合成的抗微生物多肽的製作方法

2023-11-08 06:22:12

專利名稱：：合成的抗微生物多肽的製作方法合成的抗微生物多肽本申請是於2004年9月13日提出的、申請號為200480033242.5、發明創造名稱為"合成的抗微生物多肽"的中國發明專利申請的分案申請。
背景技術：
：抗微生物肽(AMP)是相對新近發現的一組具有新作用模式的抗微生物劑。AMP廣泛分布於動物、植物和微生物並且屬於最古老的宿主防禦因子。絕大多數的該種肽在天然情況下是陽離子的和兩親性的；該特性允許與帶負電荷的細菌或真菌的膜相互作用。該種肽大小範圍從6-7個胺基酸至60個胺基酸。迄今為止已經分離出500種以上不同的AMP。基於結構或M酸組成可以將它們分為幾類。最簡單的結構是小的"-螺旋肽。其它AMP摺疊形成/3-片層結構，而另外的再次形成剛性的二硫橋連接的三級結構。AMP通常是殺微生物的(與靜止相對)並且作用極其快。通常，乾生物在幾分鐘之內被殺死。它們通過幹擾把生物的膜功能而起作用。已經顯示存在幾種不同的作用機制，但是對於大多數AMP，總體結果AM破裂和/或細胞裂解。對微生物膜的選擇性是由膜組成、膜電荷和跨膜電位介導的。微生物膜比更高等生物的膜具有較高的負電荷，其包含不同類型的磷脂而不含膽固醇。已經證明在耙生物中誘導對AMP的抗性極端困難。這是乾標的原因；為了顯著性改變膜組成或電荷，靶標將不得不發生多重基因組改變。發明概述在本發明的第一個方面涉及具有抗微生物活性的多肽，其包含胺基酸序列XrX2-XrX4-Xs;其中&、X2、X3、X4和X5中的每一個選自M^f列P-P-R陽F、P-R-F-P、R-F誦P-P、F-P-P畫R、P-R畫P-F、R-P-F-P、P-F-P-R、F-P-R-P、P-P-F-R、P-F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P誦P-R-L、P-R-L國P、R-L畫P-P、L誦P-P-R、P-R-P-L、R-P-L國P、P誦L-P-R、L-P-R-P、P國P-L-R、P-L-R-P、L-R陽P-P、R-P-P隱L、P-P畫R-V、P-R-V-P、R-V-P-P、V-P-P-R、P-R-P-V、R誦P-V-P、P-V-P畫R、V-P-R-P、P-P-V-R、P誦V-R-P、V畫R-P-P、R-P-P-V、P畫P-R-I、P曙R-I曙P、R-I-P-P、I-P-P-R、P隱R-P畫I、R-P-I-P、P-I-P-R、I誦P-R-P、P畫P小R、P小R-P、I-R-P畫P和R-P-P-I;並且其中X廣Xs中最多4個是相同的。在本發明的第二個方面涉及具有編碼本發明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。在本發明的第三個方面涉及包含編碼本發明多肽的核苷酸序列的核酸構建體，該核苷酸序列與指導多肽在適當宿主中產生的一個或多個控制序列有效連接。在本發明的第四個方面涉及包含本發明核酸構建體的重組表達栽體。在本發明的第五個方面涉及包含本發明核酸構建體的重組宿主細胞。在本發明的第六個方面涉及生產本發明多肽的方法，該方法包括(a)在有利於多肽產生的條件下培養重組宿主細胞；和(b)回收多肽。本發明的其它方面在以下描述和附加權利要求中是顯而易見的。定義在更加詳細地討論本發明之前，首先定義以下術語和規定抗微生物活性:術語"抗微生物活性"文中定義為能夠殺死或抑制微生物細胞生長的活性。在本發明的上下文中，術語"抗微生物的"旨在指具有殺菌和/或抑菌和/或殺真菌和/或抑真菌作用和/或殺病射用，其中術語"殺菌的"應理解為能夠殺死細菌細胞。術語"抑菌的，，應理解為能夠抑制細菌生長，即抑制正在生長的細菌細胞。術語"殺真菌的"應理解為能夠殺死真菌細胞。術語"抑真菌的"應理解為能夠抑制真菌生長，即抑制正在生長的真菌細胞。術語"殺病毒的"應理解為能夠使病毒失活。術語"微生物細胞"指細菌或真菌細胞(包括酵母)。在本發明的上下文中，術語"抑制微生物細胞生長"旨在指細胞處於非生長狀態，即它們不能夠繁殖。為了本發明的目的，按照Lehrer等(JournalofImmunologicalMethods,第137巻，(2)第167-174頁，1991)所描述的方法可以確定抗微生物活性。在具有抗微生物活性多肽的25。/。(w/w)水溶液中；優選地在10%(w/w)水溶液中；更加優選地在5。/。(w/w)水溶液中；甚至更加優選地在l%(w/w)水溶液中；最優選地在0.5。/。(w/w)水溶液中；並且具體而言在0.1%(w/w)水溶液中於20。C孵育8小時後(優選地4小時後，更加優選地2小時後，最優選地l小時後，並且具體而言30分鐘後)，具有抗微生物活性的多肽能夠將大腸桿菌(五sc/^i7Y^iVicv/,')(DSM1576)的活細胞數量降低至1/100。當加入具有抗微生物活性多肽的濃度為1000ppm時；優選地為500ppm時；更加優選地為250ppm時；甚至更加優選地為100ppm時；最優選地為50ppm時；並且具體而言為25ppm時，該多肽還能夠在25。C下抑制大腸桿菌(DSM1576)在微生物生長基質中生長達24小時。在具有抗微生物活性多肽的25。/。(w/w)水溶液中；優選地在10%(w/w)水溶液中；更加優選地在5。/。(w/w)水溶液中；甚至更加優選地在l%(w/w)水溶液中；最優選地在0.5。/。(w/w)水溶液中；並且具體而言在0.1%(w/w)水溶液中於20。C孵育8小時後(優選地4小時後，更加優選地2小時後，最優選地1小時後，並且具體而言為30分鐘後)，具有抗微生物活性的多肽能夠將枯草芽孢桿菌(5aci7/MSswMto)(ATCC6633)的活細胞數量降低至1/100,當加入具有抗微生物活性多肽的濃度為1000ppm時；優選地為500卯m時；更加優選地為250ppm時；甚至更加優選地為100ppm時；最優選地為50卯m時；並且具體而言為25ppm時，該多肽還能夠在25。C下抑制枯草芽孢桿菌(ATCC6633)在微生物生長基質中生長達24小時。本發明多肽將優選地具有由SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個"H&酸序列所組成多肽的抗微生物活性的至少20%。在特別優選的實施方案中，多肽將具有由SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個胺基酸序列所組成多肽的抗微生物活性的至少40%，例如至少50%，優選地至少60%,例如至少70%,更加優選地至少80%,例如至少90%,最優選地至少95%，例如大約或至少100%。片段:當文中使用時，本發明M,列的"片段"是多肽的亞序列，其中^J^末端和/或g末端的一個或多個胺基酸已經缺失。優選地為從羧基末端缺失一個或多個胺基酸。優選地，片段由至少20個胺基酸組成。等位基因變體:在本文中，術語"等位基因變體"表示佔據同一染色體位點的基因的任意兩種或多種可選擇形式。等位基因變體在天然情況下通過突變產生，並且可以導致種群內的多態性。基因突變可以是沉默的(沒有改變所編碼多肽)或者可以編碼M酸序列發生改變的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體所編碼的多肽。基本上純的多核苷酸:如文中所使用術語"基本上純的多核苷酸"是指多核苷酸製劑，其中多核苷酸已經脫離了其天然遺傳環境並因此不含其它外來的或不必要的編碼序列，並且是適宜在遺傳工程蛋白質生產系統中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸包含最多10%(按重量計算)的例如按重量計算最多8%、最多6%、最多5%、最多4%、最多3%、最多2%、最多1%以及最多0.5%)。然而，基本上純的多核苷酸可以包含天然存在的5，和3，非翻譯區，例如啟動子或終止子。優選地，基本上純的多核苷酸的純度至少為92%(即多核苷酸組成了製劑中存在的總多核普酸物質重量的至少92%)，並且優選更高的百分比，例如純度至少94%、至少95%、至少96%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%,並且最多99.5%。優選地，文中所公開多核苷^A^本上純的形式。具體而言，文中公開的多核苷酸優選地是"本質上純的形式"，即多核苷酸製劑基本上不含與其天然相關的其它多核苷酸物質。在文中，術語"基本上純的多核苷酸"與術語"分離的多核苷酸"和"分離形式的多核苷酸"同義。修飾:在本發明上下文中，術語"修飾"旨在指由胺基酸序列X廣X2-X3-X4-Xs組成的多肽或者SEQIDNO:l至SEQIDNO:319的任意一個M酸序列的任意化學修飾以及對編碼多肽的DNA的遺傳操作；其中XpX2、X3、X4和Xs中的每一個選自絲,列P-P-R-F、P-R-F-P、R曙F誦P畫P、F國P國P畫R、P誦R國P-F、R誦P誦F-P、P誦F-P國R、F-P-R-P、P畫P國F-R、P-F-R國P、F-R-P畫P、R-P-P-F、P-P誦R-L、P誦R國L-P、R畫L國P漏P、L-P誦P-R、P國R曙P曙L、R曙P-L-P、P誦L國P-R、L-P-R-P、P-P-L曙R、P-L-R-P、L-R-P-P、R一p一p誦L、P國P國R-V、P-R-V-P、R國V-P-P、V-P誦P-R、P畫R陽P誦V、R-P-V-P、P-V-P-R、V曙P-R-P、P-P誦V誦R、P-V國R-P、V-R-P-P、R畫P-P-V、P-P-R-I、P-R誦I-P、R誦I誦P國P、I畫P國P國R、P國R畫P-I、R畫P-I-P、P畫I畫P誦R、I-P國R-P、P誦P-I-R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I;並且其中X！-X5中最多4個是相同的。修飾可以是M酸側鏈的替換，目的胺基酸中或目的胺基酸處的替代、缺失和/或插入；或者在J^酸序列中使用具有相似特性的非天然胺基酸。具體而言修飾可以是醯胺化，例如C末端的醯胺化。cDNA:當用於本文中時，術語"cDNA"旨在涵蓋能夠通過逆轉^來自真核細胞的成熟的、剪接的mRNA分子製備得到的DNA分子。cDNA缺^L相應基因組DNA中通常存在的內含子序列。最初的初級RNA轉錄本是mRNA的前體，並且在成為成熟的剪接mRNA之前其將經歷一系列加工事件。這些事件包括通過稱為剪接的過程去除內含子序列。因此當cDNA來自mRNA時其缺乏內含子序列。核酸構建體:當文中使用時，術語"核酸構建體"意思是指單鏈或雙鏈核酸分子，其從天然存在的基因分離得到或者已經進行了修飾以包含自然界中不存在的核酸的片段。當核酸構建體包含本發明編碼序列表達所需的控制序列時，術語核酸構建體與術語"表達盒"同義。控制序列:術語"控制序列"文中定義為包括本發明多^達所必需或者有利於本發明多M達的全部元件。相對於編碼多肽的核苷酸序列，每個控制序列可以是天然的或外來的。每個控制序列包括但不限於前導序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。在最低限度時，控制序列包括啟動子和轉錄及翻譯終止信號。控制序列可以具有接頭，以《更導入便於控制序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區相連接的特異限制性酶切位點。有效連接:術語"有效連接"文中定義為一種構象，其中控制序列適當地放置於與DNA序列的編碼序列相關的位置從而使控制序列指導多肽表達。編碼序列:當用於文中時，術語"編碼序列"旨在涵蓋核苷酸序列，該序列直接指定其蛋白質產物的^J^酸序列。編碼序列的邊界通常通過開放閱讀框確定，開放閱讀框通常起始於ATG起始密碼子。編碼序列一般包括DNA、cDNA和重組核苷酸序列。表達:在本發明的上下文中，術語"表達"包括參與多肽產生的任何步驟，其包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯和翻譯後修飾。優選地，表達還包括多肽的分泌。表達載體:在本發明的上下文中，術語"表達載體"涵蓋線性或環狀DNA分子，其包含編碼本發明多肽的片段，並且其與用於其轉錄的另外片段有效連接。宿主細胞:如文中所使用，術語"宿主細胞"包括易於用核酸構建體轉化的任何細胞類型。在題目為"具有抗微生物活性的多肽"的部分中定義術語"多核苷酸探針"、"雜交"以及各種嚴格性條件，發明詳述具有抗微生物活性的多肽在第一個方面，本發明涉及具有抗微生物活性的多肽，並且其中多肽包含4^酸序列XrX2-X3-XrX5，優選地多肽由^J^酸序列Xi-X2-X3-X4-X5組成；其中X"X2、X3、X4和Xs獨立地為P-P-R-Z"P-R-Z2-P、R誦Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Zs、R-P-Z6-P、P-Z7-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9-R、P-Z10-R-P、Zn-R-P誦P或R-P-P-Z12;其中Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、Z10、Zn和Zu獨立地為F、L、V或I。本發明還涉及具有抗微生物活性的多肽，並且其中多肽包含M,列XrX2-X3-X4-Xs，優選地多肽由^t^酸序列XrX2-X3-X4-Xs組成；其中X2、X3、X4和Xs中的每一個選自^J^酸序列P-P-R-F、P-R-F國P、R隱F-P畫P、F國P-P曙R、P-R國P-F、R-P國F腸P、P-F-P-R、F-P誦R-P、P-P-F-R、P-F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P-P-R-L、P誦R丄-P、R丄誦P誦P、L國P誦P-R、P-R-P誦L、R-P-L-P、P-L誦P-R、L-P-R-P、P-P-L-R、P-L誦R-P、L誦R-P-P、R-P-P-L、P-P-R-V、P-R-V-P、R誦V誦P-P、V-P隱P-R、P陽R-P-V、R國P國V-P、P-V-P-R、V-P隱R-P、P-P國V國R、P-V-R-P、V國R-P誦P、R-P-P-V、P-P誦R-I、P誦R-I-P、R-I-P-P、I-P-P國R、P-R-P-I、R-P-I-P、P國I國P畫R、I-P畫R誦P、P-P-I-R、P-I-R-P、I-R-P-P和R誦P-P誦I。在一個實施方案中，X2、X3、X4和Xs選自^酸序列P-P-R-Zi、P-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Zs、R-P-Z6-P、P-Z-P-R、Z8-P-R-P、P國P醫Z9國R、P-Z10-R-P、Zn-R-P國P和R-P-P-Z12;其中除了Z廣Zu^^酸以外Xi-Xs是相同的；其中ZrZu選自胺基酸F、L、V和I。優選地，XrXs中最多4個是相同的；更加優選地為XrXs中最多3個是相同的，甚至更加優選地為XrX5中最多2個是相同的；最優選地為&《5不相同。在另一個實施方案中，除了Xn、X2、X3、X4和Xs的Z^Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、Z10、Zu和Z12獨立地為F、L、V或I以外；X屍X屍X3-X4-Xs為P-P-R-Zi、P-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Z5、R-P-Z6-P、P-Z7-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9-R、P-Z1(rR-P、Z"-R-P-P或R-P-P-Z12。在另一個實施方案中，本發明涉及具有抗微生物活性的多肽，並且其中多肽包含胺基酸序列XrX2-X3-X4-Xs-X6，優選地多肽由胺基酸序列X廣X2-X3-X4-Xs-X6組成；其中X"X2、X3、X4、Xs和&獨立地為P-P-R-Z"P-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P曙R-P-Zs、R-P-Z6-P、P-Z7-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9-R、P-Z10-R-P、Zu-R-P-P或R-P-P-Z12;其中Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、Z1、Zn和Zu獨立地為F、L、V或I。在另一個實施方案中，本發明涉及具有抗微生物活性的多肽，並且其中多肽包含胺基酸序列X^X2-X3-X4-Xs-X6，優選地多肽由胺基酸序列XrX2-X3-X4-Xs-X6組成；其中X2、X3、&、Xs和X6中的每一個選自^J^^f歹'J:P-P-R-F、P-R-F-P、R-F曙P-P、F國P誦P-R、P國R-P國F、R-P-F曙P、P-F-P國R、F-P-R-P、P隱P-F-R、P-F陽R-P、F國R-P畫P、R-P國P-F、P-P曙R-L、P醫R-L-P、R誦L誦P-P、L國P-P-R、P-R-P-L、R-P-L誦P、P-L-P-R、L誦P-R-P、P-P-L誦R、P-L誦R-P、L-R誦P畫P、R-P-P-L、P畫P-R-V、P-R曙V-P、R-V-P-P、V-P-P-R、P-R-P-V、R誦P-V-P、P畫V-P-R、V-P-R-P、P-P-V-R、P-V畫R誦P、V-R-P漏P、R-P-P-V、P-P誦R畫I、P-R-I誦P、R-I畫P國P、I-P-P-R、P-R-P-I、R曙P-I-P、P小P國R、I曙P畫R誦P、P畫P-I誦R、P-I-R-P、I-R-P誦P和R-P-P-I。在另一個實施方案中，X2、X3、X4、Xs和X6選自M酸序列P誦P-R-ZpP隱R誦Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R畫P-Zs、R-P-Z6-P、P-Z7-P國R、Zs-P誦R-P、P-P-Z9畫R、P-Z10-R-P、Zu-R-P-P和R-P-P-Z12;其中除了&-Z12胺基酸以外X廣X6是相同的；其中ZrZu選自胺基酸F、L、V和I。優選地，XrX6中最多4個是相同的；更加優選地為Xr"X6中最多3個是相同的，甚至更加優選地為XrX6中最多2個是相同的；最優選地為X^X6不相同。在另一個實施方案中，除了X2、X3、X4、Xs和X6的Z^Z2、Z3、Z4、Zs、Z6、Zr、Z8、Z9、Z10、Zu和Zu獨立地為F、L、V或I以外；Xi=X2=X3=X4=Xs=X6為P-P-R-Zi、P-R畫Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P誦R醫P誦Zs、R-P-Z6-P、P誦Z7-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9誦R、P-Z10-R-P、Zu-R-P-P或R-P-P-Z12。在優選的實施方案中，本發明涉及具有抗微生物活性的多肽，並且其中多肽包含SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個的絲酸序列，優選地多肽由SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個的M酸序列組成。還在另一個實施方案中，^J^酸序列與^J^酸序列XrX2-X3-X4-Xs最多5個胺基酸(例如5個胺基酸)、例如最多4個胺基酸(例如4個JIJl酸)、例如最多3個胺基酸(例如3個胺基酸)、特別是最多2個胺基酸(例如2個胺基酸)、例如l個胺基酸不同；其中&、X2、X3、X4和Xs中的每一個選自P國P-R-F、P國R-F-P、R-F-P誦P、F-P-P-R、P國R-P-F、R-P-F畫P、P-F-P-R、F-P-R-P、P-P-F-R、P-F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P-P-R-L、P-R國L-P、R-L-P-P、L-P-P誦R、P-R-P-L、R-P畫L-P、P國L-P畫R、L-P-R-P、P國P-L誦R、P-L-R-P、L-R-P-P、R國P畫P畫L、P-P-R-V、P-R-V-P、R-V-P-P、V-P-P-R、P-R國P曙V、R畫P-V國P、P-V-P-R、V國P-R-P、P誦P國V誦R、P國V-R-P、V-R-P-P、R隱P誦P隱V、P-P畫R誦I、P-R-I-P、R-I-P國P、I曙P-P-R、P-R-P-I、R誦P-I-P、P國I-P-R、I國P國R-P、P-P國I曙R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I;或者^J^紗列與M酸序列X,-X2-X3-X4-Xs-X6最多5個胺基酸(例如5個胺基酸)、例如最多4個胺基酸(例如4個胺基酸)、例如最多3個胺基酸(例如3個胺基酸)、特別是最多2個胺基酸(例如2個胺基酸)、例如1個M酸不同；其中X"X2、X3、X4、X5和X6中的每一個選自P-P-R-F、P-R-F-P、R誦F-P-P、F-P-P-R、P謹R-P-F、R國P誦F國P、P-F-P-R、F畫P醫R-P、P-P-F-R、P-F-R誦P、F-R-P-P、R-P-P-F、P-P誦R-L、P-R-L國P、R曙L-P-P、L-P-P-R、P-R-P誦L、R-P-L-P、P-L誦P-R、L-P畫R-P、P-P誦L-R、P-L-R畫P、L-R-P誦P、R-P-P-L、P-P-R-V、P-R畫V-P、R-V國P畫P、V-P-P國R、P-R-P-V、R-P-V-P、P-V國P國R、V-P-R隱P、P畫P誦V-R、P國V-R-P、V-R誦P-P、R-P-P-V、P-P國R-I、P-R隱I-P、R-I-P-P、I-P誦P誦R、P-R-P-I、R-P小P、P-I誦P畫R、I-P畫R-P、P-P-I誦R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I;或者^J^酸序列與SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個的JL&酸序列最多5個胺基酸(例如5個胺基酸)、例如最多4個胺基酸(例如4個胺基酸)、例如最多3個胺基酸(例如3個胺基酸)、特別是最多2個胺基酸(例如2個胺基酸)、例如1個胺基酸不同。優選地，本發明的多肽包含胺基酸序列XrXrXrXrXs或X廣X2畫X3-X4-Xs-X6或SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個絲酸序列；或者具有抗微生物活性的其片段。在另一個優選的實施方案中，多肽由^J^酸序列X廣XrX3-X4-Xs或X廣XrX3-X4-Xs-X6或SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個M酸序列組成'組成本發明多肽的氛基酸可以獨立地選自D型或L型。本發明的多肽可以由20-500個胺基酸、優選20-400個胺基酸、更加優選20-300個胺基酸、甚至更加優選20-200個胺基酸(例如20-150個胺基酸)、最優選20-100個胺基酸並且具體而言20-50個胺基酸組成。在M酸序列X^X2-X3-X4-Xs或XrX2-X3-X4-Xs-X6之前立即為3-10個胺基酸(例如3-5個胺基酸)的M酸序列，其中在所述^酸序列當中至少2個JtJ^酸在中性pH時帶正電荷(例如精氨酸、賴氨酸或組氨酸)。優選地，在M酸序列XrX2-X3-X4-Xs或XrXrX3-X4-Xs-X6之前立即為胺基酸序列R-X7-R;其中X7為R、F、L、V或I。術語"之前立即為"意思是氨基,列連接於^J^,列XrX2-X3-XrXs或XrX2-X3-X4-X5-X6的N末端.本發明多肽可以是人工變體，其包含(優選地由其組成)這樣一種胺基酸序列，即所述的胺基酸序列與胺基酸序列XrX2-XrX4-X5或XrX2誦X3-X4-Xs-X6或者SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個^J^酸序列相比具有最多3個、例如最多2個、諸如最多1個M酸替換、缺失和/或插入。此類人工變體可以通過本領域已知的標準技術構建，例如通過將包含絲紗列Xi-XrX3-X4陽Xs或X廣X2-X3-X4-Xs-X6或者SEQIDNO:l至SEQIDNO:319任意一個M酸序列的多肽進行定點/隨機誘變。在本發明的一個實施方案中，胺基酸變化在特性上變化較小，即為不顯著影響蛋白質摺疊和/或活性的保守M酸替換；小的缺失(一般為1個至大約5個胺基酸缺失)；小的JL^末端或a末端延伸(例如Jl^末端蛋氨酸戎基)；多至大約10-25個戎基的小的接頭肽；利於通過改變淨電荷進行純化或者利於其它功能的小的延伸(例如多聚組氨酸、抗原表位或結合結構域)。保守替換的例子是鹼性M酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性疏*^酸組(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和蛋氨酸)、芳香族^J^B(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小M酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)中的組內替換。通常不改變特異活性的M酸替換在本領域中是已知的並且由例如H.Neurath和R.L.HiH(T7re/VotefVw，AcademicPress,1979,NewYork)描述。最常發生的互換為Ala/Ser、Val/IIe、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly,以;M目反的那些互換。在本發明的一個有趣的實施方案中，胺基酸變化使多肽的物理-化學性質改變。例如，可以進行能夠改善多肽熱穩定性、改變底物特異性、改變最適pH等等的胺基酸變化。N末端延伸本發明多肽的N末端延伸可以適當地由1-50個胺基酸、優選2-20個胺基酸、特別是3-15個tJ^酸組成。在一個實施方案中，N末端肽^/f申不包含Arg(R)。在另一個實施方案中，N末端M伸包含如下面將進一步定義的kex2或kex2樣切割位點。在一個優選的實施方案中，N末端延伸為包含至少2個Glu(E)和/或Asp(D)氛基酸殘基的肽，例如包含序列EAE、EE、DE和DD之一的N末端延伸。Kex2位點Kex2位點(見例如MethodsinEnzymology185巻，D.Goeddel編，AcademicPressInc.(1990)，SanDiego，CA，"GeneExpression、極性M酸組(穀氨,和天冬醯胺)、Technology")和kex2樣位點為在一些蛋白質的前肽編碼區和成熟區之間發現的二威基識別位點(即切割位點)。已經表明，在某些情況下kex2位點或kex2樣位點的插入改善了在前肽切割位點處的正確的內肽酶加工，導致蛋白質分泌水平增加。在本發明的上下文中，與胺基酸序列XrX2-X3-X4-Xs或XrX2-X3-X4-Xs-X6或者SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個#^酸序列所示的成熟多JIM目比，kex2或kex2樣位點的插入導致可以在N末端延伸(使抗微生物多肽皿伸)內的一定位點進行切割。融合多肽本發明多肽還包括融合多肽或可切割融合多肽，其中另一個多肽與本發明多肽或其片段的N末端或C末端融合。通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部分)與本發明的核苷酸序列(或其部分)融合產生融合多肽。產生融合多肽的技術在本領域中是已知的，其包括將編碼多肽的編碼序列如此連接以致於使它們處於同一閱讀框並且使融合多肽在同一啟動子和終止子控制下表達。多核香酸和核香^列本發明還涉及具有編碼本發明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。具體而言，本發明涉及由編碼本發明多肽的核苷酸序列組成的多核苷酸。由於遺傳密碼的簡併性，技術人員將容易地認識到可以製備編碼本發明每一多肽的幾種核苷酸序列。在本領域中眾所周知，編碼本發明多肽的胺基酸的密碼子由核苷酸組成。本發明還涉及編碼具有抗微生物活性的tJ^酸序列XrX2-X3-X4-Xs或XrX2-X3誦XrXs-X6或者SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個^J^酸序列的片段的多核苷酸。多核苷酸的亞序列為其中5，和/或3，末端的一個或多個核苷酸已經缺失的核苷酸序列。通過在遺傳工程中使用的標準克隆步驟，可以將核苷酸序列從一個位點。克隆步驟包括包含編碼多肽的核苷酸序列的目的片段的切除和分離、將片段插入栽體分子以及重組栽體整合入宿主細胞，在那裡將複製出核苷酸序列的多重拷貝或克隆。核苷酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成來源、合成來源或其任意組合.編碼本發明多肽的核苷酸序列的修飾對於多肽的合成可能是必需的，其中與列X廣X2-X3-X4曙Xs或X廣X2誦X3-X4-X5隱X6或者SEQIDNO:1至SEQIDNO:319中任意一個U酸序列相比所述多肽所包含的胺基酸序列具有至少一個替換、缺失和/或插入。這些人工變體在某些工程化方式上可能不同於從其天然來源分離得到的多肽，例如在特異活性、熱穩定性、最適pH等等方面不同的變體。可以在分子功能關鍵區域外進行此類修飾，並且此類修飾仍然能夠產生活性多肽，這對於本領域技術人員是顯而易見的。根據本領域已知的方法例如位點定向謙變或丙氨酸掃描誘變(見例如Cunningham和Wells,1989，5W朋ce244:1081-1085)可以鑑定出對於本發明核苷酸序列所編碼多肽的活性所必需的、因此優選不進行修飾(例如替代)的#^酸殘基。在後一種技術中，在分子中每一個帶正電荷的殘基處導入突變，並且測定所基。通過使用諸如核磁共振分析、晶體學或光親和標記法(見例如deVos等，1992，S"e/ice255:306-312;Smith等，1992，/做iifl/o/Mo/eci//"!"醜&to^;224:899隱卯4;Wlodaver等，1992，i^AS丄e故ra309:59-64)的技術所確定的三維結構分析也能夠確定底物-酶相互作用的位點.此外，通過導入核苷酸替換可以修飾編碼本發明多肽的核苷酸序列，其中核苷酸替換不產生由核苷酸序列所編碼的多肽的另一種M酸序列但是符合打算產生酶的宿主生物的密碼子選擇。通過使用本領域已知的任意方法的位點定向誘變可以實現將突變引入核苷酸序列中以便將一個核苷酸替換為另一個核苷酸.特別有用的是這樣一種方法，其利用具有目的插入片段的超螺旋、雙鏈DNA栽體和包含所期望突變的兩個合成引物，在溫度循環期間通過戶/"DNA聚合S^f吏寡核苷酸引物延伸，其中每條寡核苷酸引物與栽體的相反鏈互補.一旦引物摻入，則產生了包含交錯缺刻的突變質粒。溫度循環之後，使用對甲基化和半甲基化DNA特異的D/ml處理產物以消化親本DNA模板並選擇出包含突變的合成DNA。還可以使用本領域已知的其它方法。對於核苷酸替換的概述見例如Ford等，1991，jEx/ii*eswVm屍w17yjcflfto"2:95-107。核酸構建體本發明還涉及包含本發明核苷酸序列的核酸構建體，其中所述核苷酸與能夠指導編碼序列在與控制序列相容條件下在適宜宿主細胞中表達的一種或多種控制序列有效連接。為了使多g達，可以以多種方式操作編碼本發明多肽的核苷酸序列。在插入栽體之前對多核苷酸進行操作可能是期望的或必需的，這取決於表達載體。利用重組DNA方法修飾核苷酸序列的技術是本領域眾所周知的。控制序列可以是適當啟動子序列，即在核苷酸序列表達時可被宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列包含介導多M達的轉錄控制序列。啟動子可以是在所選擇宿主細胞中表現轉錄活性的任何核苷酸序列，其包括突變體啟動子、截斷啟動子和雜合啟動子，並且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的細胞外多肽或細胞內多肽的基因獲得.用於指導本發明核酸構建體轉錄，尤其是在細菌宿主細胞中轉錄的適宜啟動子的例子;1從大腸桿菌lac操i^基因、天藍色鏈黴菌CS^/^挑j;c^coe/iV^/w)瓊脂糖酶基因(&gJ)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sflc醜)、地衣芽孢桿菌(5ad//ws/i'cAewyiw7if&)a-澱粉酶基因(AWfj^)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(5""7/附對^^狄6/70/^//《)麥芽糖澱粉酶基因("挑，|;3^)、解澱粉芽孢桿菌(5ac說iisam，y/o^ne/"dews)a-澱粉酶基因(awyg)、地衣芽孢桿菌青黴素酶基因(p朋JP)、枯草芽孢桿菌w"和基因和原核的j8-內醯胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，iVia^wifl/爿cfldeiMy5We"ces75:3727-3731)獲得的啟動子以及toc啟動子(DeBoer等，1983，iVwe^/fVigs幼eiV"ftVwa/y4cflrfe附yo/5We"cesf75！/480:21-25)。另夕卜的啟動子描述於"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"(5"dewftycj挑wicflw，1980，242:74-94)和Sambrook等，1989，見上。用於指導本發明核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的適宜啟動子的例子是從米麴黴04s/iwgi7/"swj加e)TAKA澱粉酶基因、米黑根毛黴(及A&o附mc(^mi'e/^/)天冬氨酸蛋白酶基因、黑麴黴04spei^7/wsw(gef)中性a-澱粉酶基因、黑麴黴酸穩定性a^澱粉酶基因、黑麴黴或泡盛麴黴(厶/^g欲iwflHWfW/)葡糖澱粉酶(^/flJ)基因、米黑根毛黴脂肪酶基因、米麴黴鹼性蛋白酶基因、米麴黴丙糖磷酸異構酶基因、構巢麴黴04s/wg,7/"swW"/fl附)乙醯胺酶基因和尖鐮孢(F附fl/7'w附狄p/wniw)胰蛋白酶樣蛋白酶基因獲得的啟動子(WO96/00787)以及NA2-tpi啟動子(來自黑麴黴中性a-澱粉酶基因和米麴黴丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)以及其突變啟動子、截斷啟動子和雜合啟動子。在酵母宿主中有用的啟動子是從釀酒酵母(5Vicc/iflw考cescefevfe^)烯醇化酶(ENO-l)基因、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)基因、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因獲得的啟動子。用於酵母宿主細胞的其它啟動子描述於Romanos等，1992,1VflW8:423-488。控制序列還可以是適宜轉錄終止序列，即宿主細胞識別以終止轉錄的序列.終止序列與編碼多肽的核苷酸序列的3，末端有效連接。在所選擇宿主細胞中具有功能的任何終止子可用於本發明。用於絲狀真菌宿主細胞的優選終止子是從米麴黴TAKA澱粉酶基因、黑麴黴葡糖澱粉酶基因、構巢麴黴鄰M苯甲酸合酶基因、黑麴黴仏葡糖苷酶基因和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因獲得的終止子。用於酵母宿主細胞的優選終止子是從釀酒酵母烯醇化酶基因、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)基因和釀酒酵母甘油搭-3-磷酸脫氫酶基因獲得的終止子。用於酵母宿主細胞的其它終止子描述於Romanos等，1992，見上。控制序列還可以是適宜前導序列，即對宿主細胞翻譯而言重要的mRNA非翻譯區域。前導序列有效連接於編碼多肽的核苷酸序列的5，末端。在所選擇宿主細胞中具有功能的任何前導序列可用於本發明。用於絲狀真菌宿主細胞的優選前導序列是從米麴黴TAKA澱粉酶基因和構巢麴黴丙糖磷酸異構酶基因獲得的。用於酵母宿主細胞的適宜前導序列是從釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)基因、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、釀酒酵母a-因子基因和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油搭-3-磷自氫酶(ADH2/GAP)基因獲得的。控制序列還可以是多聚腺苷酸化序列，即有效連接於核苷酸序列3，末端並且在轉錄時被宿主細胞識別作為向所轉錄mRNA添加多聚腺苷酸殘基的信號的序列。在所選擇宿主細胞中具有功能的任何多聚腺苷酸化序列可用於本發明。用於絲狀真菌宿主細胞的優選多聚腺苷酸化序列是從米麴黴TAKA澱粉酶基因、黑麴黴葡糖澱粉酶基因、構巢麴黴鄰^J^苯甲酸合酶基因、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因和黑麴黴a-葡糖苷酶基因獲得的。Guo和Sherman，1995，CW/w/"r5"/o^v15:5983-5990描述了對於酵母宿主細胞有用的多聚腺苷酸化序列。控制序列還可以另_信號肽編碼區，其中所述信號肽編碼區編碼連接於多肽氨基末端的M酸序列並且指導所編碼多肽l細胞的分泌途徑。核苷^列的編碼序列5，端可內在地包含與編碼分泌性多肽的編碼區片段以翻譯閱讀框天然連接的信號肽編碼區。備選地，編碼序列的5，端可包含對編碼序列而言為外來的信號肽編碼區。當編碼序列在天然情況下不包^號肽編碼區時，可能需要外來的信號肽編碼區。備選地，可以將外來的信號肽編碼區簡單地替換天然的信號肽編碼區以〗更增強多肽的分泌。然而，能夠指導所表達多肽進入所選擇宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區可用於本發明。用於細菌宿主細胞的有效信號肽編碼區是從芽孢桿菌NCIB11837麥芽糖澱粉基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-澱粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌3-內醯胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(";wT、"/mS、w/wM)和枯草芽孢桿菌/wx4基因獲得的信號肽編碼序列。另一些信號肽描述於Simonen和Palva，1993,Miav6f》/tfg&a/及ev/env57:109-137。用於絲狀真菌宿主細胞的有效的信號肽編碼區是從米麴黴TAKA澱粉酶基因、黑麴黴中性澱粉酶基因、黑麴黴葡糖澱粉酶基因、米黑根毛黴天冬氨酸蛋白酶基因、孤獨腐質黴(^/附/coto!Vi卯/e附)纖維素酶基因和柔毛腐質黴(及"附/C0/fl/朋"gi'"owi)月旨肪酶基因獲得的。用於酵母宿主細的信號肽編碼區是從釀酒酵母ce因子基因和釀酒酵母轉化酶基因獲得的。其它有用信號肽編碼區描述於Romanos等，1992，見上。控制序列還可以是編碼位於多肽M端的M酸序列的前肽編碼區。得到的多肽稱為酶原(proenzyme)或多肽原(或在一些情況下稱為酶原(zymogen))。多肽原通常為非活性的並且可通過將前肽從多肽原中催化性切下或自催化性切下而轉換為成熟的活性多肽。前肽編碼區可從枯草芽孢桿菌鹼性蛋白酶(印fE)基因、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(/i/w7)基因、釀酒酵母a-因子基因、米黑根毛黴天冬氨酸蛋白酶基因和3^ce/,;pA幼wflAei7if^W/fl漆酶基因(WO95/33836)獲得。當信號肽和前肽區均出現於多肽的^J^末端時，則前肽區位於多肽氨基端而信號肽區位於前肽區的氨基端。添加使多JK^J^f目對於宿主細胞生長而受到調節的調節序列也是適當存在)做出反應從而引^因表達開啟或關閉的系統。原核系統中的調節系統包括/flc、toc和吵操M因系統.在酵母中可使用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，TAKAa澱粉酶啟動子、黑麴黴葡糖澱粉酶啟動子和米麴黴葡糖澱粉酶啟動子可用作調節序列.調節序列的其它實例是那些允許基因擴增的調節序列。在真核系統中，這些調節序列包括能夠在氨甲蝶呤存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因和在重金屬存在下擴增的金屬硫蛋白基因，在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列與調節序列有效連接。表達載體本發明還涉及包含本發明核酸構建體的重組表達載體。上面所述的各種核苷酸和控制序列可以連接在一起以產生重組表達栽體，該重ia^達載體可以包含一個或多個適宜的限制性酶切位點以允許編碼多肽的核苷^f列在此位點處插入或替換。備選地，通過將包含該序列的核苷酸序列或核酸構建體插入用於表達的適當載體中可以表達本發明的核苷酸序列。在構建表達載體時，編碼序列位於載體內從而使編碼序列與用於表達的適當控制序列有效連接。重組表達載體可以是能夠方便進行重組dna步驟並且能夠引起核苷酸序列表達的任意栽體(例如質粒或病毒)。對載體的選擇一般取決於載體與載體將要導入的宿主細胞的相容性。載體可以是線性的或閉合環狀的質粒。載體可以是自主複製型栽體，即載體作為染色體外的實體而存在，它的複製獨立於染色體的複製，例如質粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。栽體可以以任意方式保證自我複製。備選地，當導入宿主細胞時載體可以整^^入基因組並與其已經整合入的染色體一起複製。而且，可以使用單一栽體或質粒或者兩個或多個載體或質粒(共同包含待導入宿主細胞基因組的總dna)或者轉座子。本發明載體優選包含允許對轉化細胞進行容易篩選的一個或多個選擇標記。選擇標記是其基因產物可提供對殺生物劑或病毒抗性、對重金屬抗性、針對營養缺陷型的原養型等等的基因。細菌選擇標記的例子是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的rffl/基因，或者賦予抗生素抗性如氨節青黴素、卡那黴素、氯黴素或四環素抗性的標記。用於酵母宿主細胞的適當標記為ADE2、fflS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用於絲狀真菌宿主細胞的選擇標記包括但不限於fl/iK^(乙醯胺酶)、flrg5(鳥氨酸氨甲醯轉移酶)、6flr(膦絲菌素乙醯轉移酶)、A膽5(潮黴素磷酸轉移酶)、/MViZ)(辨酸還原酶)、/^K(乳清酸核苷-5，4^羧酶)、sC(硫酸腺苷醯轉移酶)、吵c(鄰絲苯甲酸合酶)，以及其等效物。優選地用於麴黴屬(Js/w^7/"s)細胞的標記是構巢麴黴或米麴黴的a挑fltS和/yr(基因以及吸7jc鏈黴菌(5&印to挑y"s/y絮r仍co/i/c附)的6flr基因。本發明栽體優選地包含允許栽體穩定整合入宿主細胞基因組或者載體在細胞內獨立於基因組之外自主複製的元件。對於整合入宿主細胞基因組，載體依賴於編碼多肽的核苷酸序列或者用於通過同源或非同源重組將載體穩定整合入基因組的載體的任意其它元件。備選地，載體可以包含用於指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組的附加核苷酸序列。附加核苷酸序列能夠使栽體在染色體內的精確位置整合入宿主細胞基因組。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件將優選地包含足夠數量的核苷酸，例如100-1,500個^^對、優選400-1,500個4^對並且最優選800-1,500個>^對，其與相應把序列高度同源以增加同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的乾序列同源的任意序列。此外，整合元件可以是非編碼核苷酸序列或編碼核苷酸序列。另一方面，栽體可以通過非同源重組整合入宿主細胞基因組。對於自主複製，栽體可以進一步包含使栽體在所述宿主細胞中自主複製的複製起點。細菌複製起點的例子是允許在大腸桿菌中複製的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的複製起點和允許在芽孢桿菌中複製的pUB110、pE194、pTA1060和pAMIJl的複製起點。用於酵母宿主細胞的複製起點的例子是2micron複製起點、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合以及ARS4和CEN6的組合，複製起點可以具有突變，該突變使其在宿主細胞中以溫度敏感方式起作用(見例如Ehrlich，1978，/Vwee必wgsd/說eiVaftV)"a"airfe附yo/iSWewces75:1433)。可以將一個以上拷貝的本發明核苷酸序列插入到宿主細胞中以增加基因產物的生產。核苷^列拷貝數的增加可以通過將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組獲得或者通過包含與核苷酸序列在一起的可擴增選擇標記基因獲得，在第二種情況下通it^適當選擇劑存在下培養細胞雜細胞。用於連接上述元件以構建本發明重組表達載體的方法對於本領域技術人員是眾所周知的(見例如Sambrook等，1989，見上)。宿主細胞本發明還涉及包含本發明核酸構建體的重組宿主細胞，其方便地用於多肽的重組生產。如先前所描述，將包含本發明核苷酸序列的載體導入宿持。宿主細胞可以是單細胞微生物例如原核生物，或者是非單細胞微生物例如真核生物。有用的單細胞是細菌細胞例如革蘭氏陽性細菌(包括但不限於芽孢桿菌屬(5fld//"s)細胞，例如嗜鹼芽孢桿菌(J5fld//Msa/^/<i/^//"s)、解澱粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌CBa"7/MS6rev,'s)、環狀芽孢桿菌(5""7/|dmi/aws)、克勞氏芽^&^f菌(^ic飾sdaus")、凝結芽孢桿菌(5鎖7Zmscoflgw/fl"s)、醜a"7/"s/a"加s、遲緩芽孢桿菌(醜aa7/附/e"似s)、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(5flCl7Z"S/W"fltefl'MW)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇雲金芽孢桿菌(5flci7/ws^im'wgf*e"'s);或者鏈黴菌屬(S"印似附j;cm)細胞例如變鉛青鏈黴菌cs，fir印towy;ces/iV!v/"ws)或鼠灰鏈黴菌(5yrep似n^cmw"r/"iw))或者革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌和假單胞菌(i^"rf(Wi卵flwsp)。在一個優選的實施方案中，細菌宿主細胞是i^芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在另一個優選的實施方案中，桿菌細胞是嗜鹼性芽孢桿菌。通過例如原生質體轉化(見例如Chang和Cohen,1979，MtfZ"M/w(^"^yi/G^"幼cs168:111-115)、4吏用感受態細胞(見例如Young和Spizizin，1961，/oMi7ia/5fl"e^/ogv81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，/卯wfl/o/Mo/"M/w及Vto^56:209-221)、電穿孑L(見例如Shigekawa和Dower，1988，5,》tecAf々《es6:742-751)或者#^作用(見例如Koehler和Thorne，1987，/(ww7ifl"/5flrfm'o/o^v169:5771-5278)可以實現載體向細菌宿主細胞的導入，宿主細胞可以是真核生物例如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在優選的實施方案中，宿主細胞是真菌細胞。如文中所使用"真菌"包括子嚢菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等在j/wsmw狄朋</5/勿，sD/cftV"flijFmw'，第8版，1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如在Hawksworth等，1995，同上，第171頁中所引用)和全部有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，同上)。在更加優選的實施方案中，真菌宿主細胞是酵母細胞。如此處所使用的"酵母"包括產子嚢酵母(內孢黴目(Endomycetales))、產擔孢子目酵母(basidiosporogenous)和屬於半知菌類的酵母(芽酵母屬(Blastomycetes)).由於酵母的分類將來可能發生變化，為了本發明的目的，酵母應當如5iV/ogyJcft'v旭esd/ye"s《(Skinner，F.A.,Passmore，S.M.和Davenport,R.R.，編者，5^c.醜acten》ASen'esNo.9，1980)所描述進行定義。在甚至更加優選的實施方案中，酵母宿主細胞是假絲酵母屬(Cflfi必rfa)、漢遜酵母屬(^mse"w/")、克魯維酵母屬(JS7ionwwi^"s)、畢赤酵母屬(P,V^Vi)、酵母屬(5ViccA"/w/yY鄉)、裂殖酵母屬(iScAi'zasflcc/uwwi^ces)或亞羅酵母屬(；Fii/7wv/fl)細胞。在最優選的實施方案中，酵母宿主細胞是卡爾酵母(Sfla^fliwiy;cesaw7s^ge附i's)、酉良酒酵母、糖化酵母(iSacc/rfliwiij^sWas她'cws)、5Vicc/w/Ywi^cesrfowg/flsi7、克魯弗酵母(5Vicc/rfliwiy;cesA:/w"m')、諾地酵母(5ViccAfl/wiy;ceswo由wsis)或5"flcc/iflr細j;cesov(/iw附ij細胞。在另一個最優選的實施方案中，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(iS7"jw/ww，yces/ac治)細胞。在另一個最選的實施方案中，酵母宿主細胞是解脂耶氏酵母(PiamM7'a/—)細胞。在另一個優選的實施方案中，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。"絲狀真菌"包括真菌門(Eumycota)和卵菌門(Oomycota)亞門的所有絲狀真菌(如Hawksworth等，1995，見上，所定義)。絲狀真菌的特徵為具有由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它複雜多糖構成的菌絲壁。營養生長通過菌絲延長進行並且碳代謝是專性需氧。與此不同，酵母例如釀酒酵母的營養生長是通過單細胞菌體的出芽進行並且碳代謝可以狄酵。在甚至更加優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是如頂孢黴屬(Jcre挑wi/"附)、麴黴屬(』s/ierg///iis)、鐮孢黴屬(F"ww/w挑)、腐質黴屬(好"加/c0/fl)、毛黴屬(Mmcw)、毀絲黴屬(Mj;ce/&/^^Wfl)、脈孢菌屬(A^iiiw/wa)、青黴屬(屍e"iW股Mw)、梭孢殼屬(rWe/aviVi)、彎頸黴屬(ro/，octo必"附)或木黴屬(7WcAtwfer挑tf)各種的細胞，但不限於此。在最優選實施方案中，所述的絲狀真菌宿主細胞是泡盛麴黴、臭麴黴(^4s/^g///"s/i^iV/"s)、日本麴黴、構巢麴黴、黑麴黴、米麴黴細胞。在另一個最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是軒抱狀嫌抱(jpMSflri'W/M)、FMSflr/m挑CgfCfl/l'S、屍ns"r/"附crooAwc//we、大刀嫌抱(屍wsflr/w/ncm/挑wm附)、禾本^t^抱(F"scw7'"加gfa附fVicflrM附)、禾赤錄抱(屍wsan'M附grawiVi挑)、異抱嫌抱(^F"sfln'w挑/te拈/YM/Wf"挑)、合歡木鐮孢(Fmswi7i挑wegw/i必)、尖鐮孢、多衝支鐮孢(i^wsflnVi戰i*gft'cw/afti/)、粉紅嫌抱(屍"sar/w附rosewiif)、接骨木嫌抱(i^iisan'ii附sa附6fidwMiM)、狹色嫌抱(JP"sa"'m附s<HToc&r<wiw)、者以分枝孢鐮孢(屍"sfl"/"挑s/ww加'cA/dVfes)、石克色鐮孢菌(/Ymw/w挑幼(p/iwr^/附)、JFwsfln'M附tofiifosw附、i^san'Miii,ri'c/i<^/tcc/o/flfes或,wsflr/wwfvcwe/fa^/附細胞。在甚至最優選的實施方案中，所述的絲狀真菌母細胞是ve"e/ifl似附(Nirenbergsp.nov.)細胞，在另一個最優選的實施方案中，所述的絲狀真菌宿主細胞是孤獨腐質黴、柔毛腐質黴、米黑毛黴(^Z^"cw附,'e/^)、iW^ce/^/i緣w"/tmMflp緒fl、粗較脈孢菌(iVeMms/iwflcmssfl)、產紫青審(/wir/;wng6/iM附)、T7j/CflviVite/Tgsfr&、哈茨木審(7>/cA/c/wfe/7MaA;o"/wg//)、長柄木黴(TWc/wz/mnfl/tfwg幼iYicAtoi挑)、李氏木黴(JWc/w(itei7fifl)或綠色木黴(7WcAofifer鵬v'Wflfe)細胞。真菌細胞可通過包括原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁再生的方法以本身已知的方式轉化。適用於轉化麴黴屬宿主細胞的方法描述於EP238023和Yelton等，1984，^ftwe^Z/"gs幼eiViarf卵fl/y4cflrf棚yiSWe""sfAS^81:1470-1474。適用於轉化鐮孢黴屬各種的方法描述於Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787。對酵母的轉化可使用Becker和Guarente(在Abelson，J.N.和Simon,M.I.,編者，GuiV/etoPiwirfG^weftcs"m/Mo/ecw/ar醜fWiigy，五""鵬o/o狄，第194巻，第182-187頁，AcademicPress,Inc.,NewYork中)；Ito等，1983，J做r/m/</醜《"抓'。/柳153:163以及Hinnen等，1978，幼eA^ftVwifl/^4cflrfe考/5We"ces1/5^475:1920中描述的方法進行。生產方法
技術領域：
：本發明還涉及用於產生本發明多肽的方法，其包括(a)在有利於多肽產生的條件下培養宿主細胞；和(b)回收多肽。在本發明的生產方法中，使用本領域已知的方法將細胞培養於適宜多肽產生的營M養基中。例如，可以通過在實驗室或工業發酵罐內於適宜培養基中並站允許多錄達和/或分離的糾下進行搖瓶培養、小雄或大，發酵(包括連續發酵、分批發酵、補料分批發酵或固態發酵)培養細胞。使用本領域已知的方法在包含碳和氮源和無機鹽的適宜營^^養基中進行培養。適宜培養基可從商品供應商獲得或者按照已公布的組成製備(例如在美國典型培養物保藏中心的產品目錄中公布的組成)，如果多肽分泌入營M養基，則可以直接從培養基回收多肽。如果多肽不分泌，則可以從細胞裂解物回收多肽.使用本領域已知的對多肽特異的方法檢測多肽。這些檢測方法包括特異性抗體的使用、酶產物的形成或者酶底物的消失。例如，如文中所描述酶測定法可以用於測定多肽活性。通過本領域已知的方法可以回收所得到的多肽。例如，通過包括但不限於離心、過濾、抽提、噴霧乾燥、蒸發或沉澱的常規方法可以從營M養基中回收多肽。可以通過本領域已知的各種方法純化本發明多肽，所述方法包括但不限於層析法(例如離子交換層析、親和層析、疏7]C層析、色《普聚焦層析和大小排阻層析)、電泳方法(例如製備型等電聚焦電泳)、差異溶解度(例如石危酸銨沉澱)、SDS-PAGE或抽提(見例如iVote/"屍Mf訴c她Vm，J.國C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發明還涉及轉基因植物、植物部分或植物細胞，它們已經用編碼具有本發明抗微生物活性的多肽的核苷酸序列進行轉化以便以可回收量表達並產生多肽。可以從植物或植物部分回收多肽。備選地，包含重組多肽的植物或植物部分可以用於提高食品或飼料的質量(例如提高營養價值、適口性和流變學特性)或者為了破壞抗營養因子。回收的多肽、植物或植物部分還可以用於改善或改變動物和家畜中的消化菌群。轉基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例為草例如牧草(藍草，禾本科)、飼料草如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)、溫帶草如Agrostis和穀類如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高梁和玉蜀黍(玉米)。雙子葉植物的實例為菸草、馬鈴薯、甜菜、豆類如羽扇豆、豌豆、扁豆和大豆、十字花fl"植物(十字花科(5m柳Vtfc^^))如花椰菜、油菜，以及關係密切的模式生物擬南芥菜(^"fl6/rf印si's汰fl&Vwia)。植物部分的實例為莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子和塊莖。特殊植物組織如葉綠體、質外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體和細胞質也認為是植物部分。此夕卜，任何植物細胞無論組織來源如何也認為是植物部分。此類植物、植物部分和植物細胞的後代也包括於本發明範圍之內。按照本領域已知的方法可以構建表達本發明多肽的轉基因植物或植物細胞。簡言之，通過將編碼本發明多肽的一個或多個表達構建體整合入植植物細胞而構建植物或植物細胞。方便地，表ii^J建體是包含編碼本發明多肽的核苷酸序列的核酸構建的適當調控序列有效i接。此外，表i^建體包含用於鑑定表i^I建體已經整合入其中的宿主細胞的選擇標記和將構建體導入所述植物所必需的DNA序列(後者取決於所使用的DNA導入方法).對調控序列如啟動子和終止子序列以及任選地信號或轉運序列的選擇要基於例如期望多肽在何時、何處和如何表達來確定。例如，編碼本發明多肽的基因的表達可以是組成型的或可誘導的，或者可以;UL育、時期或組織特異性的，並且基因產物可以靶向於特異組織或植物部分如種子或葉。調控序列描述於例如Tague等，1988，戶to"/屍—86:506。對於組成型表達，可以使用35S-CaMV啟動子(Franck等，1980，CW/21:285-294)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯存庫組織如種子、馬鈴薯塊莖和果實(Edwards和Coruzzi，1990，j/m.及w.(ewd24:275-303)或來自代謝庫組織如分生組織(Ito等，1994，P/朋rMo/.歷W24:863-878)的啟動子，種子特異性啟動子如來自水稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白啟動子(Wu等，1998，屍/朋ffl"rfCW//^ysto/05J39:885-889)、來自蠶豆(Wdfl/fl6")豆球蛋白B4和未知種子蛋白質基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，/做i7w/o/i)/flw《i^);w'o/ogy152:708-711)、來自種子油體蛋白質的啟動子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935-941)、來自歐洲油菜(5rassi'cami/H)的貯存蛋白質impA啟動子或者本領域巳知的任意其它種子特異性啟動子例如WO91/14772中描述的啟動子。此外，啟動子可以是葉特異性啟動子例如來自水稻和番茄的^cs啟動子(Kyozuka等，1993，iVa"fJPAysiV/tfgy102:991-1000)、小球藻病毒腺噪呤甲基轉移酶基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，iV"WMo/ecw/flr歷o/^y26:85-93)或來自水稻的fl/rf屍基因啟動子(Kagaya等，1995，Af</"w/fl#"<71幼"248:668-674)，或者創傷誘導啟動子如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，外flWMo/ecM/flr5油gy22-573-588)。啟動子增強子元件也可以用於實現酶在植物中較高表達。例如，啟動子增強子元件可以是位於啟動子和編碼本發明多肽的核苷酸序列之間的內含子。例如，Xu等(1993，同上)公開了水稻肌動蛋白l基因的第一個內含子用於增強表達的用途。選擇標記基因和表達構建體的任意其它部分可以從本領域可利用的那些進行選擇。按照本領域已知的常規技術將核酸構建體整合入植物基因組，所述技術包括土壤桿菌Ugn^fl"m'"加)介導的轉化、病毒介導的轉化、顯微注射、粒子轟擊、生物射彈轉化和電穿孔(Gasser等，19卯，5We""244:1293;Potrykus，1990，5iV/rec/t/ioto^8:535;Shimamoto等,1989，iVfl似fe338:274)。目前，根癌土壤桿菌(^giY^cten'Mwf"附e/flde附)介導的基因轉移是選擇用於產生轉基因雙子葉植物的方法(對於綜述見Hooykas和Schilperoort,1992，戶/aWMo/eai/flr19:15-38)。然而該方法也能夠用於轉化單子葉植物，儘管其它轉化方法對於這些植物通常是優選的。目前，選擇用於產生轉基因單子葉植物的方法是胚胎愈傷組織或發育胚胎的粒子轟擊(用轉化DNA包被的顯微金或鎢顆粒)(Christou，1992，戶/"W/卯i7ifl/2:275-281jShimamoto，1994，C"wre"f6^!7f/卵歷她cA朋/05[V5:158-162;Vasil等，1992，說VTecA朋/o幻710:667-674)。轉化單子葉植物的備選方法是Omirulleh等(iVfl"/A^/ecii/af歷oto^，1993,21:415-428)所描述的基於原生質體的轉化。在轉化之後，按照本領域眾所周知的方法選擇出其中整合有表達構建體的轉化體並將轉化體再生成為完整植物。本發明還涉及產生本發明多肽的方法，其包括(a)在易於產生多肽的條件下培養包含編碼多肽(具有本發明抗微生物活性)的核苷酸序列的轉基因植物或植物細胞；和(b)回收多肽。組合物在更進一步的方面，本發明涉及包含本發明抗微生物多肽的組合物，例如藥物組合物。組合物可以包含作為主要多肽成分的本發明多肽，例如單一成分組合物。備選地，組合物可以包含多種酶活性，例如氨肽酶、澱粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、p-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、a-葡糖苷酶、p-葡糖苷酶、卣素過氧化物酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽穀氨醯胺酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉穀氨醯胺酶或木聚糖酶。組合物可以進一步包含另一種藥物活性試劑，例如另外的殺生物劑，例如表現為如上所述抗孩i生物活性的另一種抗孩i生物多肽。如本領域已知，殺生物劑可以是抗生素。抗生素種類包括青黴素類例如青黴素G、青黴素V、二甲氧基苯青黴素、苯唑青黴素、羧苄青黴素、乙氧萘青黴素、氨苄青黴素等等；與p-內醯胺酶抑制劑頭孢菌素類相組合的青黴素例如氯頭孢菌素、頭孢唑啉、頭孢呋辛、拉氧頭孢等等；碳青黴烯類；單菌黴素類；氨基糖苷類；四環素類；大環內酯類；林可黴素類；多粘菌素類；磺胺類；喹啉類；氯黴素；甲硝唑；大觀黴素；曱氧節啶；萬古黴素等等。殺生物劑還可以是抗真菌劑，包括多烯類如兩性黴素B、制黴菌素；5-flucosyn;和唑類如咪康峻、酮康唑、依曲康唑和氟康唑。在一個實施方案中，殺生物劑是非酶化學試劑。在另一個實施方案中，殺生物劑是非多肽化學試劑。在殺生物劑的25。/。(w/w)水溶液中；優選地在10。/。(w/w)水溶液中；更加優選地在5。/。(w/w)水溶液中；甚至更加優選地在1。/)(w/w)水溶液中；最優選地在0.5。/。(w/w)水溶液中；並且具體而言在0.P/。(w/w)水溶液中於20'C孵育8小時後(優選地4小時後，更加優選地2小時後，最優選地1小時後，並且具體而言30分鐘後)能夠將大腸桿菌(DSM1576)或枯草芽孢桿菌(ATCC6633)的活細胞數量降低至1/100。當加入1000ppm濃度的殺生物劑時；優選地當加入500ppm濃度的殺生物劑時；更加優選地當加入250卯m濃度的殺生物劑時；甚至更加優選地當加入IOOppm濃度的殺生物劑時；最優選地當加入50ppm濃度的殺生物劑時；並且具體而言當加入25ppm濃度的殺生物劑時，殺生物劑能夠在25'C抑制大腸桿菌(DSM1576)或枯草芽孢桿菌(ATCC6633)的生長達24小時。生物作用。組合物可以包含適當載體物質。組合物還可以包含適宜遞送媒介物，當組合物用作藥物時所述媒介物能夠將本發明的抗微生物多肽遞送至預期位點。組合物可以按照本領域已知的方法製備並且組合物可以是液體或乾燥形式的組合物。例如多肽組合物可以是顆粒或微顆粒形式。按照本領域已知的方法可以使組合物所包含的多肽穩定。下面給出了本發明多肽組合物的優選用途的例子.基於本領域已知的方法可以確定本發明多肽組合物的劑量和使用該組合物時的其它條件。方法和用途本發明還包含本發明抗微生物多肽的多種用途。抗微生物多肽一般用於遭受細菌、真菌、酵母或藻類汙染的任何場所。一般地，場所是水系統例如冷卻水系統、洗衣房漂洗水，油系統例如切削油、潤滑油、油田等等，在這些地方需要殺死微生物或者需要控制微生物生長。然而，本發明還用於已知抗微生物組合物有用的全部應用中，例如木材、乳膠、粘合劑、膠、紙張、硬紙板、織物、皮革、塑料、膩子膠和飼料的保護。其它用途包括食品、飲料、化妝品如洗劑、乳骨、■、軟骨、肥皂、'先t劑、調節劑、止汗劑、除臭劑、漱口劑、隱形眼鏡產品、酶製劑或食品成分的保藏。因此，在例如痤瘡、眼睛或口腔感染、皮膚感染的治療中；在止汗劑或除臭劑中；在浴足鹽中；在對隱形眼鏡、堅硬表面、牙齒(口腔護理)、創傷、挫傷等等的清洗和消毒中，本發明抗微生物多肽可以用作消毒劑。通常，可以預期本發明抗微生物多肽能夠用於任何堅M面的清洗、消毒或抑制微生物生長。可以方便地與本發明抗微生物多^目接觸的表面的實例是在例如牛奶場、化學或藥物加工廠、水衛生系統、油加工廠、紙漿加工廠、水處理廠和冷卻J^使用的加工^:備的表面。本發明抗微生物多肽應以一定量使用，該量可有效地對所i^面進行清洗、消毒或抑制微生物生長。另外，可以預期本發明抗微生物多肽能夠方便地用於就地清洗(C丄P.)系統以便清洗任何種類加工設備。本發明抗微生物多肽還可以用於食品加工廠和任何準備食物或^J良務區域(如醫院、療養院、餐館特別是快餐館、熟食店等等)的表面清洗和烹調器具清洗。本發明抗微生物多肽還可以在食品製品中用作抗孩t生物劑，並且其作為乳酪、水果和蔬菜以及沙拉條食品中的表面抗微生物劑是特別有用的。本發明抗微生物多肽還可以用作水性^H"中的防腐劑或消毒劑。本發明抗微生物多肽還可以用於水系的微生物控制以及用於水的消毒，具體而言用於工業水的消毒。本發明還涉及本發明抗微生物多肽或組合物用作藥物的用途。此外，本發明抗微生物多肽或組合物還可以用於製造控制或防止微生物(如真菌生物或細菌，優選革蘭氏陽性細菌)的藥物。或預防劑。因此，本發明組合物和抗微生物多肽可以用於製備治療微生物感染(如細菌或真菌感染，優選革蘭氏陽性細菌感染)的獸用或人用治療劑或預防劑。具體而言，微生物感染與肺病(包括但不限於結核病、肺炎和嚢性纖維化)和性傳播疾病(包括但不限於淋病和衣原體)相關。本發明組合物包含有效量的本發明抗微生物多肽。當文中使用時，術語"有效量"旨在指足以抑制所述微生物生長的本發明微生物多肽的量。本發明還涉及創傷癒合組合物或產品如繃帶、醫療用具如導管，並且進一步涉及抗皮屑頭髮產品如洗髮劑。本發明抗微生物多肽的製劑可施用於患有或者易患微生物感染的宿主。施用可以是局部的、局限的或全身的，這取決於特定微生物，優i^限施用。通常，本發明抗微生物多肽劑量足以使微生物菌群減少至少大約50%,通常減少至少1個殺死對數級(logofkilling)並且可以降低2個或更多個殺死對數級。可以以降低微生物種群同時使任何副作用最小化的劑量施用本發明化合物。可以預期，對於體內使用可以在醫師指導下獲得並使用組合物。本發明抗微生物多肽特別地用於殺死革蘭氏陰性細菌包括銅綠假單孢菌(i^M&卿"flwflm^'"仍fl)和砂目艮衣原體(CMfl考必"^flC^/Mfl泡)和革蘭氏陽性細菌包括各種葡萄球菌和鏈球菌。本發明抗微生物多肽對於殺死微生物的體外製劑也是有用的，特別是當人們不希望引入大量常規抗生素時。例如，本發明抗微生物多肽可以加入動物和/或人類食物製劑中；或者它們作為添加劑用於細胞體外培養以便防止微生物在組織培養中過度生長。如實驗部分所詳細描述，通過體外測試可以確定特定微生物對本發明抗微生物多肽致死的敏感性。一般地，將各種濃度抗微生物多肽與微生物一起培養一段時間使蛋白質充^作用，通常在大約i小時和i天之間。然後計數活的微生物並確定殺傷水平。目的微生物包括但不限於革蘭氏陰性細菌例如檸檬酸細菌(C7加6flcter);腸桿菌(JE""te^flctei");埃希氏菌(EscAm'cA/"印.)，例如大腸桿菌；克雷伯氏菌(JSr/Wsi'e/tos/;.);摩根氏菌(^/^^"恥//"sp.);變形菌(iVote"sw.);普羅威登斯菌(PfoviVfewaVis/7.);沙門氏菌(Sa/wMwe/Zas/i.)例如傷寒沙門氏菌(51.印/i似)，鼠傷寒沙門氏菌(51.《v/^/挑nn'M附)；沙雷氏菌(torarifls/7.);志賀氏菌;假單胞菌(戶se油卿/uis)例如銅綠假單孢菌；耶爾森氏菌(yera,Vi/fl，)例如鼠疫耶爾森氏菌(K;e幼's),假結核耶爾森氏菌(K/wewrf^"6efcn/仍,'s)，小腸結腸炎耶爾森氏菌(Kewtewo/故cfl);弗朗西絲氏菌(F/wids"//");巴斯德氏菌(戶"s似re/tow.);弧菌(K幼/7'"s/;.)例如霍亂弧菌(K.c/w/^Yze)，副溶血弧菌(K.;wwfl/^/iwfyria/s);彎曲桿菌(CVz挑/7j;/Mflctefs/.)例如空腸彎曲菌(C.附')；嗜血菌(好^10>/^^印.)例如流感嗜血菌(醜i'"y"g"^j^),4土氏嗜血菌i/mci*^";博德特氏菌(5<mfete//fls/i.)例如百日咳博德特氏菌(及/7eWs's)，支氣管炎博德特氏菌(及AiwicA&印ft'cfl)，副百日咳博德特氏菌(5./wwfl/erti/ssfe);布魯氏菌(醜/7/"/tosp.)，奈瑟氏球菌(iV"'swWfl印.)例如淋病奈瑟氏球菌(iV.go"wrAoeflg)，腦膜炎奈瑟氏球菌(A^we"/"g&iVft's)等等。其它目的細菌包括軍團菌(Leg!Vwe//fls/O例如嗜肺軍團菌"./meM挑fl;p似/fl);利斯特氏菌("s^7'"s/1.)例如單核細胞增生利斯特氏菌(丄.);枝y^、體(Afyco;p/as附fl)爾J如人型^L^體(A/.AomiVi/s)，肺炎枝>^、體(Af,);分枝桿菌(Mj;a^flcteW"挑印.)例如鳥結核分枝桿菌(M-似6eirw/osi's)，麻瘋分枝軒菌(Af./e/wYie);密^f、旋體(7Ve/wwe挑fls/;.)例如蒼白密螺旋體(7:/wi肌rf"挑)；包柔螺旋體(Ao/reWfl)例如伯氏包柔螺旋體(及6wg^r/ei7');鉤端螺旋體(丄印tos/w'raesp.);立克次氏體(及i'c紐toiViw.)例如立氏立克次氏體(及.Wc&加//)，斑滲傷寒立克次氏體(及.W/^');衣原體(CA/a附^/fl取)例如砂眼衣原體，肺炎衣原體(C.pweu卿/f)，鷚鷸熱衣原體(C/w/加ci');螺桿菌(份/i'c幽c^印.)例如幽門螺桿菌(E/y;/oW)等等。非細菌性的目的病原體包括真菌和原生動物病原體，例如痗原蟲(/Vflwwo必asp.)侈!]如惡'ti痴原蟲(P./ii/ci^flffMw)，錐蟲(7Yj/ww仍tf附as/.)例如布氏錐蟲(r.6r"c");shistosomes;阿米巴(J"toe附oe6a印.)，隱球酵母(Cij/^coccwss/i.)，假絲酵母(OwirfWfl)例如白假絲酵母(C.a幼/caws)等等。可以採用多種方法施用。多肽製劑可以口月良給藥，或者通itik管內、皮下、皿注射給藥、通過氣溶膠、眼(opthalmically)、膀胱內、局部給藥等等。例如通過吸入施用的方法是本領域述眾所周知的。取決於待施用特異性抗微生物多肽、疾病性質、施用頻率、施用方式、試劑從宿主的清除等等，治療製劑的劑量將可以在很大範圍內變動。起始劑量可以較大，1^是較小的維持劑量。劑量可以每周或每兩周不頻繁施用，或者分成較小劑量且每日、每半周施用一次或幾次等等以便維持有效劑量水平。在許多情況下，口服施用比靜脈內施用需要更高劑量。可以修飾醯胺鍵以及氨基和羧基末端以便在口月艮施用時具有更大穩定性。例如，絲末端被醯胺化。製劑本發明化合物能夠摻入到用於治療性施用的各種製劑中。更加具體而言，本發明化合物能夠通過與適當藥用載體或稀釋劑組合按配方配製成藥物組合物，並且可以按配方製成固體、半固體、液體或氣體形式的製劑例如片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、軟骨劑、乳骨劑、泡沫劑、溶液劑、栓劑、注射劑、pilA劑、剿歐劑、劑、洗劑和氣霧劑。照此，化合物的施用能夠以多種方式進行，包括口服、頰部、直腸、胃腸外、腹膜內、真皮內、經皮、氣管內等等施用。本發明抗微生物多M施用後可以全身分布，或者可以通過使用能將活性劑量維持於^位點的a^物或其它製劑使本發明抗微生物多肽在施用後局限分布。在一個實施方案中，局部使用的製劑包含降低二價陽離子(具體而言是釣和鎂)有效濃度的螯合劑.例如可以包括諸如檸檬酸鹽、EGTA或EDTA的試劑，其中優選檸檬酸鹽。檸檬酸鹽濃度通常大約l-10mM。本發明化合物能夠單獨施用、彼此組合施用或者能夠與其它已知化合物(例如穿孔素、抗炎劑、抗生素等等)組合^f吏用。在藥物劑型中，化合物可以以其可藥用鹽的形式施用。以下方法和賦形劑僅作為實例而不是限制本發明。對於口服製劑，化合物能夠單獨使用或者與適當添加劑組合以製成片劑、散劑、顆粒劑或膠嚢劑，例如與常規添加劑如乳糖、甘露醇、玉米澱粉或馬鈴薯澱粉組合；與粘合劑如微晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯樹膠、玉米澱粉或明膠組合；與崩解劑如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉或羧甲基纖維素鈉組合；與潤滑劑如滑石粉或硬脂酸鎂組合；以及如果期望的話還可以與稀釋劑、緩衝劑、潤溼劑、防腐劑和調味劑組合。通過將化合物以及(如果期望)常規添加劑如助溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑和防腐劑在7jc或非水溶劑(如植物油或其它類似油、合成脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸酯或丙二醇)中溶解、懸浮或乳化而配製成用於注射的製劑。化合物可以製成氣霧劑製劑以便通過^A施用。本發明化合物能夠配製成可增壓拋射劑如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等等。化合物可以與常規添加劑如助溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑和防腐劑配製成洗劑以防止例如燒傷感染.而且，可以將化合物與多種基質如乳化基質或水溶性基質相混合製成栓劑。本發明化合物能夠通過栓劑經直腸施用。栓劑包括諸如可可豆脂、碳蠟和聚乙二醇的媒介物，其在體溫下熔化而在室溫下固化。可以提供用於口服或直腸施用的單位劑型如糖漿劑、酏劑和混懸劑，其中每種劑量單位如一茶匙、一大湯匙、片劑或栓劑包含預定量的含有一種或多種本發明化合物的組合物。同樣，用於注射或靜脈施用的單位劑型可以包含本發明化合物(作為無菌水溶液中的組合物)、生理鹽7]C或另一種可藥用載體。用於緩釋製劑的埋植劑是本領域眾所周知的。埋植劑可按配方與生物可降解聚合物或非生物可降解聚合物配製成微球劑、板等等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成宿主可良好耐受的易蝕聚合物。將包含本發明抗微生物多肽的埋植劑放置於感染位點附近，以致於活性成分的局部濃度高於身體其它部位。如文中所使用，術語"單位劑型"指適宜作為用於人或動物受試者的單一劑量的物理不連續單位，每一單位包含預定量的本發明化合物以及可藥用稀釋劑、載體或媒介物，預定量為所計算出的足以產生預期效果的量。本發明單位劑量的規格取決於所使用特定化合物和打算獲得的效果，以及與宿主中的化合物相關的藥效學。可藥用賦形劑如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑^L公眾可以得到的。而且，可藥用輔助物質如pH調節劑和緩衝劑、張力調節劑、穩定劑、潤溼劑等等是公眾可以得到的。全身施用的一般劑量範圍為每次每公斤受試者體重0.1pg-100毫克。一般劑量為每次一個片劑，每日2-6次，或者每次一個按比例增加活性成分含量的定時釋放膠嚢或片劑，每日一次。使用在不同pH值下溶解的膠嚢材料，通過由滲透壓緩慢釋放的膠嚢或者通過任何其它已知的控制釋放方法獲得定時釋放效果。技術人員將容易意識到，劑量水平可以隨特異化合物的功能、症狀的嚴重性和受試者對副作用的易感性而改變。一些特異化合物比其它化合物更有效。本領域技術人員通過多種方法可以容易地確定給定化合物的優選劑量。優選方法是測量給定化合物的生理效能.脂質體用作遞送工具是目的方法之一。脂質體與把位點的細胞融合併將腔內內容物遞iliX細胞內。使用多種保持接觸的方法(如分離、粘合劑等等)，可以將脂質體與細胞保持接觸足夠的時間以便融合。在本發明的一方面，將脂質體設計成氣霧化經肺施用。使用介導膜融合的純化蛋白質或肽如仙臺病毒或流感病毒等等製備脂質體。脂類可以是已知形成脂質體的脂類的任意有用的組合，其中形成脂質體的脂類包括陽離子或兩性離子脂類如磷酯醯膽鹼。剩餘的脂類通常是中性或酸性脂類，如膽固醇、磷脂醯絲氨酸、礴脂醯甘油等等。為了製備月旨質體，可以使用Kato等(/.C7^附.1991，266:3361)所描述的方法。簡言之，將脂類和包含肽的腔內組合物組合於適宜水介質中，方便地為總固體量為重量的大約1-10%的鹽介質。大約5-60秒的短時間劇烈振蕩後，將管置於大約25-40。C的溫水浴中，並且重複該循環大約5-10次。然後將組合物超聲達適宜時間，通常大約1-10秒，並且通過渦旋振蕩進一步攪動。然後加入水介質以擴大體積，通常增加大約1-2倍的體積，隨後搖動並冷卻。該方法允許將高分子量分子摻入腔內。具有其它活性劑的製劑為了用於本發明方法，本發明抗微生物多肽可以與其它藥物活性劑、具體而言為其它抗微生物劑一起進行配製。如本領域已知，其它目的試劑包括廣泛多種的抗生素。抗生素的類別包括青黴素例如青黴素G、青黴素V、二甲氧基苯青黴素、苯唑青黴素、羧爺青黴素、乙氧萘青黴素、氨苄青黴素等等；與^內,酶抑制劑頭孢菌素類組合的青黴素例如氯頭孢菌素、頭孢唑啉、頭孢呋辛、拉氧頭孢等等；碳青黴烯類；單菌黴素類；氨基糖苷類抗生素；四環素類；大環內酯類；林可黴素類；多粘菌素類；磺胺類；會啉類；氯黴素；甲硝唑；大觀黴素；甲氧千啶；萬古黴素等等。抗黴菌劑也是有用的，其包括多烯類如兩性黴素B、制黴菌素；5-flucosyn;和哇類如咪康哇、酮康唑、依曲康唑和氟康唑。抗結核藥包括異煙肼、乙胺丁醇、鏈黴素和利福平。本發明抗微生物多肽製劑也可以包括細胞因子，例如幹擾素Y、腫瘤壞死因子a、白介素12等等。體外合成本發明抗微生物肽可以使用如本領域已知的常規方法體外合成製備。可以獲得多種商業化的合成裝置例如AppliedBiosystemsInc.、Beckman等的自動化合成儀。通過使用合成儀可以將天然存在M酸替換為非天然胺基酸，特別是D-異構體(或D-型)如D-丙氨酸和D-異亮氨酸、非對映異構體、具有不同長度或功能性的側鏈等等，特定序列和製備方式將根據方4更性、經濟狀況、所需純度等等確定。可以向包含適宜功能性的多種肽或蛋白質提供化學交聯以便結合，例如氨基用於形成醯胺或取代醯胺如還原性胺化作用、巰基用於形成石克醚或二硫化物、氛基用於形成醯胺等等。如果期望，在合成或表達過程中可以將多種基團引入肽內，這允許與其它分子或表面連接。因此半胱氨酸能夠用於產生硫醚、組氨酸用於與金屬離子#物連接、氣基用於形成醯胺或酯、氣基用於形成醯胺等等。按照重組合成的常規方法還可以分離並純化多肽。裂解物可以是M達宿主製備的並且可以使用HPLC、大小排阻層析、^電泳、親和層析或其它純化技術純化裂解物。對於絕大部分，相對於產物製備方法及其純化相關的汙染物，所使用的組合物以重量計將包含至少20%的目的產物，更加通常至少大約75%，優選地至少大約95%，並且為了治療目的通常至少大約99.5%。通常，百分比以總蛋白質為基礎。動物飼料本發明還涉及將具有抗微生物活性的多肽用於動物飼料的方法，以及包含本發明抗微生物多肽的飼料組合物和飼料添加劑。術語動物包括全部動物，包括人類。動物的例子為非反芻動物和反芻動物如奶牛、綿羊和馬。在特定實施方案中，動物是非反芻動物。非反芻動物包括單胃動物例如豬或豬類(包括但不限於小豬、生長豬和母豬)；家禽例如火雞和小雞(包括但不限於燒烤雞、母雞)；年幼小牛；和魚(包括但不限於鮭魚)。術語飼料或飼料組合物意思是指適宜或旨在由動物攝入的任何化合物、製劑、混合物或者組合物。在根據本發明的用途中，抗微生物多肽可以在餵食之前、之後或同時投餵於動物。優選同時投喂。在一個特定實施方案中，對加入到飼料中或飼料添加劑中的形式的抗微生物多肽進行了充分限定。充分限定意思是指如通過大小排阻層析所確定抗微生物多肽製劑純度至少為50%(見WO01/58275的實施例12)。在另一個特定實施方案中，如通過該方法所確定抗孩吏生物多肽製劑純度至少為60%、70%、80%、85%、88%、卯％、92%、94%或者至少95%.充分限定的抗微生物多肽製劑是有利的。例如，正確地確定投餵基本上沒有其它抗微生物多肽幹擾或汙染的抗微生物多肽的劑量更加容易。術語正確地確定劑量具體而言是指獲得一致和恆定結果的目標以及基於預期效果優^f匕劑量的能力。然而，對於在動物飼料中的用途，抗微生物多肽不需要那種純度；它可以包含例如其它酶，在這種情況下其可以稱為抗微生物多肽製劑。抗微生物多肽製劑能夠(a)直接加入飼料(或者直接用於植物性蛋白的處理過程中)，或者(b)用於一種或多種中間組合物如隨後加入到飼料中的飼料添加劑或綜合微量添加劑(premix)的生產中(或者用於處理過程中)。上面所描述的純度的程度是指最初抗微生物多肽製劑的純度，而不管是否按照上面(a)或(b)使用。使用重組生產方法尤其可以獲得該數量級純度的抗微生物多肽製劑，然而當抗微生物多肽是通過傳統發酵方法生產時，該數量級純度的抗孩t生物多肽製劑不易得到並且還存在批次間差異。當然此種抗微生物多肽製劑可以與其它酶混合。如文中所使用，術語植物蛋白是指包含至少一種衍生於或來源於植物的蛋白質(包括修飾蛋白質和蛋白質衍生物)的任何化合物、組合物、製劑或混合物。在特定實施方案中，植物蛋白的蛋白質含量為至少10%、20%、30%、40%、50。/。或60。/o(w/w)。植物蛋白可以從植物性蛋白質來源如豆類和穀類得到，例如來自豆科(F"6flce"e(Z^ww/"osae))、十字花科(0""y^iYiceae)、蓁科(C%ewo/w(ftVicie)和禾本科(i^flceae)植物的材料，如大豆粉、羽扇豆粉和油菜籽粉。在特定實施方案中，植物性蛋白質來源是來自一種或多種豆科植物如大豆、羽扇豆、豌豆或扁豆的材料。在另一個特定實施方案中，植物性蛋白質來源是來自一種或多種藜科植物如甜菜、糖甜菜、菠菜或昆諾阿藜的材料。植物性蛋白質來源的其它例子是油菜籽和甘藍。大豆是優選的植物性蛋白質來源。植物性蛋白質來源的其它例子是穀類例如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉蜀黍(玉米)、水稻和高梁。料，或者與其它旨在添加到動物飼料中的其它成分相混合，即以動物飼料添加劑(例如所謂的動物飼料綜合微量添加劑)的形式。在本發明的另一方面涉及用於動物飼料的組合物，例如動物飼料和動物祠料添加劑如綜^^微量添加劑。除了包含本發明抗微生物多肽之外，本發明動物飼料添加劑還包含至少一種脂溶性維生素和/或至少一種水溶性維生素和/或至少一種微量礦物質(tracemineral)和/或至少一種巨量礦物質(macromineral)。此外，任選地，飼料添加成分是著色劑、芳香化合物、穩定劑和/或至少一種選自肌醇六磷酸酶EC3.1.3.8或3.1.3.26;木聚糖酶EC3.2.1.8;半乳聚糖酶EC3.2.1.89和/或j8-葡聚糖酶EC3.2.1.4的其它酶。在一個特定實施方案中，這些其它酶是充分限定的(如上對抗微生物多肽製劑所限定)。其它抗微生物肽(AMP)的例子是CAP18、LeucocinA、Tritrpticin、Protegrin-l、Thanatin、Defensin、Ovispirin如Novispirin(RobertLehrer，2000)或者保留抗微生物活性的其變體或片段。其它抗真菌多肽(AFP)的例子是巨大麴黴(厶/iei^7/附g^mfews)和黑麴黴肽，以及保留抗真菌活性的其變體或片段，如在WO94/01459和PCT/DK02/00289一旦公布則替換成WO編號中所描述。通常脂溶性和水溶性微生素以及微量礦物質形成了旨在添加到飼料中的所謂綜合微量添加劑的部分，而巨量礦物質通常分開加入到飼料中。當組合物中富含本發明抗微生物多肽時，任一種類型的這些組合物是本發明的動物飼料添加劑。在特定實施方案中，在動物飾料或飼料中旨在包含(或規定必須包含)0.01-10.0%、更加具體而言0.05-5.0%或者0.2-1.0%(%意思是每100g飼料中添加劑的克數)水平的本發明動物飼料添加劑。特別是對於綜合孩先量添加劑情況如此。以下是這些組分的非排外性實例清單脂溶性維生素的例子是維生素A、維生素D3、維生素E和維生素K如維生素K3。水溶性維生素的例子是維生素B12、生物素和膽喊、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸和泛酸如D-泛酸鈞。微量礦物質的例子是錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。巨量礦物質是鉀、磷和鈉。這些組分的營養需求(以家禽和小豬/豬為例)列於WO01/58275的表A中。營養需求意思是指這些組分將以所指定濃度提供於斜料中。在另一方面，本發明動物飼料添加劑包含至少一種在WO01/58275表A中所指定的個別組分。至少一種意思是指l種、或2種、或3種、或4種等等直到全部13種、或者直到全部15種個別組分中的任一種、一種或多種。更加明確地說，本發明添加劑中所包含的該至少一種個別組分的量能夠提供在表A第4列、或第5列、或第6列所指定範圍內的飼料內濃度。本發明還涉及動物飼料組合物。動物飼料組合物或飾料具有相對高含量的蛋白質。如在WO01/58275中表B第2-3列所指出，對家禽和豬的飼料進行特徵描述。如在表B第4列所指出，對魚類飾料進行特徵描述。此外，此類魚類飾料通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。根據本發明的動物飼料組合物具有50-800g/kg的粗蛋白質含量，並且此外還包含至少一種如文中所要求權利保護的抗微生物多肽。此外，或者作為(對於上面所指出的粗蛋白質含量的)選擇，本發明動物祠料組合物具有10-30MJ/kg的可代謝能量含量；和/或0.1-200g/kg的鈣含量；和/或0.1-200g/kg的可利用的磷含量；和/或0.1-100g/kg的蛋氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的蛋氨^&a半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的賴氨酸含量。在特定實施方案中，可代謝能量、粗蛋白質、鈣、磷、蛋氨酸、蛋氨酸加半胱氨酸和/或賴氨酸的含量處於WO01/58275表B中第2、3、4或5列(R.2-5)的任意一個的範圍內。粗蛋白質計算為氮(N)乘以係數6.25,即粗蛋白質(g/kg)-N(g/kg)x6.25。通過Kjeldahl方法確定氮含量(A.O.A.C.，1984，OfficialMethodsofAnalysis第14版，AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)。基於NRC出版物豬的營養需求(Nutrientrequirementsinswine)(第9次修訂版，1988，國家研究委員會，農業委員會，動物營M員會，豬營養小組委員會，NationalAcademyPress,Washington,D.C.，第2國6頁)和歐洲家禽飼料能量值表(theEuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs)(Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension,7361DABeekbergen，荷蘭GrafischbedrijfPonsen&looijenbv，Wageningen.ISBN90-71463-12-5)計算可代謝能量。對完全動物飾料中鈣、可利用磷和胺基酸的飾料內含量的計算基於飼料表例如Veevoedertabel1997，gegevensoverchemischesamenstelling，verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen，、CentralVeevoederbureau,Runderweg6，8219pkLelystad.ISBN卯-72839-13國7。在一個特定實施方案中，本發明動物飼料組合物包含至少一種如上所定義的植物性蛋白質或蛋白質來源。在另一個特定實施方案中，本發明動物飼料組合物包含0-80%玉蜀黍；和/或0-80%高梁；和/或0-70%小麥；和/或0-70%大麥；和/或0-30%燕麥；和/或0-40°/。大豆粉；和/或0-10°/。魚粉；和/或0-20%乳清。動物辨料能夠加工成例如搗^fN料(非顆粒)或顆粒飼料，一般地，磨碎的飼料是混合的，並且根據對所述物種的規範添加足夠量的必需維生素和礦物質。酶可以作為固體或液體酶製劑加入。例如固體酶製劑一般在混合步驟之前或混合步驟過程中加入；而液體酶製劑一般在粒化步驟之後加入。酶還可以摻入到飼料添加劑或綜合微量添加劑中。飾料中最終酶濃度在0.01-200mg酶蛋白質/kg伴料的範圍內，例如在5-30mg酶蛋白質/kg動物辨料的範圍內。抗微生物多肽可以以下列量(劑量範圍)的一種或多種施用0.01-200;或0.01-100;或0.05-100;或0.05-50;或0.10-10—全部這些範圍為每千克飼料中的抗微生物多肽蛋白質毫克數(ppm)。為了確定每千克飼料中抗微生物多肽蛋白質的毫克數，從飼料組合物純化抗微生物多肽，並且使用相關測定法(見下面抗孩t生物活性、底物和測定法)確定所純化抗孩i:生物多肽的特異活性。照此^_用相同測定法還可確定飼料組合物的抗微生物活性，並且基於這兩次測定可計算出每千克飼料中抗微生物多肽蛋白質毫克數的劑量。也可使用相同原理確定飼料添加劑中的抗微生物多肽蛋白質的毫克數。當然，如果用於製備飼料添加劑或飼料的抗微生物多肽樣品是可以得到的，則可以從該樣品中測定特異活性(不需要從飼料組合物或添加劑純化抗微生物多肽)。清潔劑組合物本發明的抗微生物多肽可添加至洗滌劑組合物中並且因此成為它們的一種組分，'柔軟劑組合物)，或者配製成用於一般家居;i^表面清潔操作的洗滌劑組合物，或者配製成用於手工用或機器用洗碟操作的洗滌劑組合物。在一個特定方面，本發明提供了包含本發明抗微生物多肽和表面活性劑的洗滌劑添加劑。洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可以包含一種或多種其它酶，如另一種蛋白酶、脂肪酶、角質酶、澱粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如漆酶)和/或過氧化物酶(例如卣素過氧化物酶).通常，所選則酶的特徵應當與所選擇洗滌劑相容(例如最佳pH、與其它酶或非酶成份的相容性等等)，並且酶應當以有效量存在。蛋白酶適宜蛋白酶包括那些動物來源、植物來源或微生物來源的蛋白酶。優選微生物來源的蛋白酶。化學修飾的或蛋白質工程改造的突變體包括在內。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優選鹼性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。鹼性蛋白酶的實例是枯草蛋白酶，尤其是源自芽孢桿菌屬的那些枯草蛋白酶，如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例M蛋白酶(如豬或牛來源)和在WO89/06270和WO94/25583中描述的鐮孢黴屬蛋白酶。有用蛋白酶的實例是在WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中描述的變體，尤其在如下位置存在一個或多個替代的變體第27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274位。脂肪酶適宜脂肪酶包括那些細菌來源或真菌來源的脂肪酶。化學修飾的或蛋白質工程改造的突變體包括在內。有用脂肪酶的實例包括來自腐質黴屬(同義詞嗜熱真菌屬)如在EP258068和EP305216中描述的柔毛腐質黴或者在WO96/13580中描述的孤獨腐質黴的脂肪酶；假單胞菌脂肪酶如來自產鹼假單胞菌(P.alcaligenes)或類產鹼假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、洋蔥假單胞菌(P,c印acia)(EP331376)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB1，372，034)、焚光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌種SD705菌林(Pseudomonassp.strainSD705)(WO95/06720和WO96/27002)、P.wisconsinensis(WO96/12012)的脂肪酶；芽孢桿菌脂肪酶如來自枯草芽胞桿菌(Dartois等，(1993)，BiochemicaetBi叩hysicaActa,1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64〃44992)或短小芽孢桿菌(WO91/16422)的脂肪酶。另一些實例是如在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中描述的那些脂肪酶變體。澱粉酶適宜澱粉酶(a和/或/S)包括那些細菌來源或真菌來源的澱粉酶。化學修飾的或蛋白質工程改造的突變體包括在內。澱粉酶包括例如自芽孢桿菌如更加詳細描述於GB1,296,839中的地衣芽孢桿菌特定抹獲得的a誦澱粉酶。有用澱粉酶的實例是在WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的變體，尤其在如下位置存在一個或多個替代的變體第15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、湧、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444位，纖維素酶適宜纖維素酶包括那些細菌來源或真菌來源的纖維素酶。化學修飾的或蛋白質工程改造的突變體包括在內。適宜纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質黴屬、鐮孢黴屬、梭孢殼屬、頂孢黴屬的纖維素酶，例如公開於US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757和WO89/09259中的由孤獨腐質黴、Myceliphthorathermophila和尖鐮孢產生的真菌纖維素酶，尤其適合的纖維素酶是助於護色的鹼性或中性纖維素酶.此類纖維素酶的實例是在EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纖維素酶。另一些實例是在WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些纖維素酶變體.過氧化物酶/氧化酶適宜過氧化物酶/氧化酶包括那些植物、細菌或真菌來源的過氧化物酶/氧化酶。化學修飾的或蛋白質工程改造的突變體包括在內。有用過氧化物酶的實例包括來自鬼傘屬(Cc;pnVi"s)如灰蓋鬼傘(C:.d"emw)的過氧化物酶以及在WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中描述的它們的變體。通過添加包含一種或多種酶的單獨添加劑或通過添加包含所有這些酶的組合添加劑，使洗滌劑組合物中包含洗滌劑酶。本發明的洗滌劑添加劑(即單獨添加劑或組合添加劑)可配製成顆粒、液體、漿夜等。優選的洗滌劑添加劑製劑是顆粒(尤其為非塵狀顆粒)、液體(尤其是穩定液體)或漿液。非塵狀的顆粒可例如按照US4，106，991和4,661,452中所公開那樣產生並且可任選地通過本領域已知的方法包衣。蠟質包衣材料的實例是平均分子量為1000-20000的聚(環氧乙烷)產物(聚乙二醇，PEG);具有16-50個環氧乙烷單元的乙H^化壬基酚；在醇中包含12-20個碳原子並且存在15-18個環氧乙烷單元的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸以及脂肪酸的單甘油酯、二甘油酯和三甘油酯。適用於通過流化床技術形成膜的包衣材料的實例在GB143591中給出。液體酶製劑可以根據已建立方法通過加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸進行穩定處理。經保護的酶可根據在EP238,216中公開的方法製備。本發明的洗滌劑組合物可為任何方便形式，如棒狀、片狀、粉末、顆粒狀、糊狀或液體。液體洗滌劑可以是含水液體，一般>^有高達70%的水和0-30%的有機溶劑，或者是非水液體。洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，所W面活性劑可以是包括半極性在內的非離子表面活性劑和/或陰離子表面活性劑和/或陽離子表面活性劑和/或兩性離子表面活性劑。表面活性劑水平一般為重量的0.1%-60%。當在洗滌組合物中包含陰離子表面活性劑時，所述洗滌劑一般包含大約1%至大約4%的陰離子表面活性劑，例如直鏈烷基^酸鈉、a烯烴磺酸酯、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)、醇乙氧基琉酸鹽、仲烷基磺酸鹽、a硫代脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂。當在洗滌組合物中包含非離子表面活性劑時，所述洗滌劑一般包含大約0.2%至大約40%的非離子表面活性劑，例如醇乙fl^化物、壬基苯酚乙lL^化物、烷基多葡糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙ll^化脂肪酸單乙醇醯胺、脂肪酸單乙醇醯胺、多羥基烷基脂肪醯胺或葡糖胺的N-阮基N-烷基衍生物("葡糖醯胺(glucamides)")。洗滌劑可以包含0-65%的助洗劑或絡合劑，如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基或鏈烯基琥珀酸、可溶性珪酸鹽或層狀矽酸鹽(例如來自Hoechst的SKS誦6)。洗滌劑可以包含一種或多種聚合物。聚合物的實例是羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡啶N-氧化物、聚乙烯咪唑、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、馬來^/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可以包含含有過氧化氫源如過硼酸鹽或過碳酸鹽的漂白系統，其中所述過氧化氫源可與形成過酸的漂白激活物如四乙醯基乙二胺或壬醯羥苯磺酸鹽混合。備選地，漂白系統可包含例如醯胺型、二醯亞胺型或碸型的過氧酸。本發明洗滌劑組合物中的酶(類)可使用常規穩定劑進行穩定，穩定劑如多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物如芳香硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲醯苯基硼酸，並且組合物可以按照如WO92/19709和WO92/19708中所述配製。洗滌劑還可以包含其它常規洗滌劑成份例如織物調節劑，包括粘土、泡沫促進劑、抑泡劑、防腐劑、汙垢懸浮劑、防塵汙再沾著劑、染料、殺菌劑、螢光增白劑、水溶助長劑、晦暗抑制劑或香料。目前考慮按照相當於每升洗滌液體0.01-100毫克酶蛋白、優選每升洗滌液體0.05-10毫克酶蛋白、更加優選每升洗滌液體0.1-5毫克酶蛋白並且最優選每升洗滌液體0.1-1毫克酶蛋白的量向洗滌劑組合物中加入任意酶和本發明的抗微生物多肽。本發明的抗微生物多肽可以額外加入到WO97/07202中所公開的洗滌劑配方中，該專利文中引用作為參考。通過以下實施例進一步描述本發明，這些實施例將不構成對本發明範圍的限制。實施例用作緩衝液和底物的化學試劑是至少試劑級的商業化產品。實施例l:合成的抗微生物肽的設計、構建和評價為了研究和設計具有有效抗微生物活性的新的AMP，構建了一系列假定的AMP。選擇3個相鄰精氨酸置於6個連續的四氣基酸重複之前。基於其膜相互作用能力和在天然的PR富含肽中的豐度，選擇苯丙氨酸作為系列最初的疏水殘基(ZrZu)。這導致形成12種不同的衍生物，將衍生物指定為SEQIDNO:l至SEQIDNO:12(見表1)。從12條特異寡核苷酸(引物1至引物12)合成了編碼SEQIDNO:l至SEQIDNO:12的12個基因，每一個編碼一條肽。通過互補引物(引物鏈DNA。iVoIDNA限制性酶切位點(加下劃線)位於引物近端部分而A&fll限制性酶切位點(加下劃線)位於引物遠端部分一這些位點用於克隆入相應表達栽體pBAD/glIIA(Invitrogen，美國)。引物l-SEQIDNO:l正向(SEQIDNO:320):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCGCCACGTTTTCCACCTCGTTTTCCACCTCGTTTCCCTCCACGTTTCCCTCCACGCTTCCCACCTCGTTTCTAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物2-SEQIDNO:2正向(SEQIDNO:321):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCACGTTTTCCACCTCGTTTTCCACCTCGTTTCCCTCCACGTTTCCCTCCACGCTTCCCACCTCGTTTCCCGTAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物3-SEQIDNO:3正向(SEQIDNO:322):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCGTTTTCCACCTCGTTTTCCACCTCGTTTCCCTCCACGTTTCCCTCCACGCTTCCCACCTCGTTTCCCGCCATAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物4誦SEQIDNO:4正向(SEQIDNO:323):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTTTTCCACCTCGTTTTCCACCTCGTTTCCCTCCACGTTTCCCTCCACGCTTCCCACCTCGTTTCCCGCCACGTTAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物5-SEQIDNO:5正向(SEQIDNO:324):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCACGTCCTTTTCCGCGCCCTTTTCCACGTCCATTCCCTCGTCCTTTCCCACGCCCTTTTCCACGCCCATTCTAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物6-SEQIDNO:6正向(SEQIDNO:325):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCGTCCTTTTCCGCGCCCTTTTCCACGTCCATTCCCTCGTCCTTTCCCACGCCCTTTTCCACGCCCATTCCCATAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物7-SEQIDNO:7正向(SEQIDNO:326):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCTTTTCCGCGCCCTTTTCCACGTCCATTCCCTCGTCCTTTCCCACGCCCTTTTCCACGCCCATTCCCACGTTAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物8國SEQIDNO:8正向(SEQIDNO:327):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTTTTCCGCGCCCTTTTCCACGTCCATTCCCTCGTCCTTTCCCACGCCCTTTTCCACGCCCATTCCCACGTCCTTAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物9國SEQIDNO:9正向(SEQIDNO:328):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCACCATTTCGTCCACCTTTCCGTCCTCCATTTCGCCCGCCGTTTCGGCCACCGTTTCGACCTCCTTTCCGTTAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物10-SEQIDNO:IO正向(SEQIDNO:329):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCATTTCGTCCACCTTTCCGTCCTCCATTTCGCCCGCCGTTTCGGCCACCGTTTCGACCTCCTTTCCGTCCATAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物ll-SEQIDNO:ll正向(SEQIDNO:330):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTTTTCGTCCACCTTTCCGTCCTCCATTTCGCCCGCCGTTTCGGCCACCGTTTCGACCTCCTTTCCGTCCACCATAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物12-SEQIDNO:12正向(SEQIDNO:331):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCGTCCACCTTTCCGTCCTCCATTTCGCCCGCCGTTTCGGCCACCGTTTCGACCTCCTTTCCGTCCACCATTTTAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物13-反向(SEQIDNO:332):GAGTTTTTGTTCTAGAGCAATTA如國際專利申請WO00/73433的實施例1中所公開，在自殺表達系統(SES)中測試了AMP的抗生素活性。該系統應用敏感宿主(這裡為;U^桿菌)和具有可誘導啟動子的質粒(pBAD/glIIA)。如果肽具有抗菌活性，肽合成的誘導將導致生產細胞的生長抑制和/或細胞死亡一因此為自殺表達系統。通常，抗微生物活性越強，所觀察到的抑制作用越強。將12個雙鏈PCR片段進行純化，用和iVcoI進行限制性酶切並將其克隆入pBAD/glIIA，將它們轉化入大腸桿菌TOP10(Invitrogen)，並在含有100jig/ml氨千青黴素的LB瓊脂平板上重新劃線接種.SEQIDNO:l至SEQIDNO:12的各個克隆在37'C下生長於100微孔板(Honeycomb板)的150jil腿+0.2%葡萄糖+100ng/ml氨千青黴素中，培養基在BioscreenC(Thermosystems，芬蘭)中振蕩。將過夜培養物在100孔honeycomb板中的150jilRM+0.2o/o甘油+100將/ml氨千青黴素(不含有或含有0.1%的誘導物(阿拉伯糖))中稀釋50倍。通過在37'C測量BioscreenC中的OD450，每30分鐘監測一次細胞密度。生長抑制作用的百分比計算為每個樣品的終點OD測量值除以從包含對照載體的細胞中獲得的終點OD測量值並乘以100。方程式如下生長抑制(％)=卜-^樣品OD-空白00)x100工>T";L對照栽體OD—空白ODJ其中"空白OD，，對應於只有生長培養基的OD值。合成AMP的JL&酸序列和相應生長抑制作用示於表1。表lSEQIDNO狄軿列生長抑制(％)對照TMELEICSWYHMGIRSFLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH01RRRPPRFPPRFPPRFPPRFPPRFPPRF48RRRPRFPPRFPPRFPPRFPPRFPPRFP453RRRRFPPRFPPRFPPRFPPRFPPRFPP434RRRFPPRFPPRFPPRFPPRFPPRFPPR465RRRPRPFPRPFPRPFPRPFPRPFPRPF576RRRRPFPRPFPRPFPRPFPRPFPRPFP577RRRPFPRPFPRPFPRPFPRPFPRPFPR398RRRFPRPFPRPFPRPFPRPFPRPFPRP389RRRPPFRPPFRPPFRPPFRPPFRPPFR6710RRRPFRPPFRPPFRPPFRPPFRPPFRP7811RRRFRPPFRPPFRPPFRPPFRPPFRPP7312RRRRPPFRPPFRPPFRPPFRPPFRPPF76如所預期，當缺乏誘導物時沒有觀察到抑制作用或者抑制作用非常小(數據未顯示)。當存在0.1%的誘導物時，全部合成AMP導致生長抑制。實施例2:合成AMP在酵母中的表達將指定為SEQIDNO:l、SEQIDNO:5和SEQIDNO:IO的AMP克隆入酵母表達栽體pHH3885.簡言之，pHH3885是基於pYES(Invitrogen)的酵母/大腸桿菌穿梭載體。該質粒包含2p酵母複製起點和用於在酵母中篩選的Ura3基因。為了在;U^桿菌中繁殖使用了pUC起始和W"基因。表達由Gal啟動子控制，並且使用釀酒酵母a-前導序列介導肽分泌。由於有效AMP的表達將殺死生產微生物，所以抗微生物活性必須,皮掩蓋。這可以使用能夠掩蓋對抗微生物活性至關重要的鄰近電荷的一段陰離子M酸實現。因此，所有3個AMP前面是一段天冬氨酸和穀氨酸(DDDDE)。由於一些蛋白酶特異地在穀氨酸殘基(E)之後切割，所以陰離子延伸段(stretch)能夠從AMP釋放出來以允許監測AMP的抗微生物活性。在標準PCR反應中使用特異性正向引物和通用反向引物可以擴增指定為SEQIDNO:l、SEQIDNO:5和SEQIDNO:IO的PR富含AMP.由於正向寡核苷酸含有全部編碼信息所以不需要模板。引物14-SEQIDNO:l正向(SEQIDNO:333):GTATCGATGGCCAAGAGAGAAGCCGACGATGACGATGAACGTCGCCGTCCGCCACGTTTTCCACCTCGTTTTCCACCTCGTTTCCCTCCACGTTTCCCTCCACGCTTCCCACCTCGTTTCTAGATGGCTCTAGAGGGCCG引物15-SEQIDNO:5正向(SEQIDNO:334):GTATCGATGGCCAAGAGAGAAGCCGACGATGACGATGAACGTCGCCGTCCACGTCCTTTTCCGCGCCCTTTTCCACGTCCATTCCCTCGTCCTTTCCCACGCCCTTTTCCACGCCCATTCTAGATGGCTCTAGAGGGCCG引物16-SEQIDNO:10正向(SEQIDNO:335):GTATCGATGGCCAAGAGAGAAGCCGACGATGACGATGAACGTCGCCGTCCATTTCGTCCACCTTTCCGTCCTCCATTTCGCCCGCCGTTTCGGCCACCGTTTCGACCTCCTTTCCGTCCATAGATGGCTCTAGAGGGCCG引物17-反向(SEQIDNO:336):CGGCCCTCTAGAGCCATCTA別小兩種酶限制性酶切的pHH3885。將相應質粒轉化入大腸桿菌並測序。證實序列之後，將穿梭載體電轉化入釀酒酵母(JG169)並鋪在SC+2。/o葡萄糖+100嗎/ml氨節青黴素瓊脂平板上。將酵母菌落重新劃線接種並在30。C下生長於5ml液體SC基礎培養基(添加2%葡萄糖)中3天。通過以3500轉/分離心5分鐘沉澱細胞。取500fil轉移至microconYM-3離心過濾器(MilliporeCorp.，美國)並通過離心將體積減少至大約20jil。將濃縮的樣品與Tricine加樣緩沖液混合併在16%Tricine凝膠(Novex，Invitrogen，美國)中分析。在三份培養物的每一份中都觀察到清楚的具有預期分子量的條帶，表明表達了三種肽。在包含對照質粒的酵母細胞的上清液中沒有觀察到條帶。實例例3:SEQIDNO:l、SEQIDNO:5和SEQIDNO:IO變體的評價SEQIDNO:l、SEQIDNO:5和SEQIDNO:IO在突變高通量篩選中用作起始點以便獲得具有提高活性的AMP。為了簡單起見，SEQIDNO:l、SEQIDNO:5和SEQIDNO:104^P含有作為疏水殘基的苯丙氨酸。僅應用一種類型疏^J^酸可能對抗微生物活性不是最適的；通過天然肽也說明了這一點，在天然肽中4^P含有疏水殘基的混合。設計了簡併DNA寡聚體，其編碼4種疏:^基酸的每一種而不是限制於苯丙氨酸。原則上，由於SEQIDNO:l、SEQIDNO:5和SEQIDNO:10的每一個包含6個苯丙氨酸殘基，在理論上該庫能夠編碼46或4096種不同的變體。如上使用一條編碼完整肽的長的正向引物(SEQIDNO:l簡併引物，SEQIDNO:5簡併引物和SEQIDNO:10簡併引物)和一條較小的用於合成反向鏈的反向引物(引物13)構建了該庫。N代表25。A可能性的4種核苷酸(G、A、T和C)之一，以允許在指定位置摻入4種疏水胺基酸。SEQIDNO:l簡併引物(SEQIDNO:337)CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCGCCACGTNTTCCACCTCGTNTTCCACCTCGTNTCCCTCCACGTNTCCCTCCACGCNTCCCACCTCGTNTCTAATTGCTCTAGAACAAAAACTCSEQIDNO:5簡併引物(SEQIDNO:338)CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCACGTCCTNTTCCGCGCCCTNTTCCACGTCCANTCCCTCGTCCTNTCCCACGCCCTNTTCCACGCCCANTCTAATTGCTCTAGAACAAAAACTCSEQIDNO:IO簡併引物(SEQIDNO:339)CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCANTTCGTCCACCTNTCCGTCCTCCANTTCGCCCGCCGNTTCGGCCACCGNTTCGACCTCCTNTCCGTCCATAATTGCTCTAGAACAAAAACTC將DNA片段克隆入SES載體pBAD/glIIA並轉化入大腸桿菌以產生三個獨立的庫，每個庫大約一百萬個菌落。將該庫塗在平板上並使用菌^lLlMm每個庫中湘沐大約10,000個單獨菌落放入包含20x稀釋RM+200ng/ml氨節青黴素的96孔微:jl4l中。將這些主板(masterplate)複製接種於一套新的96(包含20x稀釋RM培養基和0.1%或0%誘導物)中，並且於371C培養過夜。從每個庫中分離^泮多最大生長抑制的克隆，將其測序並在BioscreenC中重新測試其生長抑制作用。SEQIDNO:l變體的M酸序列和相應生長抑制作用示於表2;SEQIDNO:5變體的M酸序列和相應生長抑制作用示於表3;並且SEQIDNO:10變體的M酸序列和相應生長抑制作用示於表4。表2.SEQIDNO:l的變體和相應生長抑制作用tableseeoriginaldocumentpage56tableseeoriginaldocumentpage57tableseeoriginaldocumentpage58tableseeoriginaldocumentpage59表4.SEQIDNO:IO的變體和相應生長抑制作用SEQIDNO絲斷列生長抑制(％)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實施例4:來自混合基序庫的合成的PR富含AMP的評價在實施例3中測試的AMP由簡併性的但在其它方面相同的重複組成。為了測試當將12種不同的"4^J-酸序列基序"混合成為一個序列時是否會產生有效AMP，構建了一個新的庫。在該系列中親本主鏈由以下序列基序組成PPRX、PRPX、PXRP、PPRX、PRPX和PXRP;其中X表示疏7jC胺基酸纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸或亮氨酸的任意一個。再次使用等比率的疏水胺基酸。如上面實施例3，使用一條長的編碼完整肽的正向引物(混合基序簡併引物)和較小的用於合成反向鏈的反向引物(引物13)構建了該庫。N代表25。/。可能性的4種核苷酸(G、A、T和C)之一。混合基序簡併引物(SEQIDNO:340)CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCGCCACGTNTTCCACGTCCTNTTCCANTTCGTCCACCGCCACGTNTTCCACGTCCTNTTCCANTTCGTCCATAATTGCTCTAGAACAAAAACTC將PCR合成的DNA片段克隆入SES載體pBAD/glIIA並轉化1大腸桿菌，產生了每個庫包含大約一百萬個菌落的庫。將該庫塗在平板上並使用菌^l沐儀杏沐大約10,000個單獨菌落iix包含20x稀釋RM+200pg/ml氨千青黴素的96孔微《USL中。將這些主板複製接種於一套新的96孑L板(包含20x稀釋RM培養基和0.1%或0%誘導物)中，並且於37匸培養過夜。分離許多最大生長抑制的克隆，將其測序並在BioscreenC中重新測試其生長抑制作用。來自混合基序庫的變體的M酸序列和相應生長抑制作用示於表5。表5.具有混合基序的合成的PR富含AMPtableseeoriginaldocumentpage65tableseeoriginaldocumentpage66tableseeoriginaldocumentpage67tableseeoriginaldocumentpage68tableseeoriginaldocumentpage69實施例5:所選擇肽的MIC、MBC和MEC的測定為了^^在實施例1-4中所鑑定和描述肽的抗微生物潛能，測定了3種結構不同肽對一定範圍微生物的最低抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)和最低效應濃度(MEC)。選擇以下3種肽進行化學合成並測定其抗微生物潛能PR曙1(RRR-PRPV-PRPF曙PRPV-PRPL-PRPF-PRPF)(SEQIDNO:61)PR曙2(RRR-PFRP-PFRP-PFRP-PVRP-PVRP-PFRP)(SEQIDNO:79)PR-3(RRR-PPRL國PRPF-PVRP-PPRF-PRPF-PLRP)(SEQIDNO:239)測試微生物包括:^桿菌(ATCC10536)、肉葡萄球菌cflm仍附)、模仿葡萄球菌s/挑"/fl"s)、藤黃微球菌(M/"te"s(ATCC9341))、枯草芽孢桿菌(ATCC6633)和釀酒酵母(ATCC9763)。按照稍加修改NCCLS方案進行MIC和MBC測定，其中所作的修改為將肽溶於0.01%醋酸和0.1%BSA中以避免在高濃度時肽沉澱並且使肽與塑料容器的結合最小化。按照Steinberg和Lehrer(MethodsinMolecularBiology,第78巻AntibacterialPeptideProtocols)的方法在瓊脂糖彌散抗菌實驗(radialdiffusionassay)裝置中測定MEC。MEC方案避免了與用NCCLS方案測試抗微生物lbf目關的一些問題並且能夠提供非常靈敏的測試裝置。結果示於表6-8。表6.MIC測定(全部數值為pg/ml)tableseeoriginaldocumentpage70表7.MBC測定(全部數值為ng/ml)tableseeoriginaldocumentpage70菌球菌菌桿菌PR-11286464>12864>128PR-2>128>128>1286464>128PR-31286432>12864>128表8.MEC測定(全部數值jig/ml)肽大腸桿菌肉葡萄球菌模仿葡萄球菌藤黃微球菌枯草芽孢桿菌酉良酒酵母PR-13.01.70.80.42.432PR國23.02.01.10.53.632PR畫33.01.80.90.82.0>1284艮明顯，三種PR富含肽在限定條件下對革蘭氏陽性微生物和革蘭氏陰性微生物具有廣鐠活性。實施例6:PR-1、PR-2和PR-3的溶血活性分析了抗微生物肽溶解人紅細胞(hRBC)的能力。紅細,驗測定法提供了評價測試材料的膜溶解活性的簡單測試系統。它適宜作為溶血特性的篩選測定。血紅蛋白釋放是一種有用的細胞膜完整性終點。通過測量540nm處的吸光度測定釋放的血紅蛋白。通常，計算出導致總溶解樣品50%溶血的濃度(HL50);然而由於測試肽的低溶血活性，所以在本實施例中未計算該值。在本測試裝置中使用了8%的RBC懸浮液(12日齡)。在表9中顯示了相對100%溶解樣品的各個溶血作用值。表9.溶血作用值肽濃度Oig/ml)溶血作用(％)tableseeoriginaldocumentpage72由於肽溶解於0.01%醋酸中，所以還包括了0.01%醋酸的媒介物對照。在兩個板中都包括了含有25%、10%、5%的0.01%醋酸的PBS。在任一測試濃度都沒有觀察到與背景不同的溶血反應。為了證實劑量/反應效應的存在，還測試了SDS的溶血活性。表IO.SDS劑量/反應值tableseeoriginaldocumentpage72三種測試肽變體PR-1、PR-2和PR-3在測定濃度下沒有顯示出與背景水平顯著不同的溶血特性。在本測定中自發;^jfc作用水平高，可能是由於紅細胞年齡(12天)的原因。相對高水平的自發溶血作用不會影響產生這樣的結論，即三種肽在測試濃度是非溶血性的。序列表〈110〉諾和酶股份有限公司(NovozymesA/S)〈120〉合成的抗微生物多肽〈130〉10275.204-WO〈160〉340〈170〉Patentln版本3.2〈210〉1〈211〉27PRT〈213〉人工的〈220〉〈223>合成的抗微生物多肽〈400〉1ArgArgArgProProArgPheProProArgPheProProArgPhePro151015ProArgPheProProArgPheProProArgPhe2025〈210>2〈211>27〈212〉PRT〈213>人工的〈220>合成的抗微生物多肽2ArgArgArgProArgPheProProArgPheProProArgPheProPro151015ArgPheProProArgPheProProArg■PhePro20253〈211〉27PRT人工的〈223〉合成的抗微生物多肽3ArgArgArgArgPheProProArgPheProProArgPheProProArg151015PheProProArgPheProProArgPheProPro2025〈210〉〈211〉〈212>〈213>〈220〉〈223〉〈400〉427PRT人工的合成的抗微生物多肽4ArgArgArgPheProProArgPheProProArgPheProProArgPhe151015ProProArgPheProProArgPheProProArg2025〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉〈400>527PRT人工的合成的抗微生物多肽5ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProPhePro151015ArgProPheProArgProPheProArgProPhe2025〈210〉〈212〉〈213>〈220〉〈400〉627PRT人工的合成的抗微生物多肽6ArgArgArgArgProPheProArgProPheProArgProPheProArg151015ProPheProArgProPheProArgProPhePro2025〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉〈400〉727PRT人工的合成的抗微生物多肽7ArgArgArgProPheProArgProPheProArgProPheProArgPro151015PheProArgProPheProArgProPheProArg2025〈210〉〈220〉〈223〉〈400>827PRT人工的合成的抗微生物多肽8ArgArgArgPheProArgProPheProArgProPheProArgProPhe151015ProArgProPheProArgProPheProArgPro2025〈211>〈212>927PRT人工的〈220〉〈223〉合成的抗微生物多肽〈400〉9ArgArgArgProProPheArgProProPheArgProProPheArgPro151015ProPheArgProProPheArgProProPheArg2025〈210>〈212>〈220>〈223>〈400>1027PRT人工的合成的抗微生物多肽10ArgArgArgProPheArgProProPheArgProProPheArgProPro151015PheArgProProPheArgProProPheArgPro2025〈211>〈212>〈213>〈223>〈400〉1127PRT人工的合成的抗微生物多肽11ArgArgArgPheArgProProPheArgProProPheArgProProPhe151015ArgProProPheArgProProPheArgProPro2025<211〉〈213>1227PRT人工的合成的抗微生物多肽12ArgArgArgArgProProPheArgProProPheArgProProPheArg151015ProProPheArgProProPheArgProProPhe2025〈210>1327PRT〈213〉人工的〈220〉〈223〉合成的抗微生物多肽〈400〉13ArgArgArgProProArgPheProProArgPheProProArgPhePro151015ProArgPheProProArgPheProProArgPhe2025〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉〈400>1427PRT人工的合成的抗微生物多肽14ArgArgArgProProArgPheProProArglieProProArgPhePro151015ProArgLeuProProArglieProProArgLeu2025〈210〉〈211>〈220〉〈223〉〈400〉1527PRT人工的合成的抗微生物多肽15ArgArgArgProProArgPheProProArglieProProArgLeuPro151015ProArgValProProArgValProProArgLeu202516〈211>27PRT〈213〉人工的〈220〉〈223>合成的抗微生物多肽<400〉16ArgArgArgProProArglieProProArgPheProProArgValPro151015ProArgPheProProArgValProProArgVal2025〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉1727PRT人工的合成的抗微生物多肽17ArgArgArgProProArglieProProArgLeuProProArgliePro151015ProArgPheProProArgPheProProArgLeu2025〈213〉〈220>1827PRT人工的合成的抗微生物多肽18ArgArgArgProProArgLeuProProArgPheProProArgPhePro151015ProArglieProProArgPheProProArglie2025〈210〉〈211〉〈213>〈220〉〈223>〈400〉1927PRT人工的合成的抗微生物多肽19ArgArgArgProProArgLeuProProArgPheProProArgPhePro151015ProArglieProProArgPheProProArglie2025〈210〉〈211〉〈212>〈213〉〈220>〈223〉2027PRT人工的合成的抗微生物多肽20ArgArgArgProProArgLeuProProArgPheProProArgPhePro151015ProArgValProProArgPheProProArgVal2025〈210>2127PRT人工的合成的抗微生物多肽21ArgArgArgProProArgLeuProProArgPheProProArgPhePro151015ProArgValProProArgPheProProArgVal2025〈211〉〈213>〈223〉2227PRT人工的合成的抗微生物多肽22ArgArgArgProProArgLeuProProArgPheProProArgPhePro151015ProArgValProProArgLeuProProArgPhe2025〈211〉27〈212〉PRT〈213〉人工的〈220〉〈223〉合成的抗微生物多肽〈400〉23ArgArgArgProProArgLeuProProArgPheProProArgPhePro151015ProArgValProProArgValProProArgPhe2025〈210〉〈211>〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉2427PRT人工的合成的抗微生物多肽24ArgArgArgProProArgLeuProProArgPheProProArgPhePro151015ProArgValProProArgValProProArgPhe2025〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉〈400〉2527PRT人工的合成的抗微生物多肽25ArgArgArg1ProProArgLeuProProArgPheProProArgPhePro51015ProArgValProProArgValProProArglie20252627PRT<213〉人工的26ArgArgArgProProArgValProProArgPheProProArgValPro151015ProArgPheProProArgValProLeuArgLeu2025<210〉〈211〉<212〉<220〉〈223〉2827PRT人工的合成的抗微生物多肽28ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProPhePro151015ArgProPheProArgProPheProArgProPhe2025〈210>29〈211〉26〈212〉PRT<213〉人工的〈220〉〈223〉合成的抗微生物多肽29ArgArgArgProArgLeuProArgProPheProArgProValProArg151015ProLeuProArgProValProArgProlie2025〈210〉〈211〉〈212〉<213〉〈220〉〈400〉3027PRT人工的合成的抗微生物多肽30ArgArgArgProArgProPheProProProPheProArgProliePro151015ArgProPheProArgProPheProArgProLeu2025〈212〉〈213〉〈220><223〉3127PRT人工的合成的抗微生物多肽31ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProHisProPhePro151015ArgProPheProArgProlieProArgProlie20253227〈212>PRT〈213〉人工的〈220><223〉合成的抗微生物多肽〈400〉32ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProHisProliePro151015ArgProLeuProArgProPheProArgProlie2025〈211>〈212〉〈223〉<400〉3327PRT人工的合成的抗微生物多肽33ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProPhePro151015ArgProPheProArgProPheProArgProPhe2025〈210〉<211〉<212〉<213〉〈223〉3427PRT人工的合成的抗微生物多肽34ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProPhePro151015ArgProPheProArgProPheProArgProLeu2025〈211〉〈213〉<220〉<223〉〈400〉3527PRT人工的合成的抗微生物多肽35ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProPhePro151015ArgProPheProArgProlieProArgProPhe2025〈210〉〈211〉〈213〉〈220〉〈223〉〈400>3627PRT人工的合成的抗微生物多肽36ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProPhePro151015ArgProPheProArgProlieProArgProlie2025〈213〉〈220〉〈223〉〈400〉3727PRT人工的合成的抗微生物多肽37ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProPhePro151015ArgProlieProArgProPheProArgProVal2025〈210〉〈211>〈212〉〈213>〈223〉<400〉3827PRT人工的合成的抗微生物多肽38ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProPhePro151015ArgProlieProArgProValProArgProlie2025〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉〈400〉3927PRT人工的合成的抗微生物多肽39ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProPhePro151015ArgProLeuProArgProPheProArgProPhe2025〈211〉<212〉〈213〉〈220〉〈400>4027PRT人工的合成的抗微生物多肽40ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProPhePro151015ArgProValProArgProLeuProArgProlie2025〈210〉〈223>4127PRT人工的合成的抗微生物多肽41ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProPhePro151015ArgProValProArgProLeuProArgProVal20254227〈212〉PRT<213〉人工的〈220〉〈223〉合成的抗微生物多肽42ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProliePro151015ArgProPheProArgProLeuProArgProlie2025〈211>〈213〉4327PRT人工的合成的抗微生物多肽43ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProliePro151015ArgProPheProArgProValProArgProVal20254427PRT人工的合成的抗微生物多肽44ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProLeuP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20〉〈223〉〈400>31027PRT人工的合成的抗微生物多肽310ArgArgArgProProArgValProArgProPheProlieArgProPro151015ProArgValProArgProValProValArgPro2025〈212〉〈213>〈220>〈223>〈400>31127PRT人工的合成的抗微生物多月太311ArgArgArgPro1ProArgValProArgProPheProValArgProPro51015ProArgPheProArgProValProPheArgPro2025312〈211>27<212〉PRT人工的<220〉合成的抗微生物多肽〈400>312ArgArgArgProProArgValProArgProlieProlieArgProPro151015ProArgValProArgProValProPheArgPro2025〈210〉〈212〉〈213〉〈220>〈400〉31327PRT人工的合成的抗微生物多肽313ArgArgArgProProArgValProArgProlieProlieArgProPro151015ProArgValProArgProValProValArgPro2025〈210〉<211〉〈212〉〈213〉〈400〉31427PRT人工的合成的抗微生物多肽314ArgArgArgProProArgValProArgProLeuProPheArgProPro151015ProArgPheProArgProlieProPheArgPro2025〈211>〈212〉〈213〉31527PRT人工的〈220〉〈223〉合成的抗微生物多肽315ArgArgArgProProArgValProArgProValProValArgProPro151015ProArglieProArgProPheProValArgPro2025〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉31628PRT人工的合成的抗微生物多肽316ArgArgArgThrArgHisValPheAlaArgProPheProPheArgPro151015ProProArglieProArgProPheProLeuArgPro2025〈210〉〈211〉〈220>〈400〉31728PRT人工的合成的抗微生物多肽317ArgArgArgThrArgHisValPheAlaArgProValProValArgPro151015ProProArgValProArgProPheProValArgPro2025〈210〉〈212〉〈220〉〈223〉31828PRT人工的合成的抗微生物多肽318ArgArgArgThrArgHisValValProArgProLeuProValArgPro151015ProProArgValProArgProPheProLeuArgPro2025〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉31941PRT人工的合成的抗微生物多肽319ArgArgArgProProArgValProArgProPheProValArgProPro151015ProArgValProArgProlieProPheValHisAsnCysSerArgThr202530LysThrHisLeuArgArgGlySerGlu3540〈210〉〈211〉〈212>〈213〉〈220〉<223〉320120墜人工的引物l320ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccgccacgttttccacctcgttttccacctcgttt60ccctccacgtttccctccacgcttcccacctcgtttctaattgctctagaacaaaaactc120〈210〉321〈211>120〈212>DNA〈213>人工的引物2〈400〉321ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccacgttttccacctcgttttccacctcgtttccc60tccacgtttccctccacgcttcccacctcgtttcccgtaattgctctagaacaaaaactc120〈210>322〈211〉120〈212〉廳〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物3〈400〉322ccatagcaccatggcgcgtcgccgtcgttttccacctcgttttccacctcgtttccctcc60acgtttccctccacgcttxccacctcgtttcccgccataattgctctagaacaaaaactc120〈210〉323〈211〉120〈212〉■〈213>人工的〈220〉〈223〉引物4〈400〉323ccatagcaccatggcgcgtcgccgttttccacctcgttttccacctcgtttccctccacg60tttccctccacgcttcccacctcgtttcccgccacgttaattgctctagaacaaaaactc120324120〈212〉腿人工的〈220〉<223〉引物5〈400〉324ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccacgtccttttccgcgcccttttccacgtccatt60ccctcgtcctttcccacgcccttttccacgcccattctaattgctctagaacaaaaactc120〈210〉325120<212〉DNA人工的〈220〉引物6325ccatagcaccatggcgcgtcgccgtcgtccttttccgcgcccttttccacgtccattccc60tcgtcctttcccacgcccttttccacgcccattcccataattgctctagaacaaaaactc120326120〈212〉腿<213〉人工的引物7〈400>326ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccttttccgcgcccttttccacgtccattccctcg60tcctttcccacgcccttttccacgcccattcccacgttaattgctctagaacaaaaactc120327〈211>120〈212>飄〈213>人工的〈220>〈223〉引物8〈400〉327ccatagcaccatggcgcgtcgccgttttccgcgcccttttccacgtccattccctcgtcc60tttcccacgcccttttccacgcccattcccacgtccttaa"ttgctctagaacaaaaactc120〈210〉328〈211〉120〈212〉DNA〈213〉人工的〈220〉〈223>引物9〈400〉328ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccaccatttcgtccacctttccgtcctccatttcg60cccgccgtttcggccaccgtttcgacctcctttccgttaattgctctagaacaaaaactc120329〈211〉120<212〉薩〈213〉人工的引物IO〈400>329ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccatttcgtccacctttccgtcctccatttcgccc60gccgtttcggccaccgtttcgacctcctttccgtccataattgctctagaacaaaaactc120〈210>330120〈212>DNA人工的引物ll330ccatagcaccatggcgcgtcgccgttttcgtccacctttccgtcctccatttcgcccgcc60gtttcggccaccgtttcgacctcctttccgtccaccataattgctctagaacaaaaactc120<210〉331<211〉120〈212〉DNA〈213〉人工的〈220〉引物12331ccatagcaccatggcgcgtcgccgtcgtccacctttccgtcctccatttcgcccgccgtt60tcggccaccgtttcgacctcctttccgtccaccattttaattgctctagaacaaaaactc12033223〈212>DNA人工的〈220>〈223>引物13〈400〉332gagtttttgttctagagcaatta23〈210>333〈211〉140DNA〈213>人工的〈223〉引物14〈400〉333gtatcgatggccaagagagaagccgacgatgacgatgaacgtcgccgtccgccacgUtt60ccacctcgttttccacctcgtttccctccacgtttccctccacgcttcccacctcgtttc120tagatggctctagagggccg140〈210>334〈211〉140〈212〉DNA〈213〉人工的〈223〉引物15334gtatcgatggccaagagagaagccgacgatgacgatgaacgtcgccgtccacgtcctttt60ccgcgcccttttccacgtccattccctcgtcctttcccacgcccttttccacgcccattc120tagatggctctagagggccg140〈210>335〈211〉140〈212〉DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物16〈400〉335gtatcgatggccaagagagaagccgacgatgacgatgaacgtcgccgtccatttcgtcca60cctttccgtcctccatttcgcccgccgtttcggccaccgtttcgacctcctttccgtcca120t卿tggctctagagggccg14033620〈212〉DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物17〈400〉336cggccctctagagccatcta20337〈211>120DNA〈213>人工的〈223>SEQIDN0:1—簡併引物<221〉misc—feature(35)..(35)〈223〉n為a，c,g或t〈220〉〈221>misc—feature(47)..(47)〈223〉n為a，c,g或t〈220>〈221〉misc—feature(59)..(59)〈223〉n為a,c，g或t<220〉misc一feature<222〉(71)..(71)n為a，c,g或t<220〉<221〉misc—feature〈222〉(83)..(83)<223〉n為a,c，g或tmisc一feature(95)..(95)n為a，c,g或t337ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccgccacgtnttccacctcgtnttccacctcgtnt60ccctccacgtntccctccacgcntcccacctcgtntctaattgctctagaacaaaaactc120338<211〉120DNA人工的〈220>〈223〉SEQIDN0:5-簡併引物〈220〉〈221〉misc一feature〈222〉(35)..(35)〈223〉n為a，c,g或t〈220〉〈221〉misc—feature〈222〉(47)..(47)〈223〉n為a，c,g或t<221〉misc—feature〈222〉(59)..(59)〈223〉n為a,c，g或t〈220〉〈221〉misc一feature(71)..(71)〈223〉n為a,c，g或tmisc一feature<222〉卿..(83)〈223〉n為a，c，g或t<220(95)7.(95)<223〉n為a'c，g或t338ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccacgtcctnttccgcgccctnttccacgtccant60ccctcgtcctntcccacgccctnttccacgcccantctaaUgctctagaacaaaaactc120339120DNA人工的<220〉<223〉SEQIDNO:IO-簡併引物〈220〉misc—feature(29)..(29)n為a，c,g或t<220〉<221〉misc—feature<222〉(41)..(41)<223〉n為a,c，g或t〈220〉<221〉raise—feature(53):.(53)<223〉n為a,c,g或t<220〉misc—feature(65)..(65)n為a,c,g或tmisc一feature(77)..(77)<223〉n為a'c，g或tmisc—feature(89)..(89)n為a,c，g或t〈400>339ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccanttcgtccacctntccgtcctccanttcgccc60gccgnttcggccaccgnttcgacctcctntccgtccataaUgctctagaacaaaaactc120〈210〉340〈211〉120〈212〉腿〈213〉人工的〈220〉〈223〉混合基序-簡併引物<221〉〈222〉misc(35):n為a,feature二(35)c，g或t〈223〉misc(47):n為a，feature-.(47)c，g或t〈220〉〈222>misc(53):n為a'feature(53)c,g或t〈222>〈223〉miscm):n為a,feature(71)c,g或t〈220〉〈222〉misc卿:n為a,feature匿.(83)c,g或t<220〉〈222〉〈223〉misc(89):n為a，feature一.(89)c,g或t340ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccgccacgtnttccacgtcctnttccarvttcgtcc60accgccacgtnttccacgtcctnttccanttcgtccataattgctctagaacaaaaactc120權利要求1.具有抗微生物活性的多肽，其包含胺基酸序列X1-X2-X3-X4-X5；其中X1、X2、X3、X4和X5中的每一個選自胺基酸序列P-P-R-F、P-R-F-P、R-F-P-P、F-P-P-R、P-R-P-F、R-P-F-P、P-F-P-R、F-P-R-P、P-P-F-R、P-F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P-P-R-L、P-R-L-P、R-L-P-P、L-P-P-R、P-R-P-L、R-P-L-P、P-L-P-R、L-P-R-P、P-P-L-R、P-L-R-P、L-R-P-P、R-P-P-L、P-P-R-V、P-R-V-P、R-V-P-P、V-P-P-R、P-R-P-V、R-P-V-P、P-V-P-R、V-P-R-P、P-P-V-R、P-V-R-P、V-R-P-P、R-P-P-V、P-P-R-I、P-R-I-P、R-I-P-P、I-P-P-R、P-R-P-I、R-P-I-P、P-I-P-R、I-P-R-P、P-P-I-R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I；並且其中X1-X5中最多4個是相同的。2.權利要求l的多舦，其中XpX2、X3、X4和Xs選自^J^酸序列P-P-R-ZpP-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Z5、R-P-Z6-P、P-Zy-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9-R、P-Z10-R-P、Zu-R-P-P和R-P-P-Z12;其中除了ZrZ12胺基酸以外X廣Xs是相同的；並且其中ZrZu選自胺基酸F、L、V和I。3.權利要求1的多肽，其包含M酸序列:XrX2-X3-XrXs-X6;其中&、X2、X3、X4、Xs和X6中的每一個選自絲酸序列:P-P-R-F、P-R-F-P、R-F-P-P、F-P-P國R、P-R曙P-F、R-P畫F-P、P-F-P誦R、F-P國R畫P、P誦P誦F國R、P畫F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P陽P-R-L、P-R-L醫P、R-L-P-P、L畫P-P畫R、P國R-P畫L、R畫P畫L-P、P-L國P畫R、L國P-R-P、P-P-L-R、P誦L醫R-P、L國R-P誦P、R-P-P-L、P-P-R畫V、P-R-V腸P、R-V-P-P、V-P漏P-R、P-R誦P-V、R-P-V-P、P誦V-P誦R、V國P誦R-P、P陽P-V-R、P誦V-R畫P、V誦R-P-P、R誦P誦P-V、P-P-R-I、P-R-I-P、R-I-P-P、I誦P-P-R、P國R-P-I、R-P-I-P、P陽I畫P-R、I誦P-R-P、P-P-I-R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I;並且其中X^Xfi中最多4個是相同的。4.權利要求3的多肽，其中Xi、X2、X3、X4、Xs和X6選自M紗列P-P-R-ZpP-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Z5、R-P-Z6-P、P-Z7-P-R、Zs-P誦R曙P、P-P-Z9-R、P誦Zk)-R-P、Zu-R誦P-P和R-P-P-Z12;其中除了Z廣Zu^J^酸以外X廣X6是相同的；並且其中Z廣Zu選自^酸F、L、V和I'5.權利要求1-4中任意一項所述的多肽，其中XrXs中最多3個是相同的。6.權利要求1-5中任意一項所述的多肽，其中XrX5中最多2個是相同的。7.權利要求1-6中任意一項所述的多肽，其中XrX2-X3-X4-X5或XrX;rX3-X4-X5-X6之前立即為3-10個胺基酸的M酸序列，其中在所述氨基^列當中至少2個胺基酸在中性pH時帶正電荷。8.權利要求1-6中任意一項所述的多肽，其由胺基酸序列X廣XrX3-X4-Xs或XrX2-X3-X4-X5-X6組成。9.一種多核苷酸，其具有編碼權利要求l-8中任意一項所定義多肽的核苷酸序列，10.包含權利要求9中所定義核苷酸序列的核酸構建體，其中所述核苷酸序列與指導多肽在適宜宿主中產生的一種或多種控制序列有效連接。11.一種重組表達載體，其包含權利要求10中所定義的核酸構建體。12.—種重組宿主細胞，其包含權利要求10中所定義的核酸構建體。13.生產如權利要求l-8中任意一項所定義多肽的方法，該方法包括(a)在有利於多肽產生的條件下培養如權利要求12所定義的重組宿主細胞；和(b)回收多肽。14.一種組合物，其包含如權利要求1-8中任意一項所定義的抗微生物多肽。15.權利要求14的組合物，其還包含另外的殺生物劑。16.殺死微生物細胞或抑制孩i生物細胞生長的方法，其包括將孩1生物細胞與如權利要求1-8中任意一項所定義的抗微生物多肽接觸。17.—種洗滌劑組合物，其包含表面活性劑和如權利要求l-8中任意一項所定義的抗微生物多肽。18.用作藥物的如權利要求l-8中任意一項所定義的抗微生物多肽。19.用作抗微生物的獸用或人用治療劑或預防劑的如權利要求1-8中任意一項所定義的抗微生物多肽。20.如權利要求l-8中任意一項所定義的抗微生物多肽的用途,其用於製備用於微生物感染治療或用於預防用途的獸用或人用治療劑。21.如權利要求l-8中任意一項所定義的抗微生物多肽的用途，其用於殺死微生物細胞或抑制微生物細胞生長。22.轉基因植物、植物部分或植物細胞，其已經用核苷酸序列轉化，其中所述核苷酸序列編碼如權利要求1-8中任意一項所定義的具有抗微生物活性的多肽。23.至少一種如權利要求1-8中任意一項所定義抗微生物多肽在動物飼料中的用途.24.至少一種如權利要求1-8中任意一項所定義抗微生物多肽在製備用於動物祠料的組合物中的用途。25.—種動物飼料添加劑，其包含(a)至少一種如權利要求l-8中任意一項所定義的抗微生物多肽；和(b)至少一種脂溶性維生素，和/或(c)至少一種水i^性維生素，和/或(d)至少一種微量礦物質，和/或(e)至少一種巨量礦物質。26.權利要求25的動物飼料添加劑，其還包含肌醇六磷酸酶、木l^t酶、半乳聚糖酶和/或)8-葡聚糖酶。27.—種動物飼料組合物，其具有50-800g/kg的粗蛋白質含量並且包含至少一種如權利要求1-8中任意一項所定義的抗微生物多肽.全文摘要本發明涉及具有抗微生物活性的多肽和具有編碼多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本發明還涉及核酸構建體、載體和包含核酸構建體的宿主細胞以及生產和使用該多肽的方法。文檔編號A61K38/17GK101113173SQ20071013624公開日2008年1月30日申請日期2004年9月13日優先權日2003年9月12日發明者H-H·K·赫根豪格申請人:諾和酶股份有限公司