具有改良的氮利用和逆境耐性的植物的製作方法

2024-04-05 06:02:05

專利名稱：：具有改良的氮利用和逆境耐性的植物的製作方法
技術領域：
：本發明一般性涉及具有改良的氮利用和逆境耐性的植物，更特別涉及用改良逆境耐性和氮攝取、代謝或者這二者的基因轉化的玉米植物。
背景技術：
：植物在其營養生長和生殖生長階段需要氮。氮通過土壤礦化、應用氮肥或者這二者而可為植物所利用。然而估計應用於農作物的50%-70%的氮從植物-土壤系統中喪失[Peoples，M.B.etal.,"MinimizingGaseousLossesofNitrogen,"InNitrogenFertilizerintheEnvironment(Bacon,P.E.,ed.)MarcelDekker,pp.565-606(1995)]。氮是最昂貴的植物營養素之一，氮肥不總是可以以合理成本獲得且氮肥的過量應用可導致徑流中的汙染問題。玉米是通常需要氮肥以發揮其遺傳潛力的農業重要植物的實例。發明概述本發明涉及轉基因植物，該植物具有增加的氮利用效率、逆境耐性或者這二種性質，其已經使用包括調節植物中氮利用的核酸序列的新載體構建體轉化。本發明還涉及用以轉化植物的分離的載體以及涉及用於檢測轉化的植物中感興趣的核苷酸序列的表達的抗體。本發明還涉及在植物中表達相應於調節植物中氮利用的核酸序列的核酸分子的方法。特別地，用於轉化植物的載體已經使用選自如下的核苷酸序列構建SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36和SEQIDNO:38以及其變體、片段和互補序列。這些載體包含5，DNA啟動子序列和3，終止子序列，其中所述核酸序列、DNA啟動子序列和終止子序列是可操縱地連接的，以允許所述核苷酸序列轉錄。在一些實施方案中，所述啟動子序列可以是組成型植物啟動子或者組織特異性啟動子。本發明還包括多克隆抗體，包含由選自如下的核苷酸序列編碼的多肽的多克隆抗體SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36以及SEQIDNO:38。本發明還包括用選自如下的一或多個核苷酸序列轉化的植物SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36和SEQIDNO:38以及其變體和片段。所述植物選自水稻、玉米、大豆、芸苔(canola)、小麥、苜蓿、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、甘薯、豆(bean)、豌豆(pea)、馬鈴薯、油菜(oilseedrape)、高粱、飼草(foragegrass)、牧草(pasturegrass)、草坪草以及甘蔗。本發明還包括這種植物的組成部分、從這種植物產生的植物種子以及用本發明的載體構建體轉化的植物種子。本發明還包括用選自如下的一或多個核苷酸序列轉化的宿主細胞:SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36以及SEQIDNO:38。所述宿主細胞可以是細菌細胞或者植物細胞。本發明還包括在植物中表達由氮調節的核酸分子的方法，所述方法包括提供用本發明的載體構建體轉化的轉基因植物或者植物種子，以及在有效條件下生長所述轉基因植物或者由所述轉基因植物種子長成的植物，所述條件是在所述轉基因植物或者由所述轉基因植物種子長成的植物中表達所述核酸分子的條件。轉基因植物的生長有效增加所述轉基因植物或者由所述轉基因植物種子長成的植物的氮攝取，和/或增加所述轉基因植物或者9由所述轉基因植物種子長成的植物的氮利用效率。本發明還包括前述方法，其中提供轉基因植物或者轉基因植物種子。本發明還包括前述方法，其中所述植物選自水稻、玉米、芸苔、小麥、苜蓿、大麥、黑麥、棉花、向曰葵、花生、甘薯、豆、豌豆、馬鈴薯、油菜、高粱、飼草、牧草、草坪草以及甘蔗。本發明還包括通過在植物中表達由氮調節的核酸分子而改良植物逆境耐性的方法，所述方法包括提供用本發明的載體構建體轉化的轉基因植物或者植物種子並且在有效條件下生長所述轉基因植物或者由所述轉基因植物種子長成的植物，所述條件是在所述轉基因植物或者由所述轉基因植物種子長成的植物中表達所述核酸分子的條件。本發明還包括通過在植物中表達由氮調節的核酸分子而改變植物形態學的方法，所述方法包括提供用本發明的載體構建體轉化的轉基因植物或者植物種子並且在有效條件下生長所述轉基因植物或者由所述轉基因植物種子長成的植物的步驟，所述條件是在所述轉基因植物或者由所述轉基因植物種子長成的植物中表達所述核酸分子的條件。本發明還包括載體構建體，其包含編碼選自SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37和SEQIDNO:39的胺基酸序列的核苷酸序列、5'DNA啟動子序列和3'終止子序列，其中所述核苷酸序列、DNA啟動子序列以及終止子序列可操縱地連接以允許所述核苷酸序列轉錄。本發明還包括包含由植物中氮調節的核苷酸序列的載體構建體，其中所述核苷酸序列選自核苷酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36和SEQIDNO:38;與如下核苷酸序列具有至少95%序列相同性的核苷酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36或者SEQIDNO:38，其中所述核苷酸序列由植物中氮調節；編碼選自如下胺基酸序列的核苷酸序列SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37和SEQIDNO:39;以及編碼與如下胺基酸序列具有至少95%序列相同性的胺基酸序列的核苷酸序列SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37或者SEQIDNO:39，其中所述核苷酸序列由植物中氮調節；其中所述構建體進一步包含5'DNA啟動子序列和3'終止子序列，其中所述核苷酸序列、DNA啟動子序列以及終止子序列是可操縱地連接的以允許所述核苷酸序列的轉錄。優選實施方案詳述更有效利用氮的植物品種的開發將降低氮的過量施用、節約農場主的生產成本、幫助不能獲得肥料的發展中國家的農場主獲益並且降低與應用過量氮肥相關的汙染。一種已經用於開發具有改良的氮利用的植物品種的方法依賴於常規的植物育種技術。需要開發更有效地吸收和利用氮的植物栽培種。植物學家已經採用簡略語氮利用效率(NUE)，且已經開發了各種測量和評估NUE的方法[Craswdl，E.T.andGodwin,D,C.(1984)Theefficiencyofnitrogenfertilizersappliedtocerealsgrownindifferentclimates.InAdvancesinPlantNutrition(Vol.1)(Tinker,P.B.andLauchli,A.,eds)，pp.1—55,PraegerPublishers;Steenbjerg,RandJakobsen,S.T.(1963)Plantnutritionandyieldcurves.SoilSci.95,69-90;Siddiqi,M.Y.andGlass,D.M.(1981)Utilizationindex:amodifiedapproachtotheestimationandcomparisonofnutrientutilizationefficiencyinplants.J.PlantNutr.4,289—302;Moll，R.H.etal.(1982)Analysisandinterpretationoffactorswhichcontributetoefficiencyofnitrogenutilization.Agron.J.74，562—564]。在定義中有一些差異。一些定義基於總生物量，而其它定義基於產生的穀物的重量。另一組定義使用從土壤中提取氮的效率加以描述。用於改良穀物產量所應用的氮的效率可以通過農學利用率(AE)即生理學效率和利用效率的乘積或者攝取效率與利用效率的乘積NUEg進行測量。其它定義將生理學因素考慮在內。如在本說明書中所用，術語氮利用效率或者NUE被定義為包括在同化途徑中任何主要氮代謝庫大小的可測量改變(例如可包括如下一或多項的可測量改變硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨、穀氨酸、天冬氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、賴氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸、酪氨酸、植物部分的總蛋白質含量、植物部分的總氮含量和/或葉綠素含量)，或者植物示出在較低的施氮肥水平提供相同或提高的產量，或者植物示出當與未用本發明的氮調節的核酸構建體轉化的植物相比時在相同施氮肥水平提供提高的產量。"可測量改變"可包括氮同化途徑的任何成分(代謝庫)的量的增加或降低。改變可包括所述途徑中一或多個代謝庫的降低或增加，或者一或多個庫的降低伴隨一或多個其它庫的增加，例如當氮同化途徑中一個中間體被用於產生另一個中間體或者所述途徑的產物時。例如，在穀氨酸向穀氨醯胺的轉化中，穀氨酸的水平可降低而穀氨醯胺的水平可增加。因此，雖然不受任何特別的理論或機制的束縛，一或多個這些庫中的任何改變均提示氮被植物更有效地利用。氮利用效率的增加可以與同化途徑中任何主要氮代謝庫大小中大約5%、大約10°/。、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、大約200%或者更高的可測量改變相關。在一個實施方案中，本發明的轉基因植物當與不含本發明的氮調節序列的植物相比時從環境攝取增加的氮。"氮調節序列"是指應答暴露於氮而被調節(例如增加或降低，或者上調或下調)的核苷酸或胺基酸序列，"調節氮利用的核苷酸序列"是指編碼與氮代謝相互作用的蛋白質的核苷酸序列。本發明進一步提供了通過在植物中表達一或多個氮調節核苷酸序列而改良植物逆境耐性的方法。在一個實施方案中，所述氮調節核苷酸序列是SEQIDNO:2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36或38，或者其變體和片段。在另一個實施方案中，所述氮調節核苷酸序列是編碼SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37或39的核苷酸序列，或者其變體和片段。如本文所用，術語"逆境(stress)"或"逆境條件(stresscondition)"是指植物、植物細胞等暴露於對植物的代謝、生長、發育、繁殖和/或存活(統稱"生長")具有不利作用的物理或化學劑或者條件。逆境可以通過例如環境因素如水(例如灌溉、乾旱、脫水)、厭氧條件(例如低水平氧)、異常滲透條件、鹽度或溫度(例如高熱/溫熱、寒冷、嚴寒、霜凍)、營養素缺乏如氮缺乏或者暴露於汙染物或者通過激素、第二信使或者其它分子而施加於植物。厭氧逆境例如是由於足以產生逆境應答的氧水平降低(低氧或缺氧)。灌溉逆境可以是由於植物、植物部分、組織或分離的細胞在液體介質中長期或短暫浸泡所致，例如在季風、多雨季節、洪水或者過量灌溉植物等期間發生。寒冷逆境或者熱逆境可以是分別由於溫度從特定植物物種的最佳生長溫度範圍降低或升高而發生。本領域技術人員易於確定且已知這種最佳生長溫度範圍。脫水逆境可以通過細胞、組織、器官或者完整植物的水分喪失、膨壓降低、或者水含量降低而引起。乾旱逆境可由於水的匱乏或者供給細胞、組織、器官或生物體的水減少而引起或者與之相關。鹽逆境可以與細胞的胞內或胞外環境的滲透壓波動相關或者由其引起。滲透逆境可以與例如植物細胞的胞內或胞外環境中分子濃度的改變相關或者由其引起，特別是在所述分子不能穿過植物細胞膜而隔離(partitioned)的情況中。逆境耐性的改良可以在指定逆境條件下對植物性能進行任何定量或定性測量而評定並且與在相同逆境條件下生長的未用本發明的氮調節序列轉化的植物的性能進行對比。因此，所述植物可表現為改良的氮含量、改變的胺基酸或蛋白質組成、健壯的生長特性、增加的營養體產量(vegetativeyield)或者更好的種子產量和品質。這些植物可以通過檢査如下任何參數而鑑別l)生長速度，根據溼重或乾重的增長速度測量；2)成熟植物的營養體產量，根據鮮重或乾重測量；3)種子或果實產量；4)種子或果實重量；5)植物的總氮含量；6)果實或種子的總氮含量；7)植物的游離胺基酸含量；8)果實或種子的游離胺基酸含量；9)植物的總蛋白質含量；以及IO)果實或種子的總蛋白質含量。檢測這些參數的程序和方法為本領域技術人員所熟知。這些方法可包括測量酶/蛋白質水平的酶測定法和免疫測定法；測量各種植物組織的胺基酸組成、游離胺基酸庫或者總氮含量的測定法；根據鮮重隨著時間的增加測量生長速度；或者根據總乾重和/或總種子重量測量植物產裡。細菌或植物細胞的轉化本發明提供了新的核苷酸序列，其調節植物中氮利用效率。本發明還提供了本發明的氮調節蛋白質的胺基酸序列。可以對本發明的氮調節核苷酸序列進行修飾以獲得或者增強在植物細胞中的表達。本發明的氮調節序列可以提供在表達盒中以在感興趣的植物中表達。"植物表達盒"包括能導致在植物細胞中從開放讀框中表達蛋白質的DNA構建體。所述盒包括5'-3'轉錄方向的與本發明的DNA序列可操縱地連接的轉錄起始區(即啟動子)以及在植物中起作用的轉錄和翻譯終止區(即終止區)。所述盒可另外含有被共轉化進生物體中的至少一個其它基因，如選擇標記基因。或者，所述其它基因可以提供在多個表達盒上。這種表達盒具有多個限制位點，用以插入氮調節序列使之在調節區的轉錄調節下。"啟動子"是指發揮指導下遊編碼序列轉錄功能的核酸序列。啟動子與其它轉錄和翻譯調節核酸序列(也稱作控制序列)在一起是感興趣的DNA序列表達所必需的。優選地，啟動子是已知在導入了本發明的核苷酸序列的生物體中剌激轉錄的啟動子。啟動子與植物宿主和/或本發明的DNA序列可以是天然的或者類似的，或者是外源或異源的。另外，啟動子可以是天然序列或者是合成序列。在啟動子與植物宿主是"天然"或者"同源"的情況中，所述啟動子是指在導入所述啟動子的天然植物中發現的啟動子。在啟動子與本發明的DNA序列是"外源"或者"異源"的情況中，所述啟動子是指與本發明的DNA序列可操縱地連接的非天然或非自然發生的啟動子。"異源"通常是指核酸序列與其存在於之中的細胞或者天然基因組的一部分不是內源的核酸序列，但是已經通過感染、轉染、顯微注射、電穿孔、顯微轟擊(microprojection)等技術加入細胞中。"可操縱地連接"是指啟動子與第二個序列之間的功能性連接，其中所述啟動子序列起始並介導相應於第二個序列的DNA序列的轉錄。通常"可操縱地連接"是指連接的核酸序列是鄰近的，且在需要連接兩個蛋白質編碼區的情況中是鄰近並且位於相同讀框中。在一個實施方案中，啟動子是組成型啟動子。用於植物中的合適的組成型啟動子包括來自植物病毒的啟動子，如花生褪綠條死病花椰菜花葉病毒(chloroticstreakcaulimovirus，PC1SV)啟動子(美國專利No.5，850，019);花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子(Odell"a/.(1985)Atow313:810-812);小球藻病毒甲基轉移酶基因啟動子(美國專利No.5，563,328)以及玄參花葉病毒(FMV)全長轉錄啟動子(美國專利No.5,378,619);如水稻肌動蛋白這樣的基因啟動子(McElroy"a/.(1990)屍/a"fCe//2:163-171);遍在蛋白基因啟動子(ChristensenWa/.(1989)屍/a"fA/o/.12:619-632和ChristensenWa/.(1992)屍/a^M/.所o/.18:675-689)，包括TrpPro5啟動子(美國專利申請No.10/377,318;2005年3月16日提請)；pEMU啟動子(LastWa/.(1991)TTzeoTi^;/.81:581-588);MAS啟動子(Velten"(1984)￡M50/3:2723-2730);玉米H3組蛋白啟動子(Lepetitefa/.(1992)Mo/.Ge".231:276-285和AtanassovaWa/.(1992)戶te/2(3):291誦300);歐洲油菜(Brassicanapus)ALS3(PCT申請WO97/41228);以及各種農桿菌基因的啟動子(見美國專利No.4,771,002、5,102,796、5,182,200和5,428,147)。在另一個實施方案中，啟動子是組織特異性啟動子。常用的組織特異性啟動子的列表可見於Moore"a/.(2006)屍/a"Z/45(4):651-683中的綜述，該文獻以其全部內容併入本文作參考。這種構建體通常也含有5'和3'非翻譯區。這種構建體可含有"信號序列"或者"前導序列"以促進感興趣的肽的共翻譯或者翻譯後轉運至一定的胞內結構如葉綠體(或者其它質體)、內質網或者高爾基體或者被分泌。例如，基因可以被工程化為含有信號肽以促進肽轉移進內質網中。"信號序列"是指已知或者推測導致共翻譯或翻譯後的肽轉運穿過細胞膜的序列。在真核細胞中，這典型包括分泌進高爾基體中，一些導致糖基化。"前導序列"是指這樣的任何序列，當其被翻譯時導致胺基酸序列足以觸發肽鏈共翻譯轉運至亞細胞細胞器。因此，其包括通過進入內質網、進入液泡、質體包括葉綠體、線粒體等而靶向轉運和/或糖基化的前導序列。。也可以優選工程化植物表達盒使其含有內含子，由此內含子的mRNA加工為表達所需。"3'非翻譯區"是指位於編碼序列下遊的核苷酸序列。多腺苷酸化信號序列及編碼能影響mRNA前體3'末端添加聚腺苷酸段(tracts)的調節信號的其它序列是3'非翻譯區。"5'非翻譯區"是指位於編碼序列上遊的核苷酸序列。其它上遊或下遊非翻譯元件包括增強子。增強子是增強啟動子區域表達的核苷酸序列。增強子為本領域所熟知，包括但不限於SV40增強子區域和35S增強子元件。終止區與轉錄起始區可以是天然的，可以與本發明的氮調節序列是天然的，或者可以衍生自另一來源。實用的終止區可得自根癌農桿菌(A^me/⑧/era)的Ti-質粒，如章魚鹼合酶及胭脂氨酸合成酶終止區，或者馬鈴薯蛋白酶抑制劑II序列(PinII)，如LiuWa/.(2004)5/oc&附所o//^57"36(8):553-558所述。也見於GuerineauWa/.(1991)Mo/.262:141-144;Proudfoot(1991)CW/64:671-674;Sanfacon(1991)Ge"ay15Dev.5:141-149;MogenW(1990)屍toCW/2:1261-1272;MunroeW(1990)91:151-158;Ballas&"(1989)ATwc/eici飢17:7891-7903;以及Joshi""/.(1987)A^c/ez'cA^ias.15:9627-9639。在適當情況下，可以優化基因以增加在轉化的宿主細胞中的表達。也就是說，基因可以通過使用改良表達的宿主細胞優選密碼子合成，或者可以通過使用宿主優選的密碼子使用頻率的密碼子合成。通常基因的GC含量將增加。見例如CampbellandGowri(1990)屍/""f屍w》/.92:1-11論述的宿主優選的密碼子使用。本領域已知合成宿主優選的基因的方法。見例如美國專利No.6,320,100、6，075，185、5,380,831和5,436,391，美國公布的申請No.20040005600和20010003849，以及Murray"d(1989)A^/c/e/c爿"A17:477-498，所述文獻在此併入本文作參考。在一個實施方案中，感興趣的核酸耙向葉綠體以表達。在這種方式中，在感興趣的核酸未直接插入葉綠體中時，表達盒將另外含有編碼轉運肽的核酸以指導感興趣的基因產物到達葉綠體。這種轉運肽為本領域所已知。見例如VonHeijne"(1991)P/a"fMo/.腸/.鄉9:104-126;Clark"a/.(1989)/C/zem.264:17544-17550;Della-Cioppa"a/.(1987)屍/"W■P/>\s/o/.84:965-968;Romera/.(1993)5z.o//y^.ies.Cowwww.196:1414-1421;以及ShahWa/.(1986)>SWe"ce233:478-481所述。被靶向於葉綠體的感興趣的核酸可以優化為在葉綠體中表達，以解決在植物細胞核與該細胞器之間密碼子使用中的差異。在這種方式中，感興趣的核酸可以通過使用葉綠體優選密碼子合成。見例如在此併入作參考的美國專利No.5,380,831所述。典型地，這種"植物表達盒"被插入"植物轉化載體"中。"轉化載體"是指細胞有效轉化必需的DNA分子。這種分子可以由一或多個表達盒組成，且可以組織成一個以上的"載體"DNA分子。例如二元載體是這樣的植物轉化載體，其利用兩個非鄰近的DNA載體編碼植物細胞轉化所有必需的順式和反式作用功能(HellensandMullineaux(2000)rw"&z'wP/aW5Wewce5:446-451)。"載體"是指設計為在不同宿主細胞之間轉移的核酸構建體。"表達載體"是指在外源細胞中具有摻入、整合及表達異源DNA序列或片段能力的載體。這種植物轉化載體可以包含為實現植物轉化所需的一或多個DNA載體。例如，本領域通常利用包含一個以上連續DNA節段的植物轉化載體。本領域通常將這些載體稱作"二元載體"。二元載體以及具有輔助質粒的載體最常用於農桿菌介導的轉化，其中實現有效轉化所需的DNA節段的大小和複雜性非常大，且有利於區別各個DNA分子的功能。二元載體典型含有質粒載體，其含有T-DNA轉移所需的順式作用序列(如左邊界和右邊界)、被工程化能在植物細胞中表達的選擇標記，以及"感興趣的核苷酸序列"(被工程化能在希望產生轉基因植物的植物細胞中表達的核苷酸序列)。在這個質粒載體上還存在細菌複製所需的序列。順式作用序列的排列方式是使得有效轉移進植物細胞中並且在其中表達。例如，選擇標記基因和感興趣的基因位於左邊界與右邊界之間。通常第二個質粒載體含有反式作用因子，其介導T-DNA從農桿菌轉移至植物細胞。如本領域所已知，這個質粒通常含有毒力功能(Vir基因)，使得農桿菌感染植物細胞，並且通過在邊界序列裂解以及vir-介導的DNA轉移而轉移DNA(HellensandMullineaux(2000)7>*e"A/"屍/""/6We"ce，5:446-451)。一些類型的農桿菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHAIOI、EHA105等)可用於植物轉化。第二個質粒載體對於通過其它方法例如是顯微轟擊、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇法等轉化植物不是必需的。可用於本發明構建體中的改變或改良的變體可用於本發明中的核苷酸序列和胺基酸序列可以通過各種方法改變，而且這些改變可產生編碼蛋白質的序列，所述蛋白質與由本文揭示的氮調節序列編碼的蛋白質具有不同的胺基酸序列。可用於本發明的核苷酸序列包括SEQIDNO:2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36和38所示序列，以及其變體、片段和互補序列。如本文所用，術語"核苷酸序列"或者"核酸分子"包括DNA分子(例如cDNA或者基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸類似物產生的DNA或RNA類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈分子但優選是雙鏈DNA。"互補序列"是指與指定核苷酸序列充分互補的核苷酸序列，由此其可以與指定核苷酸序列雜交，從而形成穩定雙鏈體。由這些核苷酸序列編碼的氮調節蛋白質的相應胺基酸序列示於SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37和39，以及其變體和片段。本發明還包含如下核酸分子的應用，所述核酸分子包含編碼部分長度的氮調節蛋白質的核苷酸序列及其互補序列。是這些氮調節核苷酸序列的片段的核酸分子也可用於本發明。"片段"是指編碼氮調節蛋白質的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可編碼氮調節蛋白質的生物學活性部分，或者其可以是在下文所述方法中可用作雜交探針或PCR引物的片段。是氮調節核苷酸序列的片段的核酸分子根據指定用途包含本文揭示的全長氮調節核苷酸序列的至少大約15、20、50、75、100、200、300、350或者至少大約400個連續的核苷酸或者直至全長序列核苷酸。"連續"核苷酸是指彼此緊密相鄰的核苷酸殘基。是這些氮調節多肽的片段的多肽也可用於本發明中。"片段"是指編碼SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37或39所示氮調節蛋白質的胺基酸序列的一部分，且其保留氮利用效率。氮調節蛋白質的生物學活性部分可以是這樣的多肽，即例如長度為10、25、50、100、125、150、175、200、250、300、350、400或更多個胺基酸。這種生物學活性部分可以通過重組技術製備，並評估其氮利用效率。如本文所用，片段包含SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37或39所示序列的至少8個連續胺基酸。然而，本發明也包含其它片段，如超過大約10、20、30、50、100、150、200、250、300、350或400個胺基酸的任何蛋白質片段。本發明還包含變體核酸分子或者變體胺基酸序列在本發明的方法和組合物中的應用。氮調節核苷酸序列的"變體"包括那些序列，其編碼本文揭示的氮調節蛋白質但是由於遺傳密碼的簡併性而有所不同的序列，以及與上述序列基本相同的那些序列。天然發生的等位基因變體可以通過熟知的分子生物學技術鑑別，例如在下文概述的聚合酶鏈反應(PCR)和雜交技術。變體核苷酸序列還包括通過合成獲得的核苷酸序列，其已經例如通過使用定點誘變技術產生但是其仍編碼本發明揭示的氮調節蛋白質，如下文論述。可用於本發明中的變體蛋白質是生物學活性的，即其保留希望的天然蛋白質生物學活性，即氮利用效率和/或改良的逆境耐性。"變體"是指具有與SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37或39所示胺基酸序列具有至少大約60%、65%、大約70%、75%、80%、85%、或者90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者99%相同性的胺基酸序列的蛋白質或多肽。變體還包括由在嚴格條件下與SEQIDNO:2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36或38所示核酸分子或其互補序列雜交的核酸分子編碼的多肽。變體包括由於誘變而導致胺基酸序列不同的多肽。本發明涵蓋的變體蛋白質是生物學活性的，即其仍具有天然蛋白質的希望的生物學活性，即保留氮利用效率和/或改良的逆境耐性。可用於本發明中的優選的氮調節蛋白質由與SEQIDNO:2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36或38所示核苷酸序列基本相同的核苷酸序列編碼。術語"基本相同的"是指利用本文描述的序列對比程序之一使用標準參數與參考序列相比具有至少大約60%或65%序列相同性、大約70%或75%序列相同性、大約80%或85%序列相同性、或者大約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相同性的胺基酸或核苷酸序列。本領域技術人員意識到可以對這些值適當調節以通過考慮到密碼子簡併性、胺基酸相似性、讀框位置等因素確定由兩個核苷酸序列編碼的蛋白質的相應相同性。為了確定兩個胺基酸序列或者兩個核酸的相同性百分比，對序列進行排列以進行最佳對比。兩個序列之間的相同性百分比是所述序列共有的相同位置數的函數(即相同性百分比耐目同位置數/總位置數(例如重疊位置)X100)。在一個實施方案中，兩個序列是相同長度的。兩個序列之間的相同性百分比可以使用與下文描述的那些相似的技術確定，允許或不允許缺口。在計算相同性百分比時，典型計算精確匹配。兩個序列之間的相同性百分比的確定可以使用數學算法完成。用於對比兩個序列的數學算法的非限制性例子是KarlinandAltschul(1990)Scz'.87:2264中描述的算法，由KarlinandAltschul(1993)屍rac.A^/.爿caJ.5W.C/S4卯:5873-5877加以修改。將這種算法與Altschul&(19卯)乂Mo/.所o/.215:403所述的BLASTN和BLASTX程序組合。BLAST核苷酸檢索可以利用BLASTN程序進行，score-100、wordlength-12，以獲得與本發明氮調節核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索可以利用BLASTX程序進行，score=50、wordlength=3，以獲得與本發明氮調節蛋白質分子同源的胺基酸序列。為了獲得缺口對比以進行對比，可以利用Altschul"(1997)7Vwc/e/ci飢25:3389所述的GappedBLAST。或者，可以使用PSI-Blast進行重複檢索，檢測分子之間的距離關係。見Altschula/.(1997)swpra。當利用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序時，可以使用各自程序(例如BLASTX和BLASTN)的默認參數。見www.ncbi.nlm.nih.gov。用於序列對比的另一個數學算法的非限制性例子是CIustalW算法(Higgins"a/.(1994)M<c/e/cJc/cfe22:4673-4680)。19ChistalW對比序列並排列對比了完整胺基酸或DNA序列，因此可以提供關於完整胺基酸序列的序列保守性數據。ClustalW算法用於一些可商購的DNA/胺基酸分析軟體包中，例如theVectorNTIProgramSuite的AUGNX模塊(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)。在利用ClustalW進行胺基酸序列排列對比之後，可以確定胺基酸相同性百分比。用於分析ClustalW序列對比的一個非限制性軟體程序例子是GENEDOCTM。GENEDOC(KarlNicholas)可以評定多個蛋白質之間的胺基酸(或DNA)相似性和相同性。用於序列對比的數學算法的另一個非限制性例子是MyersandMiller(1988)C4B/OS4:ll-17所述算法。將這個算法與ALIGN程序(2.0版)組合，後者是GCG序列對比軟體包(得自Accelrys，Inc.,9865ScrantonRd.，SanDiego，California,USA)的一部分。當利用ALIGN程序對比胺基酸序列時，可以使用PAM120權重殘基表(weightresiduetable)、缺口長度罰分為12以及缺口罰分為4。優選的程序是GAPversion10，其使用NeedlemanandWunsch(1970)JMo/.所o/.48:443"453所述算法。GAPVersion10可以使用如下參數核苷酸序列的相同性百分比和相似性百分比使用GAPWeight為50和LengthWeight為3，以及nwsgapdna.cmp評分矩陣；胺基酸序列的相同性百分比和相似性百分比使用GAPWeight為8和LengthWeight為2，以及BLOSUM62評分矩陣。也可以使用等價程序。"等價程序"是指這樣的任何序列對比程序，其對於質詢的兩個序列而言，當與通過GAPVersion10產生的相應序列排列對比結果進行對比時，產生具有相同核苷酸或胺基酸殘基匹配和相同序列相同性百分比的序列對比結果。技術人員會進一步意識到在本發明的核苷酸序列中可以通過突變導入變化，從而導致編碼的氮調節蛋白質的胺基酸序列變化，而不改變所述蛋白質的生物學活性。因此，變體分離的核酸分子可以通過在本文揭示的相應核苷酸序列中導入一或多個取代、添加或者缺失而產生，由此在編碼的蛋白質中導入一或多個胺基酸取代、添加或缺失。可以通過標準技術導入突變，例如定點誘變和PCR介導的誘變。這種變體核苷酸序列也包含在本發明中。例如，保守胺基酸取代可以在一或多個預定的、優選非必需胺基酸殘基進行。"非必需"胺基酸殘基是在氮調節蛋白質的野生型序列中可以被改變但是不改變生物學活性的殘基，而"必需"胺基酸殘基是為生物活性所必需的殘基。"保守胺基酸取代"是其中胺基酸殘基由具有相似側鏈的胺基酸殘基置換。具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族在本領域中有詳細說明。這些家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側鏈胺基酸(例如天冬氨酸、穀氨酸)，無電荷極性側鏈胺基酸(例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非極性側鏈胺基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，P-分支側鏈胺基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳族側鏈胺基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。保留功能的胺基酸取代可以在非保守區域進行。通常這種取代不是針對保守胺基酸殘基或者保守基序中的胺基酸殘基進行，這種殘基是蛋白質活性必需的。然而本領域技術人員理解功能變體在保守殘基中可具有少量保守或非保守的改變。保守的且為蛋白質活性必需的殘基的例子包括例如在已知參與氮同化作用的相似或相關序列的對比中包含的在所有蛋白質之間均相同的殘基。保守的但是可允許保守胺基酸取代且仍保留活性的殘基的例子包括例如在已知參與氮同化作用的相似或相關序列的對比中包含的在所有蛋白質之間僅具有保守取代的殘基。或者，變體核苷酸序列可以通過沿著所有或部分編碼序列隨機導入突變例如通過飽和誘變而產生，對所得突變體篩選賦予氮利用效率的能力以鑑別保留活性的突變體。在誘變之後，編碼的蛋白質可以重組表達，蛋白質的活性可以通過使用標準測定技術確定。使用例如PCR、雜交等方法可以鑑別相應的氮調節序列，這種序列與本發明的序列基本相同。見例如SambrookJ.，andRussell,D.W.(2001)A/b/ecw/aT"C7ow/wg:爿丄a6orato;^yAfowwa/.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)以及Innis,&a/.(1990)PQ屍ratoco/r力GW"'eiWef/zocfe<2"cMpj/z.cflf/ora(AcademicPress,NY)。在雜交方法中，所有或部分氮調節核苷酸序列可用於篩選cDNA或基因組文庫。構建這種cDNA和基因組文庫的方法為本領域所已知，在SambrookandRussell，2001，j"/ra中揭示。本發明的核苷酸或胺基酸序列的變體或片段通常編碼保留全長氮調節蛋白質的生物學活性(即保留氮利用效率)的蛋白質片段。"保留氮利用效率"是指所述變體或片段具有SEQIDNO:3、5、8、10、12、14、16、18、23、25、27、29、31、33、35、37或39所示全長氮調節蛋白質或者SEQIDNO:2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36、或38所示全長氮調節核苷酸序列的至少大約30%、至少大約50%、至少大約70%或者至少大約80%的氮利用效率和/或逆境耐性。監測氮利用效率的方法包括檢測同化途徑中任何主要氮代謝庫大小的變化(例如硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨、穀氨酸、天冬氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、賴氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氯酸、酪氨酸、植物部分的總蛋白質含量、植物部分的總氮含量和/或葉綠素含量中可測量的變化)或者檢測與不含有或者不表達本發明的氮調節序列的植物相比，植物以較低的氮肥水平提供相同或增加的產量的能力或者植物在相同氮肥水平提供增加的產量的能力。"相同"或"較低"氮肥水平是指通常應用於不表達本發明的氮調節序列的植物的氮的水平。本領域已知大多數(如果不是所有)感興趣的植物品種的足夠的氮水平。其它指導可見於例如Hewitt(1966)few/aw/『aterCWfz^eMe/Zo^t/yeJ/"Ae#屍/"w/倫/"Y/ow，2nded.，FarnhamRoyal(Bucks),CommonwealthAgriculturalBureaux;以及Hewitt(1975)屍/awfMf"era/7Vw^7,"o",London,EnglishUniversityPress。可用於本發明中的多肽序列可以通過各種方式改變，包括胺基酸取代、缺失、截短和插入。這種處理方法為本領域所已知。例如，本文揭示的氮調節蛋白質的胺基酸序列變體可以通過核苷酸序列中的突變而製備。這也可以通過各種形式的誘變和/或定向進化中的一種實現。在一些情況中，胺基酸序列中編碼的改變基本上不影響蛋白質的功能。這種變體具有希望的氮利用效率。然而，本發明的氮調節序列改變或改良氮利用的能力可以通過使用這種技術之一在本發明組合物上進一步改良。例如，可以在DNA複製期間呈現高比率鹼基錯摻入的宿主細胞例如XL-1Red(Stratagene，LaJolla，CA)中表達本文揭示的核苷酸序列。在這種菌株增殖之後，可以分離DNA(例如通過製備質粒DNA或者通過PCR擴增以及將所得PCR片段克隆進載體中)，如本文在別處所述將DNA轉化進植物中並測量氮利用效率。或者，可以在氨基或羧基末端對許多蛋白質的蛋白質序列進行改變而基本不影響其活性。這可包括通過現代分子學方法導入的插入、缺失或者改變，所述分子學方法例如為PCR，包括依靠在PCR擴增中使用的寡核苷酸中包含胺基酸編碼序列而改變或延伸蛋白質編碼序列的PCR擴增。或者，加入的蛋白質序列可包括完整的蛋白質編碼序列，如本領域常用於產生融合蛋白的那些序列。這種融合蛋白通常用於(1)增加感興趣的蛋白質的表達，(2)導入結合結構域、酶活性或者表位以促進蛋白質純化、蛋白質檢測或者本領域已知的其它實驗性應用，或者(3)使蛋白質靶向亞細胞細胞器分泌或翻譯，例如耙向革蘭氏陰性細菌的周質空間或者真核細胞的內質網，後者通常導致蛋白質糖基化。本發明的變體核苷酸和胺基酸序列還包含衍生自誘變和重組程序如DNA改組的序列。使用這種程序，一或多個不同的氮調節蛋白質編碼區可用於產生具有希望性質的新的氮調節蛋白質。以這種方式，從包含具有充分的序列相同性且可以在體外或體內同源重組的序列區域的一群相關序列多核苷酸中產生重組多核苷酸文庫。例如，使用這種方法，編碼感興趣的結構域的序列基序在用於本發明中的氮調節序列與其它已知的氮調節序列之間可以改組以獲得編碼具有改良的感興趣的性質如改良的氮利用的蛋白質的新序列。本領域已知這種DNA改組的方法。見例如Stemmer(1994)屍rac.Ato/.91:10747-10751、Stemmer(1994)JVa/m屍e370:389-391、Crameriaa/.(1997)A^wm5z.ofec/z.15:436-438、MooreWa/.(1997)JAfo/.所o/.272:336-347、ZhangW(7卯7」iVoc.Ato/.5W.94:4504-4509、CrameriWa/.(1998)iVa&re391:288-291以及美國專利No.5，605，793和5，837，458所述。植物轉化本發明的方法包括在植物中導入一或多個氮調節核苷酸序列。在一些實施方案中，僅一個本發明揭示的氮調節序列被導入植物中。在其它實施方案中，導入至少2個、至少3個、至少4個或者更多個所述序列。在導入多個序列的情況中，每個核苷酸序列均不相同。如果兩個核苷酸序列在至少一個核苷酸位置不同則認為這兩個序列是不相同的。因此，不相同的核苷酸序列包括編碼相同胺基酸序列的兩或多個不同的核苷酸序列(例如已經優化以在植物中表達的一或多個)以及編碼至少兩個不同胺基酸序列的兩或多個不同的核苷酸序列。"導入"是指為植物提供包含一或多個氮調節序列的一或多個構建體，由此所述構建體得以進入植物細胞的內部。本發明的方法不需要使用將核苷酸構建體導入植物的特殊方法，僅是所述核苷酸構建體得以進入至少一個植物細胞的內部即可。將核苷酸構建體導入植物中的方法為本領域所已知，包括但不限於穩定轉化方法、瞬時轉化方法以及病毒介導的方法。通常植物轉化方法包括將異源DNA轉移進靶植物細胞(例如不成熟或成熟胚，懸浮培養物、未分化的愈傷組織、原生質體等)中，隨後應用最大閾值水平的合適選擇(依賴於選擇標記基因)從未轉化的一組細胞中回收轉化的植物細胞。典型將外植體轉移至新鮮供應的相同培養基中並常規培養。隨後，轉化的細胞在被置於補加了最大閾值水平選擇劑(即抗生素，如壯觀黴素和卡那黴素)的再生培養基中之後分化為芽(shoot)。然後將芽轉移至選擇性生根培養基中以回收生根的芽或小植物。隨後使該轉基因小植物生長為成熟植物並產生能育種子(例如HieiWW.(1994)77^Jo"r""/6:271-282;Ishida"a/.(1996)AtoweB/o^c^o/ogy14:745-750所述)。將外植體轉移至新鮮供應的相同培養基中並常規培養。關於產生轉基因植物的技術和方法的一般描述見AyresandPark(1994)CW"ca//ev/evw/"屍/a"f13:219-239禾口BommineniandJauhar(1997)42:107-120所述。由於轉化的材料含有許多細胞，因此轉化和未轉化的細胞均存在於任何選定的靶愈傷組織或組織或細胞中。殺死未轉化的細胞並且使得轉化的細胞增殖的能力產生轉化的植物培養物。通常除去未轉化的細胞的能力是對快速回收轉化的植物細胞以及成功產生轉基因植物的一個限制。然後可以使用分子和生物化學方法證實轉基因植物的基因組中整合的感興趣的異源基因的存在。轉基因植物的產生可以通過許多方法進行，所述方法包括但不限於通過農桿菌在植物細胞中導入異源DNA(農桿菌介導的轉化)、用與粒子附著的異源外源DNA轟擊植物細胞以及各種其它非粒子直接介導的方法(例如Hieia/.(1994)TTie屍/a"fJowrwa/6:271-282;Ishidaa/.(1996)A^fMrejBz'ofec/mo/ogy14:745-750;AyresandPark(1994)Oz'//ca/及ev/eM;s腸,13:219-239;BommineniandJauhar(1997)42:107-120所述)轉移DNA。轉化葉綠體的方法為本領域所已知。見例如Svaba/.(1990)/Voc.Ato/.爿cadSd.t/&487:8526-8530;SvabandMaliga(1993)Ato/.^c。dSc/.C/SJ90:913-917;SvabandMaliga(1993)J12:601-606所述。所述方法依賴於基因槍輸送含有選擇標記的DNA並且通過同源重組使得所述DNA耙向於質體基因組。此外，質體轉化可以通過核編碼的及質體指導的RNA聚合酶的組織優選表達反式激活沉默的質體攜帶轉基因而實現。這種系統已經在McBride"a/.(1994)A/a".Jc^.Sc/.t/W91:7301-7305中報導。24細菌細胞的轉化是通過本領域己知的一些技術實現的，所述技術包括但不限於電穿孔或者化學轉化(見例如Ausubel，ed.(1994)CVw"fiVotoco/sMo/ecw/orAo/ogv，JohnWileyandSons,Inc.,Indianapolis,IN所述)。賦予對毒性物質抗性的標記可用於從未轉化的細胞(不含有或者不表達檢測DNA的那些細胞)中鑑別轉化的細胞(含有及表達檢測DNA的細胞)。在本發明的一個方面中，本發明的核苷酸序列可用作標記以評定細菌或植物細胞的轉化。在這種方式中，轉化是通過如上述監測氮利用效率評定。植物細胞的轉化可以通過相似方式實現。"植物"是指完整植物或者植物的組成部分包括植物器官(例如葉、莖幹、根等)、種子、植物細胞、繁殖體、胚和後代。植物細胞可以是分化的或者未分化的(例如愈傷組織、懸浮培養細胞、原生質體、葉細胞、根細胞、韌皮部細胞、花粉)。"轉基因植物"或者"轉化的植物"或者"穩定轉化的"植物或者細胞或者組織是指在植物細胞中已經摻入或者整合了外源核酸序列或者DNA片段的植物。"穩定轉化"是指導入植物中的核苷酸構建體整合進植物的基因組中且能被植物後代遺傳。已經轉化的細胞可以根據常規方式生長為植物。見例如McCormick"(1986)屍/a"fCW/及印o/^5:81-84所述。然後使這些植物生長，並且用相同的轉化植株或者不同的植株授粉，鑑別組成型表達希望的表型特徵的所得雜交體。生長兩或多個世代以保證希望的表型特徵的表達得以穩定保持和遺傳，然後收穫種子以保證希望的表型特徵的表達已經實現。以這種方式，本發明提供了在其基因組中穩定摻入本發明的核苷酸構建體例如本發明的表達盒的轉化的種子(也稱作"轉基因種子")。通過調節氮利用增加植物產量的方法
技術領域：
：本發明提供了增加植物產量的方法。所述方法包括將本發明揭示的氮調節核苷酸序列導入植物或者植物細胞中，由此氮利用效率的增加相應於植物產量的增加。如本文所定義，植物的"產量"是指由植物產生的生物量的質量和/或數量。"生物量"是指任何測量的植物產物(例如植物的任何組成部分，如種子、莖、根、穀粒、葉等)。生物量生產中的增加是測量的植物產物的產量的任何改良。植物產量增加具有一些商業用途。例如，植物葉生物量的增加可增加為人和動物消費的葉類植物的產量。此外，葉生物量的增加可用於增加產生得自植物的藥物或工業產品。產量的增加可包括具有任何統計學意義的增加，包括但不限於與其中未導入本發明的調節氮利用的核苷酸序列的植物的產量相比，所述植物的產量增加至少1%、至少3%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少50%、至少70%、至少100%或更高。植物本發明可用於轉化任何植物物種，包括但不限於單子葉植物和雙子葉植物。感興趣的植物的例子包括但不限於玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、菸草、大麥和袖菜、芸苔屬植物(^raw/o^p.)、苜蓿、黑麥、小米、紅花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑橘樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄欖、番木瓜、腰果、堅果、杏、燕麥、蔬菜、草(例如飼草、草坪草或牧草)、觀賞植物、果樹以及針葉樹。蔬菜包括但不限于洋蔥、番茄、萵苣、綠豆、利馬豆、豌豆，以及CVc"柳;y屬成員如黃瓜、甜瓜和香瓜。觀賞植物包括但不限於杜驟花、繡球花屬植物、芙蓉屬植物、玫瑰、鬱金香、水仙花、矮牽牛、康乃馨、一品紅和菊花。優選本發明的植物是農作物(例如玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、菸草、大麥、油菜等)。本發明特別適合單子葉植物家族的任何成員，包括但不限於玉米、水稻、大麥、燕麥、小麥、高粱、黑麥、甘蔗、菠蘿、薯蕷、洋蔥、香蕉、椰子和椰棗(date)。植物轉化的評估在將異源外源DNA導入植物細胞中之後，異源基因在植物基因組中的轉化或整合可通過各種方法證實，例如分析與整合的基因相關的核酸、蛋白質和代謝物。PCR分析是在植入土壤之前的早期階段篩選轉化的細胞、組織或芽中摻入的核苷酸序列存在的一種快速方法(SambrookandRussell(2001)M/ecw/arC7ow/wg..^La60rator7Mawwa/，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。使用特異於感興趣的基因或者農桿菌載體背景等的寡核苷酸引物進行PCR。植物轉化可以通過基因組DNA的Southern印跡分析證實(SambrookandRussell,2001,w;ra)。通常從轉化體中提取總DNA，用合適的限制酶消化，在瓊脂糖凝膠中分級分離並轉移至硝化纖維素或尼龍膜上。然後根據標準技術將該膜或"印跡"用例如放射標記的np靶DNA片段探查以證實植物基因組中導入的基因的整合(SambrookandRussell,2001，w/ra)。在Northern分析中，根據本領域常用的標準方法從轉化體的特定組織中分離RNA，將其在甲醛瓊脂糖凝膠中分級分離，印跡於尼龍濾膜上(SambrookandRussell,2001，w;ra)。然後根據本領域已知方、法通過將所述濾膜與衍生自本發明多核苷酸的放射性探針雜交以檢測由本發明的核苷酸序列編碼的RNA的表達(SambrookandRussell,2001，s甲ra)。可以對所述轉基因植物進行Western印跡和生物化學測定以確定由氮調節基因編碼的蛋白質的存在情況，這通過標準方法(SambrookandRussell，2001,^^ra)使用結合所述氮調節蛋白質上存在的一或多個表位的抗體進行。例如，通過本發明的方法產生的多克隆抗體可用於檢測氮調節蛋白質的存在。抗體本發明還包含用於本發明中的多肽或者其變體或片段的抗體。產生抗體的方法為本領域所熟知(見例如HarlowandLane(1988)^"船c^'w^Za6orafor少Afowwa/,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.;美國專利No.4，196，265所述)。實驗材料和方法這個計劃的大多數起始遺傳材料以玉米表達序列標籤或"EST"形式提供，得自鑑別應答氮而被上調或下調的潛在基因的微陣列實驗。所述微陣列實驗鑑別了可能用於轉化的幾百個候選物。雖然這些序列能預測應答氮波動的基因轉錄，但是它們未提供對於應答氮水平而被調節的基因或者調節氮水平的基因的明確鑑別。基於基因組選擇標準篩選來自微陣列實驗的候選EST以分析並確定少量優選候選物隨後用於如本說明書描述的轉基因表達中。首先檢驗進入這個計劃的所有EST序列(B卩"計劃基因(projectgene)")以鑑別可以編碼應答植物氮水平的蛋白質的開放讀框。在EST中典型存在多個開放讀框。最後，基於多重標準選擇各個計劃基因，所述標準包括開放讀框的大小，其中優先選擇較長的開放讀框，並推測翻譯的基因的功能，其中各個開放讀框被翻譯，然後進行BLAST搜索以鑑別蛋白質同27源物。在鑑別同源物的情況中，我們推斷所述基因很可能編碼具有相似功能的蛋白質。這個信息用於評定基因是否編碼與植物中氮同化作用相關的蛋白質功能。通過這種選擇方法，從每個EST中選擇個體基因靶。選自每個EST的完整基因序列在下文實施例中揭示。EST序列之一(N-EST77-A01)用作進入計劃的兩個不同基因(N-EST77A禾BN-EST77B)以及一個其它EST(ESTN-EST76-H12)的來源。我們發現可以對EST進行修飾以產生比未修飾的EST中存在的開放讀框長的開放讀框。概括而言，三個開放讀框組合產生一個較長的基因(N-EST76A)。在一些情況中，由微陣列實驗提供的DNA樣品用作所有隨後的DNA克隆步驟的原材料。在EST樣品不合適的情況中，產生合成序列。N-EST76b基因是購自BlueHeronBiotechnology,Inc.(Bothell,WA)的合成基因。每個EST以及每個合成基因的基因序列通過DNA測序證實，之後亞克隆每個基因以進行蛋白質過表達。蛋白質過表達和純化將針對計劃選擇的每個基因均亞克隆進促進蛋白質在大腸桿菌(Eco")中過表達的表達載體中。進行蛋白質過表達以使得各個蛋白質得以純化。純化的蛋白質可用於在一對兔中產生每種蛋白質的多克隆抗體。最後，所述多克隆抗體可用於檢測轉基因植物中靶蛋白質的存在。使用本領域已知的方法，將每個計劃基因均亞克隆進大腸桿菌表達載體pRSFlb(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)中。所得克隆通過DNA測序證實並用於誘導每種蛋白質在大腸桿菌中的表達。然後如本領域所已知的那樣使用鈷親和樹脂(ClontechLaboratories,Inc.,MountainView,CA)純化表達的ffis標記的蛋白質。植物轉化將各自的計劃基因亞克隆進載體中以進行玉米的農桿菌介導的轉化。在載體構建和農桿菌轉化之後，通過本領域己知的Southern印跡方法證實載體。然後使通過這些檢測的陽性農桿菌菌株在固體培養基上生長，產生細胞計數以進行大規模轉化實驗。如下實驗描述了植物載體構建與植物轉化的方法。遂療微靴麟鄉辦通過PCR從玉米EST序列或者合成基因中擴增每個計劃基因的開放讀框(ORF)。在PCR期間在ORF的每個末端加入限制位點(例如5fl附HI和1)。此外，在基因的起始密碼子的立即5，加入核苷酸序列ACC以增加翻譯效率(Kozak(1987)A^c/e/cJ"d/te^arc/z15:8125-8148;Joshi(1987)M/c/e/cJcWs/^犯arc;z15:6643-6653)。將PCR產物亞克隆進中間載體(例如pRSF-lb)中並使用本領域熟知的技術測序以保證在PCR期間未導入突變。含有計劃基因的質粒用例如S"wHI和戶WI消化並分離和純化含有完整ORF的片段。然後將含有計劃ORF的純化的DNA片段亞克隆進質粒如pSB11(Japantobacco,Inc.)中，例如在BamHI和戶Wl位點以完成植物表達載體。所述植物表達載體含有例如磨擦草屬(7^扭ao/m)遍在蛋白啟動子、TripPro5啟動子(2006年3月16日申請的美國專利申請系列No.11/377,318，在此併入本文作參考)以及PinII終止子(An(1989)77^戶/a"/Ce〃1:115-122)形成最終的質粒，在此稱作pSBll-lA。pSBll-lA是這樣組成的，即含有例如啟動子-/"厄基因-終止子構建體的DNA片段可以由適當的限制酶切割並且也用於例如通過氣霧束注射(aerosolbeaminjection)轉化進植物中。pSBll-lA的結構通過限制消化和凝膠電泳以及通過對各種克隆連接處進行測序而證實。使用本領域熟知的三親株雜交(triparentalmating)方法將質粒轉移至還攜帶質茅立pSBl(Japantobacco,Inc.)的t艮癌農桿菌(Jgro6a"eWM附,wwe^3rc/e"力菌株LBA4404中，並且鋪板於含有抗生素的培養基上。質粒pSBll-lA攜帶壯觀黴素抗性但是是窄譜宿主範圍的質粒且不能在農桿菌中複製。當通過同源重組將pSBll-lA整合進廣譜宿主範圍的質粒pSBl中時產生抗生素抗性集落。所得共合體產物通過Southern雜交證實。攜帶該共合體的農桿菌菌株可用於轉化植物，例如通過Purelntro方法(Japantobacco,Inc.)轉化。遞過農伊蘑々導遊存眾方法轉眾擅激在授粉8-12天後收集耳穗(ear)。從耳穗中分離胚，並將大小為0.8-1.5mm的那些胚用於轉化。將胚盾片側向上鋪板於合適的保溫培養基中，在25"C於黑暗中保溫過夜。然而，非必須將所述胚保溫過夜。將胚與含有適合Ti質粒介導的轉移的載體的農桿菌菌株接觸5-10分鐘，然後鋪板於共培養基上培養3天(於黑暗中25'C)。在共培養之後，將外植體轉移至恢復期培養基(recoveryperiodmedia)中培養5天(於黑暗中25°C)。根據利用的特定選擇方法的性質和特性將外植體在選擇培養基中保溫直至8周。在選擇期t後，將所得愈傷組織轉移至胚成熟培養基中，直至觀測到成熟體然後將所得成熟體細胞胚置於低光照條件下，開始本領域已知的再生過程。使所得芽在生根培養基上生根，並將所得植物轉移至培育罐(mirseiypot)中並且使其增殖為轉基因植物。此時，分離葉樣品並且通過PCR證實感興趣基因的存在。以此方式產生的所有植物均生長至結種並與分離自Hi-II植物(IowaStateUniversity,Ames，Iowa)的花粉雜交。受精的植物生長直至成熟。從各個植物中收穫成熟種子並且如果需要則保存以在Tl代進行進一步檢測。轉基因植物中的蛋白質表達代表性的轉基因玉米轉化事件(transgenicmaizeevent)中的蛋白質表達通過Western印跡評估。簡言之，在溫室中生長4周後取葉樣品並立即在乾冰上冷凍。提取總蛋白質(P-PER植物蛋白質提取試劑盒，Pierce),通過Bradford測定法確定蛋白質濃度。將各個植物蛋白質樣品通過電泳分離，轉移至硝化纖維素上，使用本領域已知的方法將固定的蛋白質與兔多克隆抗血清接觸。利用ECLPlusWestern印跡撿測系統(GEHealthcareBio-SciencesCorp.,Piscataway,NJ)觀測結合的抗體複合物。氮測定方法在氮測定的準備中，從組織培養轉移至溫室2或4周後(對於T1植物為發芽後4周)的植物中切下葉。將該材料在乾冰上速凍，在加工之前於-80。C忙存。微盜將50mg葉材料(鮮重，無中脈)凍幹以進行乾重測定。然後將脫水的葉組織在存在新鮮MilliQ水的條件下使用Min氾eadbeater-96TM和2.3mm不鏽鋼珠研磨。將研磨的葉組織通過0.45pm聚偏氟乙烯(PVDF)濾膜過濾並注射進Agilent1100HPLC中，以1.8mM碳酸鈉和1.7mM碳酸氫鈉的混合物的流動相以1.5ml/分鐘運行。使用配有保護柱的IonPacAS9-SC離子層析柱分離離子。以再循環模式使用具有自生式抑制器(self-regeneratingsuppressor)的陰離子自抑制電導率(anionauto-suppressedconductivity)進行分析。將樣品與每個樣品運行中包含的內部標準對比。將50mg葉材料(鮮重，無中脈)在存在60%甲醇的條件下使用MiniBeadbeater-96TM和2.3mm不鏽鋼珠研磨。將經研磨的葉組織通過0.45pm聚偏氟乙烯(PVDF)濾膜過濾並注射進配有3.3m、63。C不鏽鋼線圈和冷卻的中。流動相含有3mM鄰苯二醛(OPA)、10mMp-巰基乙醇和100mM磷酸鹽緩衝液(pH6.8)，以0.4ml/分鐘運行。螢光(激發410nm，發射470nm)和二極體陣列檢測(410nm)用於量化葉提取物中的銨。每個運行中均包含內部銨標準以進行對比。淑肌C分綠基麼將50mg葉材料(鮮重，無中脈)凍幹以進行乾重測定。然後將脫水的葉組織在存在新鮮MilliQ水的條件下用MiniBeadbeater-96TM和2.3mm不鏽鋼珠研磨。將經研磨的葉組織通過0.45)im聚偏氟乙烯(PVDF灘膜過濾並注射進Agilent1100HPLC中，使用配有保護柱的ZorbaxEclipseAAA、4.6X75mm反相柱。冷卻的自動取樣器用於混合葉提取物與400mM硼酸鹽緩衝液(pH10.2)、在甲醇中的1%鄰苯二醛/1%3-巰基丙酸，然後在注射之前將其用水稀釋。注射程序的詳細描述如下將0.5n牌品加入2.5nl硼酸鹽緩衝液中，以最大速度混合兩次。在保持0.5分鐘後，將針置於水中以從針尖除去殘餘物，然後加入0.5nlOPA溶液。將此組合的3.5^U溶液以最大速度混合六次。將針再次置於水中漂洗針尖，然後置於含有新鮮水的小瓶中。接著向樣品混合物中加入32nlMilliQ水，並將18^以最大速度混合兩次。然後將樣品溶液注射進HPLC中，在5分鐘內泵運行2ml/min流動相的具有0-26%乙腈/甲醇/水(45:45:10)(B)梯度的40mMNa2HP04(pH7.8)(A)，隨後是2分鐘的100。/。保持B，然後是2分鐘的10(P/。A。天冬醯胺、穀氨醯胺、穀氨酸和天冬氨酸的量化通過二極體陣列檢測法(328-348nm)和螢光檢測法(激發340nm，發射450nm)進行。將樣品與每個樣品運行中包含的天冬醯胺、谷氮醯胺、穀氨酸和天冬氨酸的內部標準對比。'總賓基麼將50mg葉材料(鮮重，無中脈)凍幹以進行乾重測定。然後將脫水的葉組織在存在新鮮MilliQ水的條件下使用MiniBeadbeater-96TM和2,3mm不鏽鋼珠研磨。將經研磨的葉組織通過0.45Mm聚偏氟乙烯(PVDF)濾膜過濾。葉提取物在水中稀釋，加入茚三酮試劑溶液(在DMSO和乙酸鋰緩衝液中的茚三酮和還原茚三酮，pH5.2)。然後將樣品用厚箔帶密封，在90。C加熱10分鐘，精確冷卻2分鐘，在590nm在分光光度計中讀數。將數值與每個樣品分析期間包含的內部標準對比。藩誠將50mg葉材料(鮮重，無中脈)凍幹以進行乾重測定。然後將脫水的葉組織在存在新鮮MilliQ水的條件下使用MiniBeadbeater-96TM和2.3mm不鏽鋼珠研磨。將經研磨的葉組織通過0.45pm聚偏氟乙烯(PVDF)濾膜過濾。向在水中稀釋的葉樣品中加入Bio-Rad蛋白質染料，進行Bradford蛋白質測定，在595nm在分光光度計中讀數，並且與測定中包含的內部蛋白質標準對比。(録將50mg葉材料(鮮重，無中脈)在存在60%甲醇的條件下使用MiniBeadbeater-96TM和2.3mm不鏽鋼珠研磨。將經研磨的葉組織通過1.0iimA/B玻璃纖維濾膜過濾，將10(Hil提取物置於Coming3370平底微量培養板中，在分光光度計中讀數，空白孔含等體積的60%甲醇。使用SoftMaxPro軟體將光路長換成lcm。使用Porra,R.J.屍/zotos少wf/7e;^及"ewc/z,73:149-156，2002所述等式計算葉綠素含量。實施例l:候選EST的鑑別每個候選氮調節基因的核苷酸序列信息在申請人愛荷華州立大學Dr.PatSchnable指導下進行的差別氮微陣列實驗中產生。這個微陣列實驗用做初始篩選以選擇與氮條件也許相關的EST亞群(sub-set)。從在微陣列中示出一些差異的大量EST序列中(具有3'和5'數據的136個序列)在生物信息學分析之後進一步選擇。這個分析包括核查InternationalNucleotideSequence資料庫(位於NCBI)中的核苷酸序列相似性，核査蛋白質資料庫如NCBI和Swisspro中預測的蛋白質相似性，研究關於已知或預測功能的信息以及核査專利局的核苷酸和蛋白質資料庫。使用這些分析結果以及支持性關鍵信息選擇EST亞群在玉米中進行與氮利用效率相關的轉基因過表達。對於每個EST序列，鑑別了開放讀框並翻譯為胺基酸序列。候選的氮調節序列列於表1中。在植物中過表達氮調節序列的載體構建隨後將每個候選氮調節EST的開放讀框導入植物表達載體中。使用本領域熟知的方法，應用兩個不同的選擇標記系統，使得可以在存在選擇劑的條件下選擇轉化的植物。用氮調節基因轉化玉米所述植物載體可用於植物轉化實驗，通過使用上述方法將氮調節基因導入玉米基因組中。32表l:氮調節序列tableseeoriginaldocumentpage33見實施例22見實施例3實施例2:兩種玉米蛋白N-EST77A、N-EST77B本發明描述了賦予轉基因玉米(Z^m巧力增強的氮利用的玉米基因序列(ESTN-EST77-A01)的應用。兩個開放讀框與高活性的植物啟動子和末端連接以在整合進玉米基因組中之後表達每種蛋白質。異位表達的蛋白質將增強玉米植物利用可利用氮的能力。生物信息學分析表明與NCBI資料庫中其它序列沒有顯著的序列同源性。一部分序列示出與其它物種而不是玉米中的CCAAT-結合轉錄因子具有一些同源性。當核苷酸序列是從微陣列實驗中獲得的時也有一預測的蛋白質序列。預測的蛋白質在本文稱作N-EST77A。核苷酸序列檢驗表明所述核苷酸可以編碼另一種蛋白質(隨後得以證實)，該蛋白質序列被稱作N-EST77B。這第二個蛋白質不是根據微陣列實驗獲得的任何信息預測的。為了表達N-EST77B，將第一個胺基酸由亮氨酸改變為甲硫氨酸以改良蛋白質表達。實施例3:玉米蛋白N-EST76這個實施例描述了賦予轉基因玉米(Z^附^力增強的氮利用的玉米基因序列(ESTN-EST76-H12)的應用。這個特殊的EST具有與所謂"bZIP"類轉錄因子同源的部分核苷酸序列。對於本發明，在植物中過表達兩個單獨的基因構建體。一個構建體(N-EST76a)含有修飾形式的N-EST76-H12EST以使得較長的開放讀框在玉米中被表達。當與天然EST中的基因序列相比時，這個修飾的基因含有3個取代。還產生第二個基因，其在基因的3'末端加入鹼性區亮氨酸拉鏈序列。所得基因被稱作"N-EST76b"。全長克隆序列看起來含有編碼蛋白質的兩個不同區域，108個胺基酸的蛋白質I和122個胺基酸的蛋白質H。然而，意識到如果全長克隆未精確測序以及在該克隆中間測序中產生錯誤，則移碼也許人為產生不應在此的一個新的起始密碼子，因此提示兩個區域僅有一個較長區域。為了適應這種可能性，假定存在兩個較短區域及存在一個較長區域這兩種情況進行序列分析。簡而言之，核苷酸序列搜索報告的結果表明"I"序列與來自水稻的假定蛋白具有一些同源性(基因組DNA來自水稻基因組程序)，與一些推定的bZIPTF具有較低同源性。核苷酸專利資料庫搜索示出序列I與認為是轉錄因子的序列具有一些同源性(E-2e-06)(例如WO03007699)。來自微陣列測定的蛋白質I的推測的胺基酸序列用於搜索資料庫，發現無明顯Wts。然而，當使用GenBank工具或者ExPasy工具再翻譯核苷酸序列I時，發現推測的蛋白質序列具有(1)對GenBank蛋白質資料庫的hits(例如E-9e-09)，提示的功能是bZIP轉錄因子；(2)對專利蛋白質資料庫的hits(例如E=7e-05)，功能與bZIP轉錄因子(特別是來自水稻的)相關或者與ABA應答元件結合蛋白(主要來自擬南芥屬(Arabidopsis),例如美國專利No.6,245,905所述)相關。DNA序列的證實對含有N-EST76-H12的DNA構建體進行測序以證實由微陣列測定提供的序列。這個測序揭示了在SEQIDNO:19第1121位的一個單核苷酸取代，其中"G"代替"C"。這個取代位於針對N-EST76描述的開放讀框中，導致蛋白質序列中穀氨醯胺被取代為穀氨酸。完整N-EST76-H12EST的正確DNA序列示於SEQIDNO:19。產生N-EST76a和N-EST76b的克隆策略N-EST76-H12中DNA序列含有3個開放讀框，其由兩個終止密碼子和一個移碼分隔。應用的克隆策略是消除終止密碼子和移碼以產生與己知bZIP蛋白更相似且因此當表達時更可能正確發揮功能的連續開放讀框。此外，bZIP蛋白在該蛋白質的c末端典型含有一個鹼性區亮氨酸拉鏈。N-EST76-H12不含有這個結構域。因此產生第二個蛋白質，其是在N-EST76蛋白的末端添加一個鹼性區亮氨酸拉鏈結構域。N-EST76-H12中終止密碼子和移碼的消除對於這個實施例，修飾ESTN-EST76-H12(SEQIDNO:19)描述的玉米序列以產生與全長bZIP蛋白更具同源性的較長的開放讀框。這需要對N-EST76序列進行3處修飾在核苷酸444位胸腺嘧啶由胞嘧啶取代，在核苷酸673位腺嘌呤由鳥嘌呤取代，在核苷酸722位之後加入鳥嘌呤。前兩個取代除去N-EST76EST讀框3中存在的一對終止密碼子。最後的改變(在核苷酸722位之後加入)導入一個移碼，使得讀框3與讀框2連接產生與全長bZIP蛋白更同源的讀框。所述DNA序列示於SEQIDNO:22，從所得構建體中表達的蛋白質被稱作"N-EST76a"(SEQIDNO:23)。為N-EST76a添加鹼性區亮氨酸拉鏈此外，我們產生了第二個基因，其中在N-EST76a的3'末端添加編碼鹼性區亮氨酸拉鏈的DNA片段。這個拉鏈結構域在N-EST76的EST中不存在，在此添加以產生N-EST76-衍生蛋白質，其與文獻中描述的bZIP蛋白更相似。因此，產生除了在C末端具有添加的拉鏈結構域之外與N-EST76a均相同的蛋白質。這個新的DNA序列示於SEQIDNO:24，所述蛋白質被稱作"N-EST76b"(SEQIDNO:25)。這些克隆策略在下文概述。為計劃選擇bZIP結構域為此計劃通過使用Wastx搜索算法選擇與翻譯的N-EST76a序列具有高度同源性的蛋白質進行bZIP結構域的選擇。這種方法可以鑑別與N-EST76a蛋白具有顯著同源性的水稻bZIP蛋白。這種水稻bZIP蛋白(登記號BAD17130)的蛋白質序列在本文示於SEQIDNO:20，具有由SEQIDNO:20的第275-357位胺基酸表示的bZIP結構域。編碼完整水稻bZIP蛋白的DNA序列示於SEQIDNO:21，編碼鹼性區亮氨酸拉鏈的DNA片段由SEQIDNO:21的第826-1074位核苷酸表示。35經玉米密碼子使用優化這個bZIPDNA序列，然後加入N-EST76a基因序列的3，末端(N-EST76-H12中第1130位核苷酸)，產生N-EST76b基因序列(SEQIDNO:24)。實施例4:轉基因玉米轉化事件的產生以及表達N-EST76a和N-EST76b的玉米植物中的氮同化作用如先前的實施例所述，構建植物轉化載體pAX2433和pAX2431以指導N-EST76a和N-EST76b蛋白在玉米中過表達。將每個載體通過電穿孔導入根癌農桿菌菌株中。這個菌株還含有載體pSB1，使得pSB1與pAX2433或pAX2431在體內重組產生可以指導N-EST76a或N-EST76b盒插入玉米基因組中的載體。每種重組載體(pAG2433、pAG2431)的形成通過農桿菌菌株的Southern印跡雜交證實。使用本領域已知的方法將含有pAG2433或pAG2431的農桿菌菌株與玉米胚共培養。在共培養之後，使胚在選擇培養基上生長。然後將在存在選擇劑的條件下存活的選擇性生長的個體移至再生培養基中，使用本領域已知方法使其生長為小植物階段。表達N-EST76a、N-EST76b的玉米植物中的氮同化作用氮測定，T0轉化事件本領域已經揭示了量化植物中氮中間體的一系列測定法。在此利用這些測定法分析共24株含有N-EST76a基因的轉基因植物及6株含有N-EST76b基因的植物。在溫室土壤中生長4周後從每株植物中取樣。這些植物看起來表型正常。對葉樣品進行處理以確定其硝酸鹽、天冬醯胺、穀氨醯胺、天冬氨酸、穀氨酸、銨、總胺基酸、葉綠素和總蛋白質水平。這個分析中還包含用僅含選擇標記的構建體(無N-EST76a或N-EST76b)轉化的植物。這些植物同樣在4周取樣，稱作"非GOI"植物。對這兩種類型的植物進行的氮測定結果示於下表2。tableseeoriginaldocumentpage37tableseeoriginaldocumentpage38實施例5:N-EST213抗體的產生產生合成肽以匹配N-EST213的N末端片段(SEQIDN0.3的前20個胺基酸)和N-EST213的C末端片段(SEQIDN0.3的後20個胺基酸)。使用本領域已知的方法用這些肽對兔進行免疫，以產生N-EST213肽的多克隆抗體。實施例6:使用N-EST213基因產生轉基因玉米轉化事件以及表達N-EST213的玉米植物(TO植物)中的氮同化作用過表達N-EST213蛋白的轉基因玉米植物的產生如先前實施例所述構建植物轉化載體pAX2411以指導N-EST213蛋白在玉米中的過表達。將pAX2411載體通過電穿孔導入根癌農桿菌菌株中。這個菌株還含有載體pSBl，使得pSBl與pAX2411在體內重組產生可指導N-EST213盒插入玉米基因組中的載體。這個重組載體(pAG2411)的形成通過農桿菌菌株的Southern印跡雜交證實。使用本領域已知的方法將含有pAG2411的農桿菌菌株與玉米胚共培養。然後將在存在選擇劑的條件下存活的選擇性生長的個體轉化事件移至再生培養基中並使用本領域已知方法使其生長為小植物階段。令人驚奇地發現用N-EST213DNA轉化的一些植物展示與眾不同的表型。這些植物與未轉化的植物相比明顯較矮，沿著莖幹存在"節點壓縮(nodalcompression)"。這項研究中的20株植物中的7株植物呈現這種"矮"表型。另外8株植物記錄為"中等"高度，另外4株植物高度記錄為"高"。較矮的植物生長雄花穗(tassel)和耳穗，但是這兩個器官有時較小，而且外殼有時脫色或者未完全形成。表達N-EST213的玉米植物中的氮同化作用本領域己經揭示了量化植物中氮中間體的一系列測定法。這些測定法在此用於分析含有N-EST2B基因的共23株轉基因植物。在溫室的土壤中生長4周後，從每株植物中取樣。對這些葉樣品進行處理以確定其硝酸鹽、天冬醯胺、穀氨醯胺、天冬氨酸、穀氨酸、銨、總胺基酸、葉綠素和總蛋白質水平。這些氮測定結果示於下表3中。tableseeoriginaldocumentpage40tableseeoriginaldocumentpage41實施例7:轉基因玉米轉化事件的產生及表達N-EST45的玉米植物rrO和Tl植物)中的氮同化作用過表達N-EST45蛋白的轉基因玉米植物的產生如先前實施例所述構建植物轉化載體pAX3404以指導N-EST45蛋白在玉米中的過表達。將pAX3404載體通過電穿孔導入根癌農桿菌菌株中。這個菌株還含有載體pSBl，使得pSBl與pAX3404在體內重組產生可以指導N-EST45盒插入玉米基因組中的載體。這個重組載體(pAG3404)的形成通過農桿菌菌株的Southern印跡雜交證實。使用本領域已知的方法將含有pAG3404的農桿菌菌株與玉米胚共培養。在共培養之後使胚在選擇培養基中生長。然後將在存在選擇劑的條件下存活的選擇性生長的個體轉化事件轉移至再生培養基中，使用本領域己知方法使其生長為小植物階段。這些植物看起來表型正常。表達N-EST45的玉米植物中的氮同化作用氮測定，TO轉化事件本領域已經揭示了量化植物中氮中間體的一系列測定法。這些測定法在此用於分析含有N-EST45基因的共16株轉基因植物。在溫室的土壤中生長4周後從每株植物中取樣。對這些葉樣品進行處理以確定其硝酸鹽、天冬醯胺、穀氨醯胺、天冬氨酸、穀氨酸、銨、總胺基酸、葉綠素和總蛋白質水平。分析中還包含用僅含有選擇標記(無N-EST45)的構建體轉化的植物。這些植物同樣在4周後取樣並被稱作"非GOI"植物。對這兩種類型植物進行的氮測定結果示於下表5中。表5:轉移至土壤中4周後N-EST45對非GOI玉米轉化事件的氮水平tableseeoriginaldocumentpage43氮測定，Tl轉化事件檢驗TON-EST45玉米轉化事件中存在的氮水平並且選擇一些植物鑑定為Tl植物。選擇轉化事件(植物#)3755、3759、3760、3765、3773和3781。選擇非-GOI轉化事件3822和3828作為陰性對照。為了產生Tl轉化事件，從每株T0轉化事件中收集花粉並且對Hi-II(A188xB73)植物的耳穗授粉。在種子形成並收穫種子之後，使這些乾燥的雜交種子在土壤中發芽。在種植大約2周後鑑別含有N-EST45基因(或者非GOI植物中的選擇標記基因)的分離種(segregant)並使其生長直至4周。這些植物看起來表型正常。在第4周從這些轉化事件中取葉樣品並進行與針對TO植物相同的氮檢測方案(硝酸鹽、天冬醯胺、穀氨醯胺、天冬氨酸、穀氨酸、銨、總胺基酸、葉綠素和總蛋白質)。這些氮測定的結果示於表6。tableseeoriginaldocumentpage45實施例8:轉基因玉米轉化事件的產生以及表達N-EST61的玉米植物中的氮同化作用如先前實施例所述構建植物轉化載體pAX2422以指導N-EST61蛋白在玉米中的過表達。將pAX2422載體通過電穿孔導入根癌農桿菌菌株中。這個菌株還含有載體pSBl，使得pSBl與pAX2422在體內重組產生可以指導N-EST61盒插入玉米基因組中的載體。這個重組載體(pAG2422)的形成通過農桿菌菌株的Southern印跡雜交證實。使用本領域已知的方法將含有pAG2422的農桿菌菌株與玉米胚共培養。在共培養之後，使胚在選擇培養基中生長。然後將在存在選擇劑的條件下存活的選擇性生長的個體轉化事件轉移至再生培養基中，使用本領域已知方法使其生長為小植物階段。這些植物看起來表型正常。表達N-EST61的玉米植物中的氮同化作用氮測定，T0轉化事件本領域已經揭示了量化植物中氮中間體的一系列測定法。這些測定法在此用於分析含有N-EST61基因的共8株轉基因植物。在溫室的土壤中生長4周後從每株植物中取樣。對這些葉樣品進行處理以確定其硝酸鹽、天冬醯胺、穀氨醯胺、天冬氨酸、穀氨酸、銨、總胺基酸、葉綠素和總蛋白質水平。分析中還包含用僅含有選擇標記(無N-EST61)的構建體轉化的植物。這些植物同樣在4周後取樣並被稱作"非GOI"植物。對這兩種類型植物進行的氮測定結果示於下表7中。tableseeoriginaldocumentpage47實施例9:轉基因玉米轉化事件的產生以及表達N-EST15的玉米植物中的氮同化作用如先前實施例所述構建植物轉化載體pAX2437以指導N-EST15蛋白在玉米中的過表達。將pAX2437載體通過電穿孔導入根癌農桿菌菌株中。這個菌株還含有載體pSBl，使得pSBl與pAX2437在體內重組產生可以指導N-EST15盒插入玉米基因組中的載體。這個重組載體(pAG2437)的形成通過農桿菌菌株的Southern印跡雜交證實。使用本領域已知的方法將含有pAG2437的農桿菌菌株與玉米胚共培養。在共培養之後，使胚在選擇培養基中生長。然後將在存在選擇劑的條件下存活的選擇性生長的個體轉化事件轉移至再生培養基中，使用本領域已知方法使其生長為小植物階段。這些植物看起來表型正常。表達N-EST15的玉米植物中的氮同化作用氮測定，T0轉化事件本領域已經揭示了量化植物中氮中間體的一系列測定法。這些測定法在此用於分析含有N-EST15基因的共8株轉基因植物。在溫室的土壤中生長4周後從每株植物中取樣。對這些葉樣品進行處理以確定其硝酸鹽、天冬醯胺、穀氨醯胺、天冬氨酸、穀氨酸、銨、總胺基酸、葉綠素和總蛋白質水平。分析中還包含用僅含有選擇標記(無N-EST15)的構建體轉化的植物。這些植物同樣在4周後取樣並被稱作"非GOI"植物。對這兩種類型植物進行的氮測定結果示於下表8中。表8:在轉移至土壤中4周後N-EST15對非GOI玉米轉化事件的氮水平tableseeoriginaldocumentpage49*5932測定的水含量高於其他植株(93%對平均85%);也是含有豐富纖維且易碎的實施例9:轉基因玉米轉化事件的產生以及表達N-EST28的玉米植物中的氮同化作用如先前實施例所述構建植物轉化載體pAX2439以指導N-EST28蛋白在玉米中的過表達。將pAX2439載體通過電穿孔導入根癌農桿菌菌株中。這個菌株還含有載體pSBl，使得pSBl與pAX2439在體內重組產生可以指導N-EST28盒插入玉米基因組中的載體。這個重組載體(pAG2439)的形成通過農桿菌菌株的Southern印跡雜交證實。使用本領域已知的方法將含有pAG2439的農桿菌菌株與玉米胚共培養。在共培養之後使胚在選擇培養基中生長。然後將在存在選擇劑的條件下存活的選擇性生長的個體轉化事件移至再生培養基中，使用本領域己知方法使其生長為小植物階段。這些植物看起來表型正常。表達N-EST28的玉米植物中的氮同化作用氮測定，T0轉化事件本領域已經揭示了量化植物中氮中間體的一系列測定法。這些測定法在此用於分析含有N-EST28基因的共5株轉基因植物。在溫室的土壤中生長4周後從每株植物中取樣。對這些葉樣品進行處理以確定其硝酸鹽、天冬醯胺、穀氨醯胺、天冬氨酸、穀氨酸、銨、總胺基酸、葉綠素和總蛋白質水平。分析中還包含用僅含有選擇標記(無N-EST28)的構建體轉化的植物。這些植物同樣在4周後取樣並被稱作"非GOI"植物。對這兩種類型植物進行的氮測定結果示於下表9中。tableseeoriginaldocumentpage51實施例11:轉基因玉米轉化事件的產生以及表達N-EST88、N-EST42、N-EST31、N-EST264的玉米植物中的氮同化作用如先前實施例所述構建植物轉化載體pAX2424(N-EST88)、pAX2435(N-EST42)、pAX2441(N-EST31)和pAX2437(N-EST264)以指導N-EST88、N-EST42、N-EST31和N-EST264蛋白在玉米中的過表達。將每種載體通過電穿孔導入根癌農桿菌菌株中。這個菌株還含有載體pSBl，使得pSBl與pAX2424、pAX2435、pAX2441或pAX2437在體內重組產生可以指導N-EST28盒插入玉米基因組中的載體。這些重組載體(pAG2424、pAG2435、pAG2441或pAG2437)的形成通過農桿菌菌株的Southern印跡雜交證實。使用本領域已知的方法將含有pAG2424、pAG2435、pAG2441或pAG2437的農桿菌菌株與玉米胚共培養。在共培養之後使胚在選擇培養基中生長。然後將在存在選擇劑的條件下存活的選擇性生長的個體轉化事件移至再生培養基中，使用本領域已知方法使其生長為小植物階段。這些植物看起來表型正常。實施例12—指導N-EST43、N-EST13A、N-EST13E或N-EST55C蛋白在轉基因玉米轉化事件中過表達的質粒的產生如先前實施例所述構建植物轉化載體pAX2443(N-EST43),pAX2454(N-EST13A)，pAX2457(N-EST13E)和pAX2460(N-EST55C)以指導N-EST43,N畫EST13A,N-EST13E或N畫EST55C蛋白在玉米中的過表達。將每種載體通過電穿孔導入根癌農桿菌菌株中。這個菌株還含有載體pSBl，使得pSBl與pAX2443、pAX2454、pAX2457或pAX2460在體內重組產生可以指導N-EST43、N-EST13A、N-EST13E或N-EST55C盒插入玉米基因組中的載體。這些重組載體(pAG2443,pAG2454,pAG2457或pAG2460)的形成通過農桿菌菌株的Southern印跡雜交證實。前文的描述和圖表包含本發明舉例的實施方案。本文描述的實施方案和方法基於本領域技術人員的能力、經驗和優選權而可以改變。以一定順序列出的方法步驟對於所述方法的步驟的順序不構成任何限制。前文的描述和圖表只是解釋和例證了本發明，本發明非限於此。本領域技術人員在不偏離本發明範圍的條件下可以對本發明進行修改和改動。序列表SEOIDNO:1CATCCGCAGCAGCCATGGCGCAGCAGCAGGAGAAGAAGCAGCAGCAGAGGGGGAAGCTGCAGAGGGTGCTAAGGGAGCAGAAGGCTCGGCTCTACATCATCCGCCGATGCGCGTCATGCTCCTCTGCTGGAGTGACTGATCCTTTCACCTTGCCACTTTGGTGGGCGSEOIDNO:2TCGGCTCTACATCATCCGCCGATGCGCGTCATGCTCCTCTGCTGGAGTGACTGASEOIDNO:3MAQQQEKKQQQRGKLQRVLREQKARLYIIRRCVVMIjIjCWSDSEOIDNO.:4TGAGTTACCAGATAGAGTAGSEOIDNO:5MCIAAWIWQAHPVHQLLLLLNRDEFHSRPTDGRIiAFLTNV!LEPDAMPGARTRGD!LP:LKFIjTTNIMVYVSNRPKGQPATIQLVSPGLHVLSEVKDIVERIiMTDTTKADKDRLPNTGCDPNWDGEASIiYEKYLESGIWKDHTVSYQIESEOIDNO:653KAVGWWGEGSKK工LGGRDV!LGGGTWMGCTKGSNKSPLEVATEVAEEADEYNGFNL工LADLNARLDSPWQKAILIjGKNFRELLREHGADEVEHGIiSSIFIEVQTDQGPYGTRSTAVLSVNYGCTCCACTCCACAGCATATGCGCAGCCCATCCATCTCGTGCACACTTGSEOIDNO:7GCCGAGCTTGASEOIDNO:8MQHSSTQTLTTQALLLPMEVKMCVRGACLCERQAVPRHSKTAAVTCQGRASEOIDNO:9TGASEOIDNO:10IiRDRRKTKGGKETPCSPIGRRLRSFAPNGFCSISISCSIAVLRPKLRRRCCS!LWKSRCVSEEPVYVNAKQYRGILRRRQSRAKAELERKRWSKQESRIFTSPRHQHAMTRRARGNGGRFLNTKKSDRVPPDDLIGLRRHNEASEOIDNO:11GCTGACATATGASEOIDNO:14AEQ工NMPQSACGSCGLGDAFRCGTCPYRGLPPFKPGEKVSIiSGNFIAADItcggaaggcaggccttgctttgtgaSEOIDNO:16mamqtgvatskvlilvgagmtgsillrngrlsdvlgelqeimkgvnqgtssgpydial工qaqirnlaqevrdltlskpitilngksdsggslssyilpaaavgamgycymwwkglslsdvmfvtkhnmanavqsmskqleqvssalaatkrhltqrlenldgkmdeqvevskairnevndvkddlsqigfdvesiqkmvaglegkiellenkqdvantgiwylcqvagglkdgintrffqetseklklshsaqpenkpvkg!leffsestmeqkvadskpiavtvdaekpektaavmgttvhrs工rfsyrkaglalSEOIDNO:17actcaccaaaacatgcagcaaggcgcagaactatgaacagtagSEOIDNO:18mcsvarlafvlalaiaassievaesrdfnifaqgslpdatkgssglaatsgklcqlceqysseallyltqnetqteilsilhhecaslaplkqqcitiivdyyvtlfflevsmvtpekfcesmh:lckkgmkis:lptregtcg:lchhvvveiumIjKDPnmqlevid:lltktcskaqnyeqSEOIDNO:19GATGAATTTCCCGGCTGGAAGCGGGAGGCGGCAGCAGCATCCGGGGCCGGAGCACCTGTCGCCGATGACGCCGCTCCCGCTGGCGCGGTAGGGGTCGGTCTACTCGCTCACGTTCGACGAGTTCCAGAGCTCGCTCGGTGGGGCCACCAAGGACTTCGGATCCATGAACATGGACGAGCTCCTCCGCAACATCTGGTCGGCGGAG6AGACACACAGCGTCACAGCTGCGGACCATGCCGCGCGGGCGCCGTACGTCCAGTGCCAGGGCTCGCTCACCCTCCCCTGTCCGCGCCGGCGTGGTGAGGGAGGACATGATGGCGGCGGCGCCCGTACCACCAGCGCCGGGTTGCCCACCACCTCATCTGCAACCGCCAATGCTGTTTCCACATGGCAATGTGTTTGCTCCCTTAGTGCCTCCGCTCCAATTCGGGAATGGGTTTGTGTCGGGGGCTCTCAGTCAGCAGCAGGGAGGTGTTCTTGAGGCCCCGGCGGTATCGCCGCGGCCGGTGACGGCAAGCGGGTTCGG6AAGATG6AAG6AGACGACTTGTCGCATCTGTCGCCATCACCGGTGTCGTACGTTTTTTTGTGCTGGTTTGAGGGGAAGGAAGCCACCAGCTGTGGAgAAGGTGGTTGAGAGGaggcaacgcc一SEOIDNo:20mdfpggsgrqqqlppmtplplarqgsvysltfdefqstlggvgkdfgsmnimiellrsiwtaeeshavgaattttattasvaaaehaavgappvqrqgsltlprtlsqktvdevwrdmmcfggggastapaaaeppppahrqqtlgeitleeflvragvvredmsvppvppaptptaaavppppppqqqtpmlfggsnvfppmvpplslgnglvsgavghggggaaslvspvrpvssngfgkuneggdlsslspspvpyvfkgglrgrkapgiekvverrqrrmiknresaarsrqrkqaym鵬leaevaklkelndelqkkqdemleqqknevlermsrqvgptakriclrrtltgpwSEOIDNO:21atggattttccgggagggagcgggaggcagcagcagctgccgccgatgacgccgctgccgttggcgaggcaggggtcggtgtactcgctcacgttcgacgagttccagagcacgctgggcggggtcgggaaggacttcgggtcgatgaacatggscgagctcctccgcagcatctggacggccgaggagtcgcacgccgtcggcgccgccacgacgacgacggcgacgacggcgtccgtggcggcggcggagcacgcggcggtgggggcgccgcccgttcagaggcaggggtcgctgaccctcccccgcacgctcagccagaagaccgtcgacgsggtctggcgcgacatgatgtgcttcggtggcggcggcgcctccsccgcgccggccgccgcggagcccccgccgccggcgcaccggcagcagacgctcggggagatcacgctggaggagttcctcgtgcgggccggcgtggtgagggaggacatgtcggtcccgcccgtcccgccggcgccgactcctacggcggctgctgtacctcccccgccgccgccgcagcagcagacgccgstgttgttcggtcagagcaatgtgttccctccgatggtgcctccgctctcgctgggaaatgggctggtctcgggagctgtcggacacggcggtggtggtgccgcgtcgttggtttcgccggtgaggccggtctcgtccaatggcttcggcaag3tggaaggcggggacctgtcgtcgctgtcgccatcgccggtgccgtacgttttcasaggtgggctgaggggaaggasggcaccgggcatcgagaaggttgtcgagagaagacagcggcggatgatcaagaacagggagtctgccgcgaggtcgcgccagaggaaacaggcatatatgatggaattggaagctgaggtagcaaaacttaaggagctgaacgatgaactccagaaaaagcaggatgaaatgttggagcagcaaaagaatgaggttctagagagaatgagccgacaagttggaccgacagcaaagagaatttgccttcggaggactctgacgggtccatggtgaSEOIDNO:22SEOIDNO:23MNFPAGSGRR④HPGPEHLSPMTPLPLARQLRNIWSAEETHSVTAADHAARAPYVGCQGSVAAAPPAQRGPTLGE工MLEEFLVRAGVVREFAPIiVPPLQFGNGFVSGALSQQQGGVLEAPVFLCWFEGKEATSCGEGGSEOIDNO:24GSVYSLTFDEFQSSLGGATKDFGSM副DELLTLPCTLSGKTVDEVWRDLVCNGGGPSDEADMMAAAPVPPAPGCPPPHLGPPMLFPHGNVAVSPRPVTASGFGKMEGDDLSHLSPSPVSYGACAGAGGAGGATGATCAAGAACAGGGAGTCTGCCGCGAGGTCGAGGCAGAGGAAACAG6CATATAT6ATG6AATTGGAAGCTGAGGTAGCAAAGCTCAAG6AGCTGAACGACGAGCTCCA6AAGAAGCAGGACGAGATGCTGGAGCAGCAGAAGAACGAGGTGCTG6AGA66ATGTCCAGGCA6GT6SGCCCAACC6CCAAGAGGATTTGCCTGAGGAG6ACCCTGACCGGCCCATGGTGASEOIDNO:25mnetagsgrrlrniwsaeetVAAAPPAQRQfaplvppd2fvflcwfegkeqkkqdemleqqqhpgpehlshsvtaadhaaptlgeimleeGNGFVSGAIiSatscgqggerqknevlermspmtplplarqrapyvqcqgsflvragvvreqqqggvleap罪rmiknrerqvgptakrigsvysltfdeltlpctlsgkdmmaaapvppavsprpvtassaarsrqrkgclrrtltgpwf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NO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37或者SEQIDNO:39，其中所述核苷酸序列調節植物中的氮利用。12.權利要求ll的宿主細胞，其中所述宿主細胞進一步包含選自(a)、(b)、(c)或(d)的至少第二個核苷酸序列，其中所述第一個和第二個核苷酸序列是不相同的。13.權利要求ll的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自細菌細胞和植物細胞。14.一種載體構建體，其包含a)編碼選自如下一組的胺基酸序列的至少第一個核苷酸序列i)選自如下的胺基酸序列SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37和SEQIDNO:39;ii)與如下胺基酸序列具有至少95%序列相同性的胺基酸序列SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:/23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37或者SEQIDNO:39，其中所述胺基酸序列調節植物中的氮利用；iii)由選自如下的核苷酸序列編碼的胺基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:22、SEQIDNO:/24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36和SEQIDNO:38;及iv)由與如下序列具有至少95%序列相同性的核苷酸序列編碼的胺基酸序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36或者SEQIDNO:38，其中所述核苷酸序列調節植物中的氮利用；b)5'DNA啟動子序列；及c)3'終止子序列，其中所述核苷酸序列、DNA啟動子序列以及終止子序列是可操縱地連接的以允許所述核苷酸序列的轉錄。15.權利要求14的載體構建體，其進一步包含編碼選自(a)(i)、(a)(ii)、(a)(iii)或者(a)(iv)的胺基酸序列的至少第二個核苷酸序列，其中由所述第一個和第二個核苷酸序列編碼的胺基酸序列是不相同的。16.—種在植物中表達氮調節核酸分子的方法，所述方法包括提供用權利要求l的載體構建體轉化的轉基因植物或者植物種子及使所述轉基因植物或者由所述轉基因植物種子長成的植物在有效條件下生長的步驟，所述條件是使得所述核酸分子在所述轉基因植物或者由所述轉基因植物種子長成的植物中表達的條件。17.權利要求16的方法，其中所述核酸分子的表達有效增加所述轉基因植物或者由所述轉基因植物種子長成的植物的氮攝取。18.權利要求16的方法，其中所述核酸分子的表達有效增加所述轉基因植物或者由所述轉基因植物種子長成的植物的氮利用效率。19.權利要求16的方法，其中所述植物選自如下一組水稻、玉米、大豆、芸苔、小麥、苜蓿、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、甘薯、豆、豌豆、馬鈴薯、油菜、高粱、飼草、牧草、草坪草、甘蔗。20.權利要求16的方法，其中所述核酸分子的表達有效改良所述轉基因植物或者由所述轉基因植物種子長成的植物的逆境耐性。21.權利要求16的方法，其中所述核酸分子的表達有效改變所述轉基因植物或者由所述轉基因植物種子長成的植物的形態學。全文摘要本發明涉及轉基因植物，所述轉基因植物具有增加的氮利用效率、逆境耐性或者這二者且用新的載體構建體轉化，所述載體構建體包含調節植物中氮利用的核酸序列。在各種實施方案中，所述載體構建體包含選自如下一組的一或多個核酸序列SEQIDNO2、4、7、9、11、13、15、17、22、24、26、28、30、32、34、36或者38。本發明還涉及轉化植物的分離的載體以及用於檢測轉化的植物的抗體。本發明還涉及在植物中表達核酸分子的方法，所述核酸分子相應於調節植物中的氮利用或者由氮條件調節的核酸序列。文檔編號A01H1/00GK101626680SQ200780048109公開日2010年1月13日申請日期2007年10月27日優先權日2006年10月27日發明者A·沙瓦爾德爾,B·范德貝格,J·辛森,J·麥克拉倫,N·杜克,V·貝林松申請人:愛荷華穀類推廣協會