提高植物對病源、乾旱和高鹽逆境脅迫抗性的方法
2024-04-05 06:07:05
專利名稱：提高植物對病源、乾旱和高鹽逆境脅迫抗性的方法
技術領域：
本發明屬於植物分子生物學和基因工程技術領域，具體涉及一種提高植物對病源、乾旱和高鹽逆境脅迫抗性的方法。
背景技術：
隨著植物基因組學和多種研究手段的發展，對植 物抗逆的分子機理有了較多的了解，逆境誘導信號轉導途徑較清楚的至少有3條一是依賴於ABA的傳導途徑；二是獨立於ABA的脅迫誘導基因的表達；三是部分依賴於ABA的信號途徑，如擬南芥似泛劃基因(Yamaguchi SK et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA，103，1988-1993，2006)。除此之外，現在還發現包括油菜素內酯、乙烯、茉莉酸、水楊酸等物質在植物抗旱耐鹽脅迫中也扮演著重要角色(Kaschani F et al. , Curr. Opin. Chem. Biol. , 11,88-98,2007 ；Catinot J etal. , FEBS Lett. ，4，473-478，2008)。利用合適的外源性化學物質調控大田生長作物中某些基因的表達，對於農業生產和糧食生產相當關鍵，尤其是對於以下幾類在轉基因植物中有較高應用價值的基因(1)增加目的營養物質在種子、根、莖中的積累；(2)在植物生長發育周期內某一時段產生某產物併集聚於某一植物組織內以便於收集或/和分離；(3)在病原攻擊的位置啟動對於某一蟲害有特異毒性的毒素的表達；(4)提高植物抵抗多種逆境尤其是乾旱，鹽鹼的能力；(5)對目標植物的生長周期進行調節。第二點可使生物反應器具有更高的效率，而第四點能更好的提高大田作物忍受惡劣天氣的能力，保障正常生長。烯丙異噻唑probenazole (3-allyloxy-l, 2-benzisothiazole-l, I- dioxide,PBZ)，是防治稻瘟病的優良試劑，是目前日本殺菌劑中用量最大的品種之一。PBZ本身以及其代謝物不具有生物活性，並不影響稻瘟病的生長和對植物的侵染能力，它主要是通過激活植物自身的系統獲得抗性的抗病機制而使植物產生抗病性(Michiaki Lwata, The RoyalSociety of Chemistry Pesticide Outlook, 28-31, 2001)。PBZ 可以誘導擬南芥和菸草等雙子葉植物產生系統獲得抗性，在水稻等單子葉植物中可通過類似的抗病反應誘導植物產生抗病性。本發明研究小分子物質PBZ時首先發現了 PBZ能夠提高擬南芥對多種逆境脅迫的抗性，並隨即對這一現象展開了系統的研究。形態學觀察、順式元件誘導變化、基因晶片分析和突變體阻斷分析等手段最終確定了 PBZ誘導提高擬南芥對多種逆境脅迫抗性的大致信號途徑，為進一步通過篩選和利用小分子物質提高植物在生長生活中的綜合優勢提供了可能。
發明內容
本發明的目的是提供一種能夠提高植物多種逆境脅迫(包括病源、乾旱和高鹽等逆境脅迫)抗性的方法。本發明提供的提高植物多種逆境脅迫(包括病源、乾旱和高鹽等逆境脅迫)抗性的方法，採用化學誘導劑一烯丙異噻唑進行誘導，即對植物施加化學誘導劑PBZ，施加的方式可以為噴施PBZ溶液。噴施時，PBZ溶液濃度控制為O. 3—0.6禮，優選濃度為O. 5mM。植物材料為營養生長後期的植物材料。為了增強化學誘導劑PBZ施加的效果，本發明還對植物組織或細胞導入擬南芥AtNPRl基因或擬南芥基因。本發明中，所述的擬南芥基因，具有SEQ ID NO: I編碼的DNA序列的多核苷酸序列，或者編碼SEQ ID NO :2胺基酸序列的多核苷酸系列。擬南芥AtNPRl編碼蛋白，是具有SEQ ID NO: 2胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ ID NO: 2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加具有與SEQ ID NO: 2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。本發明中，所述的擬南芥基因，具有SEQ ID NO: 3編碼的DNA序列的多核苷酸序列，或者編碼SEQ ID NO :4胺基酸序列的多核苷酸。擬南芥AtICSl編碼蛋白，是具有SEQ ID NO: 4胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ ID NO: 4的胺基酸殘基序列經 過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加具有與SEQ ID NO: 4的胺基酸殘基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白質。本發明的上述基因在植物提高植物多種逆境脅迫抗性中發揮重要作用。本發明還提供一種在植物中引起所選擇的基因產物表達增高的方法，具體步驟如下
(1)用重組DNA結構轉化植物；
(2)用化合物PBZ處理轉基因植物；
(3)使轉基因植物在期望的時候增加所選擇的基因產物的表達。本發明中，所述的植物可以為水稻、玉米等。
圖I為在乾旱脅迫處理16天後，野生型擬南芥分別在PBZ處理和水處理下的抗旱性表現。圖2為在乾旱脅迫處理後復水，野生型擬南芥分別在PBZ處理和水處理下的存活情況。圖3為在300mM NaCl處理下，野生型擬南芥分別在PBZ處理和水處理下的抗鹽性表現。圖4為在乾旱脅迫處理18天後，野生型擬南芥和轉基因擬南芥分別在PBZ處理和水處理下的抗旱性表現。其中，(a) PBZ處理的野生型擬南芥材料；(b)水處理的野生型擬南芥材料；(c) PBZ處理的轉似況7基因的擬南芥材料；(d)水處理的轉似況7基因的擬南芥材料。圖5為在乾旱脅迫處理18天後，AtICSl轉基因擬南芥分別在PBZ處理和水處理下的抗旱性表現。圖6為在乾旱脅迫處理13天後，野生型玉米分別在PBZ處理和水處理下的抗旱性表現。圖7為在乾旱脅迫處理13天後，野生型玉米分別在PBZ處理和水處理下的相對含水量情況。
圖8為在乾旱脅迫處理13天後，野生型玉米分別在PBZ處理和水處理下的丙二醛積累情況。圖9為在乾旱脅迫處理下，野生型水稻分別在PBZ處理和水處理下的抗旱性表現。
具體實施例方式實施例I、擬南芥和編碼基因的獲得。I. I RNA 提取
取擬南芥葉片約O. lg。液氮充分研磨後，轉移到1.5ml離心管，加Iml TRIzoIe(invitrogen公司),混勻後,室溫放置15分鐘,加O. 2ml氯仿:異戍醇(24:1),劇烈搖動15秒後室溫放置5分鐘，13000rpm，4°C離心15分鐘。取上清液並加入等體積異丙醇，小心混勻，室溫放置15分鐘，13000rpm，4°C離心15分鐘。70%乙醇洗滌沉澱，室溫乾燥15分鐘。溶解於適量的經O. 1% DEPC處理過的ddH20水中，貯存於_80°C備用。I. 2 cDNA第一鏈合成和反轉錄PCR
採用上海申能博彩生物技術公司(SHBC)的cDNA第一鏈合成試劑盒，按照操作指南將總RNA反轉錄成cDNA。反應體系和反應條件分別為2ug製備的總RNA，0. 5ul Rnaseinhibitor,加DEPC處理過的去離子水至8. 5ul, 2ul 的01igo(dT)18 primer. 65°C 5min,室溫放置 IOmin, 13000rpm 離心 5s。再依次加入 4μ1 5XFirst-Strand buffer,0. 5M-1RNase Inhibitor, 2μ1 IOOmM DTT, 2M-I dNTP, IM-I MMLV Reverse Transcriptase。小心混勻；37°C反轉錄I小時，90°C 5分鐘；冰上冷卻；13000rpm短暫離心5秒鐘，存放於-20°C待用。I. 3 AtNPRl和AJC57全序列的獲得
根據擬南芥資料庫給出的序列，設計了 SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6作為克隆全序列的PCR反應的引物，SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8作為克隆全序列的PCR反應的引物。PCR反應體系為50ul，反應條件為94°C預變性5min，94°C變性40s，58°C復性40s，72°C延伸60s，循環35次。72°C充分延伸lOmin。將所得的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離。回收並且通過TA克隆至TAKARA pMD-19-T載體後，由上海英駿公司測序，獲得A tNPRl和A tICSl的序列。實施例2、擬南芥J tNPRl和A tICSl轉基因分析。2. I LBA4404農桿菌感受態細胞製備
1)在含利福黴素40ug/ml，鏈黴素100ug/ml的YEB固體培養基上劃線，28°C培養48h-72h ；
2)挑單菌落到含利福黴素40ug/ml，鏈黴素100ug/ml的YEB液體培養基中28°C培養至 0D600 0. 5 ；
3)冰上冷卻菌液，5000rpm,4°C 10分鐘收集菌體；
4)ImM Hepes pH 7. O洗滌3次，再用10%甘油洗滌一次；
5)懸浮菌體於3ml10%甘油中，分裝至Ij I. 5ml離心管中，每管40ul。2. 2農桿菌轉化
I)200ng質粒DNAjP 40ul農桿菌感受態細胞混勻後按以下條件進行電轉化；U I. 8 KV R 200 Ω C 25 uF
2)電擊後添加800ulSOC液體培養基，28°C培養Ih ；
3)4000rpm,10分鐘收集菌體，懸浮於200ul SOC中，塗在含100 ug/ml壯觀黴素，利福平40ug/ml，鏈黴素100ug/ml LB固體培養基上，28°C倒置培養48h_72h。2. 3農桿菌介導的擬南芥轉化
擬南芥基質培養
基質組分蛭石黑土珍珠巖=9 : 3 : 0.5 營養液組分
權利要求
1.一種提高植物病源、乾旱和高鹽逆境脅迫抗性的方法，其特徵在於採用化學誘導劑--烯丙異噻唑進行誘導，即對植物施加化學誘導劑PBZ，施加的方式為噴施PBZ溶液；噴施時，PBZ溶液濃度控制為O. 3—0. 6 mM。
2.根據權利要求I所述的提高植物病源、乾旱和高鹽逆境脅迫抗性的方法，其特徵在於還對植物組織或細胞導入擬南芥基因或擬南芥JiJCM基因； 所述的擬南芥基因，具有SEQ ID NO: I編碼的DNA序列的多核苷酸序列，或者編碼SEQ ID NO 2胺基酸序列的多核苷酸系列； 所述的擬南芥基因，具有SEQ ID NO: 3編碼的DNA序列的多核苷酸序列，或者 編碼SEQ ID NO :4胺基酸序列的多核苷酸。
3.—種在植物中引起所選擇的基因產物表達增高的方法，其特徵在於具體步驟如下 (1)用重組DNA結構轉化植物； (2)用化合物PBZ處理轉基因植物； (3)使轉基因植物在期望的時候增加所選擇的基因產物的表達。
4.根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於所述的植物為水稻或玉米。
5.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的植物為水稻或玉米。
全文摘要
本發明屬於植物分子生物學和基因工程技術領域，具體為一種提高植物對病源、乾旱和高鹽逆境脅迫抗性的方法。本發明採用化學誘導劑—PBZ(烯丙異噻唑)進行誘導，即對植物施加化學誘導劑PBZ，施加的方式為噴施PBZ溶液；噴施時，PBZ溶液濃度控制為0.3—0.6mM；為了提高施加化學誘導劑PBZ的效果，還對植物組織或細胞導入擬南芥AtNPR1基因或擬南芥AtICS1基因。
文檔編號A01G7/06GK102630512SQ201210104599
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月11日 優先權日2012年4月11日
發明者張建建, 楊進孝, 王曉彥, 蒯本科, 高炯 申請人:復旦大學