米線
a、配製10ml 0.1M AgNO3的溶液，9ml 0.15M PVP溶液，1ml 0.3mM FeCl3溶液，以上溶劑均為乙二醇；
b、將1ml 0.3mM FeCl3溶液加入到9ml 0.15M PVP溶液中，混合均勻後滴加入劇烈攪拌的10ml 0.1M AgNO3的溶液中；待反應渾濁後停止攪拌(約4h)轉入高壓釜中保持160℃3小時；將產品取出，分別用丙酮、乙醇和水洗滌，洗滌乾淨之後保存在酒精中。製備得到的銀納米線的掃描電子顯微鏡照片如圖2所示。
(2)將帶有螢光分子(5』TEXAs-red)的特定DNA片段(即ATCTAATCATTATTGTTTTTTTTTTTTTTTACTATTATGTTTAGATTTTTTTTTTT-(CH2)3-SH)(20μL，100μM)和輔助鏈T(即TTTTTTTTTT-(CH2)3-SH)(10μL，100μM)與三(2-甲醯乙基)膦鹽酸鹽的醋酸緩衝液(PH＝5.2)(30μL，100μM)混合孵育1小時，進行還原反應，以打開DNA序列中的二硫鍵；將還原好的特定DNA片段和輔助鏈T與3mg/ml的銀納米線混合，使得特定DNA片段和輔助鏈T的濃度分別為2μM和1μM，震蕩孵育12小時後，加入適量的1M NaCl溶液，使體系達到0.1M NaCl，並繼續孵育12小時；所得產物用緩衝液(0.1M NaCl,10mM PB,pH＝7.4)洗滌三次，即得以銀納米線為基底的螢光納米溫度計。以銀納米線為基底的螢光納米溫度計的原理為：利用一定溫度下，DNA序列解鏈改變發光分子與銀納米線之間的距離，調控銀納米線與螢光分子之間的能量轉移，利用螢光強度的變化實現銀納米線對溫度的檢測(如圖1所示)。
(3)將步驟(2)所得的以銀納米線為基底的螢光納米溫度計分散在測試緩衝液(0.1M NaCl,10mM PB,pH＝7.4)中，在螢光光譜儀上進行測試，激發波長為585nm，發射波長為612nm。測試範圍為20-50℃，溫度間隔為5℃，結果如圖3所示，從圖中可以看出：從20度升溫到50度，再從50度降溫到20度，升溫和降溫得到的相對螢光強度變化趨勢一致，說明以銀納米線為基底的螢光納米溫度計有很好的可逆性。
實施例2以銀納米線為基底的螢光納米溫度計的製備方法
(1)利用多元醇法製備銀納米線。
a、配製10ml 0.1M AgNO3的溶液，9ml 0.15M PVP溶液，1ml 0.3mM FeCl3溶液，以上溶劑均為乙二醇；
b、將1ml 0.3mM FeCl3溶液加入到9ml 0.15M PVP溶液中，混合均勻後滴加入劇烈攪拌的10ml 0.1M AgNO3的溶液中；待反應渾濁後停止攪拌(約4h)轉入高壓釜中保持160℃3小時；將產品取出，分別用丙酮、乙醇和水洗滌，洗滌乾淨之後保存在酒精中；
(2)將帶有螢光分子(5』TEXAs-red)的特定DNA片段(即ATCTAATCATTATTGTTTTTTTTTTTTTTTACTATTATGTTTAGATTTTTTTTTTT-(CH2)3-SH)(20μL，100μM)和輔助鏈T(即TTTTTTTTTT-(CH2)3-SH)(10μL，100μM)與三(2-甲醯乙基)膦鹽酸鹽的醋酸緩衝液(PH＝5.2)(30μL，100μM)混合孵育1.5小時，進行還原反應，以打開DNA序列中的二硫鍵；將還原好的特定DNA片段和輔助鏈T與2mg/ml的銀納米線混合，使得特定DNA片段和輔助鏈T的濃度分別為2μM和1μM，震蕩孵育10小時後，加入適量的2M NaCl溶液，使體系達到0.1M NaCl，並繼續孵育11小時；所得產物用緩衝液(0.1M NaCl,10mM PB,pH＝7.4)洗滌三次，即得到以銀納米線為基底的螢光納米溫度計。
(3)將步驟(2)所得的以銀納米線為基底的螢光納米溫度計分散在測試緩衝液(0.1M NaCl,10mM PB,pH＝7.4)中，在螢光光譜儀上進行測試，激發波長為585nm，發射波長為612nm。測試範圍為30-35℃，溫度間隔為0.5℃，結果如圖4所示，從圖中可以看出：以銀納米線為基底的螢光納米溫度計在該溫度範圍內相對螢光強度與溫度呈很好的線性響應。
實施例3以銀納米線為基底的螢光納米溫度計的製備方法
(1)利用多元醇法製備銀納米線。
a、配製10ml 0.1M AgNO3的溶液，9ml 0.15M PVP溶液，1ml 0.3mM FeCl3溶液，以上溶劑均為乙二醇；
b、將1ml 0.3mM FeCl3溶液加入到9ml 0.15M PVP溶液中，混合均勻後滴加入劇烈攪拌的10ml 0.1M AgNO3的溶液中；待反應渾濁後停止攪拌(約4h)轉入高壓釜中保持160℃3小時；將產品取出，分別用丙酮、乙醇和水洗滌，洗滌乾淨之後保存在酒精中；
(2)將帶有螢光分子(5』TEXAs-red)的特定DNA片段(即ATCTAATCATTATTGTTTTTTTTTTTTTTTACTATTATGTTTAGATTTTTTTTTTT-(CH2)3-SH)(20μL，100μM)和輔助鏈T(即TTTTTTTTTT-(CH2)3-SH)(10μL，100μM)與三(2-甲醯乙基)膦鹽酸鹽的醋酸緩衝液(PH＝5.2)(30μL，100μM)混合孵育1.2小時，進行還原反應，以打開DNA序列中的二硫鍵；將還原好的特定DNA片段和輔助鏈T與2.5mg/ml的銀納米線混合，使得特定DNA片段和輔助鏈T的濃度分別為2μM和1μM，震蕩孵育11小時後，加入適量的2M NaCl溶液，使體系達到0.1M NaCl，並繼續孵育10小時；所得產物用緩衝液(0.1M NaCl,10mM PB,pH＝7.4)洗滌三次，即得到以銀納米線為基底的螢光納米溫度計。
(3)將步驟(2)所得的以銀納米線為基底的螢光納米溫度計分散在測試緩衝液(0.1M NaCl,10mM PB,pH＝7.4)中，在螢光光譜儀上進行測試，激發波長為585nm，發射波長為612nm。測試範圍為20-50℃，循環多次，結果如圖5所示。同時，測試了沒有銀納米線時DNA序列的螢光隨溫度的變化，結果如圖6所示。結果表明：以銀納米線為基底的螢光納米溫度計有很好的重複性，其螢光隨溫度變化主要來自於銀納米線與DNA序列的作用，溫度升高抑制了銀納米線與TEXAs-red之間的能量轉移，使螢光增強。
顯然，本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而並非是對本發明的實施方式的限定，對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這裡無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬於本發明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處於本發明的保護範圍之列。
SEQUENCE LISTING
中國科學院理化技術研究所
一種以銀納米線為基底的螢光納米溫度計及其製備方法
JLC16I0735E
2
PatentIn version 3.3
1
56
DNA
人工合成的特定DNA片段
1
atctaatcat tattgttttt tttttttttt actattatgt ttagattttt tttttt 56
2
10
DNA
人工合成的輔助鏈T
2
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