一種通用的有機磷農藥無酶抑制電化學檢測方法與流程
2024-04-05 06:28:05 3
本發明屬於電化學檢測
技術領域：
，具體涉及一種適合不同類型有機磷農藥殘留檢測的電化學方法。
背景技術：
：有機磷農藥被廣泛的用於農作物病蟲害的防治。然而，過量以及不規範的使用將會引起環境汙染以及人體中毒。有機磷農藥作用於人的中樞神經系統，導致乙醯膽鹼酯酶失活，一次次的農藥中毒事件引起了社會的關注。因此，開發一種有效的有機磷農藥檢測技術來保證食品安全就顯得尤為重要。傳統的檢測技術包括液相色譜法、氣相色譜法、氣質聯用等，它們通常具有較高的精度和靈敏度，但缺點是儀器昂貴、樣品預處理複雜以及需要專業的技術人員。相對而言，電化學檢測技術是一種更加簡便、快速和低成本的方法。有機磷農藥的電化學檢測主要分三類：直接氧化法、水解法、酶抑制法。其中，直接氧化法是最簡便的，但是它只適用於小部分本身能發生氧化還原反應的有機磷農藥。水解法是利用有機磷水解酶水解農藥，通過檢測水解產物來檢測有機磷農藥，該方法適用於大部分的有機磷農藥，然而有機磷水解酶的合成複雜，目前市場上無法買到酶活力較高的有機磷水解酶。酶抑制法是目前有機磷農藥電化學檢測中運用最廣泛的方法。有機磷農藥對乙醯膽鹼酯酶具有抑制作用，通過檢測乙醯膽鹼酯酶催化硫代乙醯膽鹼水解產生的硫代膽鹼來反應乙醯膽鹼酯酶的被抑制程度，進而推算出有機磷農藥的濃度。然而，酶的穩定性包括乙醯膽鹼酯酶在內一直都是一個問題。除此之外，一些低毒的有機磷農藥需要代謝活化之後才能抑制乙醯膽鹼酯酶。根據發明人之前的研究結果，毒死蜱是一種含有「P＝S」鍵的有機磷農藥，它需要被氧化成「P＝O」鍵來提高對乙醯膽鹼酯酶的毒性，從而更有效的通過酶抑制法來對其進行檢測，但是氧化農藥及中和過量氧化劑的過程使得檢測步驟更加繁瑣。技術實現要素：本發明的目的是針對現存有機磷農藥電化學檢測方法的不足，提供一種全新的通用的有機磷農藥電化學檢測方法，該方法具有簡便、快速、穩定、低成本、廣譜等優點。為此，本發明採用以下技術方案：一種通用的有機磷農藥無酶抑制電化學檢測方法，其特徵在於，它採用以氯解磷定溶液作為探針的，對於待測有機磷農藥的峰電流強度抑制率-有機磷農藥濃度標準曲線；並包括以下步驟：(1)待測樣品預處理：取待測農產品樣本，加入緩衝溶液中，浸泡，取上清液待測；(2)待測樣品有機磷農藥殘留檢測：取步驟(1)上清液，加入氯解磷定溶液作為探針，使用電化學方法測量其氧化峰電流，根據同濃度探針溶液在無待測樣品的緩衝液中的氧化峰電流大小，計算其峰電流強度抑制率，根據所述標準曲線得出溶液中有機磷農藥濃度，計算農產品中有機磷農藥殘留量。進一步地，所述標準曲線採用以下方法繪製：在緩衝溶液中，加入氯解磷定溶液作為探針，使用電化學方法測量其氧化峰電流，再向其中加入已知濃度的有機磷農藥，使用同種電化學方法測量此時的氧化峰電流，計算峰電流強度抑制率；使用不同濃度有機磷農藥，重複上述步驟；繪製峰電流強度抑制率-有機磷農藥濃度標準曲線。所述步驟(2)待測樣品有機磷農藥殘留檢測所用的電化學測量方法與繪製標準曲線所使用的方電化學測量法相同。進一步地，進行所述電化學方法測量的電化學工作站包含電化學檢測儀器以及三電極系統。電化學檢測儀器可以如CHI440C，CHI660E，CHI760E電化學檢測儀等。三電極系統中包括工作電極，如玻碳電極、各類修飾電極等；參比電極，如Ag/AgCl電極等；對電極，如鉑電極等。進一步地，所述緩衝溶液選擇範圍包括磷酸緩衝液、醋酸緩衝液、Tris緩衝液等。進一步地，所述緩衝溶液pH優選為7.0。進一步地，所述氯解磷定在檢測體系中的濃度可根據待測有機磷農藥濃度調節如25μM、50μM、100μM等。另外，並非所有解磷定均能作為電化學探針，如碘解磷定，其中碘離子會在鄰近特徵峰附近產生明顯信號峰，幹擾檢測。進一步地，所述電化學方法的選擇範圍包擴差分脈衝伏安法、方波伏安法等。進一步地，所述的峰電流強度抑制率計算方法為：峰電流強度抑制率＝(氯解磷定初始峰電流強度-加入有機磷農藥後峰電流強度)÷氯解磷定初始峰電流強度×100％。進一步地，所述葉菜類農產品質量與緩衝液比例為1g：10mL，非葉菜類農產品質量與緩衝液比例為2g：10mL。本發明的有益效果：本發明檢測方法具有簡便、快速、穩定、低成本、廣譜等優點。作為電化學檢測方法相較於傳統方法，其本身具有簡便、快速、低成本等優點。所述氯解磷定為有機磷農藥解毒劑，其分子結構中含有季銨基團，既能與游離的有機磷農藥結合，成為無毒的化合物排出體外；也能在一定程度上恢復膽鹼酯酶的活性。相較於現存三類有機磷農藥電化學檢測方法，本發明中使用的氯解磷定相較於乙醯膽鹼酯酶和有機磷水解酶更易保存，更穩定，且可從醫院、製藥廠、化學試劑公司獲得，相比於乙醯膽鹼酯酶成本更低，相比於合成複雜尚且沒有商品化的有機磷水解酶，氯解磷定更易獲得。並且，氯解磷定能與大部分有機磷農藥發生反應，其適用範圍超過那些本身可以發生氧化還原反應的有機磷農藥和能對乙醯膽鹼酯酶具有強烈抑制作用的有機磷農藥。因此，本發明中的有機磷農藥電化學檢測方法具有更加廣譜的使用範圍。附圖說明圖1為採用實施例1中所述方法繪製的毒死蜱檢測標準曲線(a：0μM，b:0.025μM，c:0.28μM，d:0.79μM，e:3.33μM，f:13.5μM，g:空白對照)。圖2為採用實施例1中所述方法繪製毒死蜱標準曲線的擬合線。圖3為採用實施例2中所述方法繪製的倍硫磷檢測標準曲線(a：0μM，b:0.18μM，c:0.45μM，d:1.17μM，e:8.35μM，f:15.5μM，g:空白對照)。圖4為採用實施例2中所述方法繪製倍硫磷標準曲線的擬合線。圖5為採用實施例3中所述方法繪製的甲基對硫磷檢測標準曲線(a：0μM，b:0.38μM，c:2.28μM，d:6.08μM，e:11.78μM，f:19.37μM，g:空白對照)。圖6為採用實施例3中所述方法繪製甲基對硫磷標準曲線的擬合線。具體實施方式為了更好的說明本發明，下面通過實施例予以進一步說明。以下實施例中：(1)氯解磷定溶液配製：氯解磷定可選用粉末藥品，溶於去離子水。也可選擇氯解磷定注射劑，用去離子水稀釋到所需濃度。以下實施例中選擇的檢測液中氯解磷定濃度為100μM。(2)緩衝液配製：磷酸緩衝液，可選用納鹽或鉀鹽，用去離子水配製pH7.0緩衝溶液。以下實施例選用緩衝濃度為0.1M。(3)農藥配製：可選用粉末藥品或標準溶液，用有機溶劑如丙酮、乙醇、甲醇等稀釋到所需濃度。(4)電化學工作站搭建：以下實施例中選用CHI440C電化學檢測儀，以玻碳電極作為工作電極，Ag/AgCl作為參比電極，以鉑電極作為對電極。(5)電化學檢測參數設定：以下實施例均採用差分脈衝伏安法，電位範圍：0.5～1V，電位增量：0.004V，振幅：0.05V，脈衝寬度：0.05s，採樣寬度：0.0167s，脈衝周期：0.2s。(6)繪製標準曲線：以下實施例，在pH7.0磷酸緩衝溶液中，以100μM氯解磷定溶液作為探針，使用差分脈衝伏安法測其氧化峰電流，再向其中加入已知濃度的有機磷農藥，測量此時的氧化峰電流，計算峰電流強度抑制率。使用一系列已知的不同濃度的有機磷農藥，重複上述步驟。繪製氧化峰電流強度抑制率-有機磷農藥濃度標準曲線。(7)農產品有機磷殘留檢測：以下實施例，取3g葉菜或6g非葉菜農產品，切塊，加入30mL磷酸緩衝液，浸泡2min，靜置。取上清液，加入100μM氯解磷定溶液作為探針，使用脈衝伏安法測其氧化峰電流，根據標準曲線得出溶液中有機磷農藥濃度，計算農產品中有機磷農藥殘留量。(8)加標回收率試驗：在(7)的基礎上，加入已知濃度和種類的有機磷農藥，進行加標回收率試驗驗證本發明可行性。實施例1毒死蜱檢測標準曲線繪製：步驟如上(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)所述。其中，磷酸緩衝液配製選擇二水合磷酸二氫鈉與十二水合磷酸氫二鈉；毒死蜱粉末用乙醇溶解，檢測體系中的毒死蜱濃度梯度為0.025,0.28,0.79,3.33,13.5μM。繪製峰電流強度抑制率-有機磷農藥濃度標準曲線，見圖1；根據標準曲線繪製擬合線，見圖2。實施例2倍硫磷檢測標準曲線繪製：步驟如上(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)所述。其中，磷酸緩衝液配製選擇二水合磷酸二氫鈉與十二水合磷酸氫二鈉；倍硫磷為甲醇基體的標準溶液，取不同體積加入檢測體系，倍硫磷濃度梯度為0.18,0.45,1.17,8.35,15.5μM。繪製峰電流強度抑制率-有機磷農藥濃度標準曲線，見圖3；根據標準曲線繪製擬合線，見圖4。實施例3甲基對硫磷檢測標準曲線繪製：步驟如上(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)所述。其中，磷酸緩衝液配製選擇二水合磷酸二氫鈉與十二水合磷酸氫二鈉；甲基對硫磷為甲醇基體的標準溶液，取不同體積加入檢測體系，甲基對硫磷濃度梯度為0.38,2.28,6.08,11.78,19.37μM。繪製峰電流強度抑制率-有機磷農藥濃度標準曲線，見圖5；根據標準曲線繪製擬合線，見圖6。實施例4加標回收率試驗：(1)3g大白菜，加入30mL磷酸緩衝液，浸泡2min，取浸出液測量得到抑制率1，根據抑制率計算得有機磷農藥濃度1，再向其中加入1.02μM毒死蜱，得抑制率2，計算得總濃度2，回收率根據公式：回收率＝(濃度2-濃度1)÷加標量×100％計算加標回收率。(2)3g小青菜，加入30mL磷酸緩衝液，浸泡2min，取浸出液測量得到抑制率1，根據抑制率計算得有機磷農藥濃度1，再向其中加入3.59μM倍硫磷，得抑制率2，計算得總濃度2，根據回收率公式計算加標回收率。(3)6g玉米，加入30mL磷酸緩衝液，浸泡2min，取浸出液測量得到抑制率1，根據抑制率計算得有機磷農藥濃度1，再向其中加入5.70μM甲基對硫磷，得抑制率2，計算得總濃度2，根據回收率公式計算加標回收率。以上實驗結果見表1：樣本農藥殘留加標農藥加標量(μM)回收率(％)大白菜未檢出毒死蜱1.0298.9±4.0小青菜未檢出倍硫磷3.59101.2±2.0玉米未檢出甲基對硫磷5.70105.0±0.8當前第1頁1 2 3