在鉤狀效應區域內具有檢測能力的測定裝置的製作方法

2023-11-03 17:32:42 2

專利名稱：：在鉤狀效應區域內具有檢測能力的測定裝置的製作方法在鉤狀效應區域內具有檢測能力的測定裝置
背景技術：
：穿流(flow-through)測試中普遍採用了多種不同的分析方法和裝置，用以確定測試樣品中可能存在的分析物是否存在和/或濃度。例如，免疫測定法利用免疫系統機制，其中響應有機體病原性或外源性抗原的存在而產生了抗體。這些抗體和抗原，即免疫反應物能夠彼此結合，由此引起能夠用來確定生物樣品中特定抗原的存在或濃度的高度特異性反應糹幾制。有幾種公知的免疫測定方法，這些方法利用由可檢測的成分標記的免疫反應物，從而能夠對分析物進行分析檢測。例如，"夾心型，，測定方式一般涉及使測試樣品與檢測探針混合，這些檢測探針與分析物的特異性結合成員(例如抗體)綴合，從而在分析物與綴合探針之間形成複合物。然後使這些複合物與固定在檢測區內的受體材料(例如抗體)相接觸。分析物/探針綴合複合物與固定的受體材料之間發生結合，從而在定位能夠檢測以指示分析物存在的"夾心"複合物。這項技術可用於獲得定量或半定量的結果。這些夾心型測定的一些實例在Gmbb等人的U.S.4,168,146和Tom等人的U.S.4,366,241中有所描述。另一種技術是"竟爭型"測定。在竟爭性測定中，標記探針通常是和與分析物相同或類似的分子綴合。因此，標記探針與目標分析物竟爭所存在的受體材料。竟爭性測定法通常用於檢測諸如半抗原之類的分析物，每個半抗原都是單價的並且僅能夠結合一個抗體分子。竟爭性免疫測定裝置的實例在Deutsch等人的U.S.4,235,601、Liotta的U.S.4，442,204和Buechler等人的U.S.5,208,535中有所記載。儘管這些裝置具有優勢，但當暴露於較高濃度的分析物時，許多常規的側流測定都會遭遇準確度明顯不足的問題。例如，當分析物以高濃度存在時，測試樣品中相當大部分的分析物可能存在過量因而不能與綴合探針形成複合物。因此，到達檢測區時，未複合的分析物與複合的分析物竟爭結合位點。因為未複合分析物沒有用探針標記，因而不能被檢測到。因此，如果大量的結合位點被未複合的分析物所佔據，則該測定可能顯示出"假陰性"。該問題通常稱為"鉤狀效應(hookeffect)"或"前帶(prozone)，，。已經提出多種用於減少免疫測定中的"鉤狀效應"的技術。例如，Kuo等人的美國專利U.S.6,183,972中記載了一種多孔材料條帶,通過它懷疑含有分析物的測試流體可以通過毛細作用流動。該條帶具有至少兩個其中固定有特異於分析物的第一抗原決定部位的抗體的不同的捕獲區域。還採用了帶可檢測標記的特異於分析物第二抗原決定部位的抗體。當存在足夠濃度時，分析物部分阻斷了固定抗體與分析物第一抗原決定部位的結合。因此，在捕獲區內形成了固定抗體、分析物和標記抗體的夾心形式。因而在各個不同的捕獲區域中標記抗體發出的信號提供了一種獨特於分析物濃度的信號模式。通過數學方法將這一組信號合併形成單調劑量響應曲線，以算出固定抗體與分析物第一抗原決定部位之間結合的阻斷。然而，現在仍然需要一種以準確而簡單廉價的方式測定"鉤狀效應"區域內分析物濃度的改進技術。發明簡述根據本發明的一種實施方式，公開了一種用於檢測測試樣品中分析物的存在或數量的側流測定裝置。這種側流測定裝置包括與綴合檢測探針連通(incommunicationwith)的多孔膜。所述分析物能夠與該綴合檢測探針形成複合物。所述多孔膜限定出固定有第一受體材料的檢測區，該第一受體材料設計成優先與分析物結合，而無論分析物是否與綴合檢測探針複合。所述多孔膜還限定出位於檢測區下遊的指示區，其中該指示區中固定有第二受體材料。該第二受體材料設計成優先與未複合的綴合檢測探針結合。所述檢測區和指示區能夠產生可測量的信號。該可測量的指示信號強度與參比標準相比較以確定測試樣品中的分析物濃度是否處於構狀效應區域內。所迷參比標準表示了在處於分析物的飽和濃度或飽和濃度附近時指示信號的強度或強度範圍。本發明公開了一種定量或半定量地檢測測試樣品中的分析物的方法。該方法包括使測試樣品與側流裝置的多孔膜接觸。該多孔膜與綴合檢測探針連通，並進一步限定出檢測區和位於檢測區下遊的指示區。該方法包括測量檢測區產生的檢測信號強度以及指示區產生的指示信號強度。該方法進一步包括將測得的指示信號強度與參比標準相比較，所述參比標準表示在分析物的飽和濃度或飽和濃度附近指示信號的強度或強度範圍。以下更詳細地論述本發明的其它特徵和方面。附圖簡要說明針對本領域的普通技術人員，本發明的全面和可實施的內容，包括其最佳方式，都參照附圖在說明書的剩餘部分進行了更加具體的闡述，其中圖1是本發明的側流測定裝置的一個實施方式的透視圖；圖2是根據本發明的一種實施方式，檢測和指示區的分析物濃度和信號強度之間的關係曲線圖；圖3是用於本發明一種實施方式的機制在實施測定之前的示意圖；圖4表示了測定完成後圖3的實施方式；圖5表示了用於測定分析物濃度是否處於"構狀效應"區域內、並半定量或定量地測定該分析物濃度的方法的一種實施方式；圖6是實施例4的劑量響應區線，其中繪製了信號強度與CRP濃度的關係；圖7是實施例5的劑量響應區線，其中繪製了信號強度與CRP濃度的關係；圖8是實施例6的劑量響應區線，其中繪製了信號強度與CRP濃度的關係；圖9是實施例8的各綴合顆粒濃度的劑量響應曲線圖，其中繪製了檢測區產生的強度(即Rann分數)與CRP濃度的關係；圖IO是實施例8的各綴合顆粒濃度的劑量響應曲線圖，其中繪製了指示區產生的強度(即Rann分數)與CRP濃度的關係；圖11是實施例9的劑量響應曲線圖，其中繪製了檢測區和指示區的Rann分數與CRP濃度的關係，其中金顆粒尺寸為40納米，綴合物光密度為1.0,抗體線濃度為0.5毫克每毫升，CRP線濃度為0.5毫克每毫升；圖12是實施例9的劑量響應曲線圖，其中繪製了檢測區和指示區的Rann分數與CRP濃度的關係，其中金顆粒尺寸為60納米，綴合物光密度為1.0,抗體線濃度為0.5毫克每毫升，CRP線濃度為0.5毫克每毫升；圖13是實施例9的劑量響應曲線圖，其中繪製了檢測區和指示區的Rann分數與CRP濃度的關係，其中金顆粒尺寸為40納米，綴合物光密度為1.0，抗體線濃度為0.1毫克每毫升，CRP線濃度為0.5毫克每毫升；圖14是實施例9的劑量響應曲線圖，其中繪製了檢測區和指示區的Rann分數與CRP濃度的關係，其中金顆粒尺寸為60納米，綴合物光密度為1.0,抗體線濃度為0.5毫克每毫升，CRP線濃度為0.5毫克每毫升；以及圖15是實施例9的劑量響應曲線圖，其中繪製了檢測區和指示區的Rann分數與CRP濃度的關係，其中金顆粒尺寸為40納米，綴合物光密度為2.5,抗體線濃度為O.l毫克每毫升，CRP線濃度為0.5毫克每毫升。附圖標記在本說明書和附圖中的重複使用意味著其代表本發明的相同或類似特徵或部件。代表性實施方式詳述定義正如本文所用的，術語"分析物"通常是指待檢測的物質。例如，分析物可包括抗原性物質、半抗原、抗體以及這些物質的組合。分析物包括但不限於毒素、有機化合物、蛋白質、肽、微生物、胺基酸、核酸、激素、類固醇、維生素、藥物(包括那些為了治療目的而施用的藥物和那些為了違法目的而施用的藥物)、藥物中間體或副產物、細菌、病毒顆粒以及任何上述物質的代謝物或抗體。一些分析物的具體實例包括鐵蛋白；肌酸激酶MB(CK-MB);地高辛；苯妥英；苯巴比妥；卡馬西平；萬古黴素；慶大黴素；茶鹼；丙戊酸；奎尼定；促黃體生成激素(LH);促卵泡激素(FSH);雌二醇、黃體酮；C-反應蛋白；脂籠蛋白(lipocalins);IgE抗體；細胞因子；維生素B2孩i球蛋白；糖化血紅蛋白(Gly.Hb);氫化可的松；毛地黃毒苷；N-乙醯普魯卡因醯胺(NAPA);普魯卡因醯胺；風滲抗體，例如風滲-IgG和風滲IgM;弓形體病抗體，例如弓形體病IgG(Toxo-IgG)和弓形體病IgM(Toxo-IgM);睪酮；水楊酸鹽；對乙醯氨基酚；B肝病毒表面抗原(HBsAg);7B肝核心抗原的抗體，例如抗-B肝核心抗原IgG和IgM(抗-HBC);人免疫缺陷病毒1和2(HIV1和2);人T-細胞白血病病毒1和2(HTLV);B肝e抗原(HBeAg);B肝e抗原的抗體(抗-HBe);流感病毒；促曱狀腺素(TSH);曱狀腺素(T4);全三碘甲狀腺原氨酸(全T3);游離三碘曱狀腺原氨酸(游離T3);癌胚抗原(CEA);脂蛋白，膽固醇，和甘油三酯；以及cc-胎兒球蛋白(AFP)。濫用藥物和受控物質包括但不限於安非他明；曱基安非他明；巴比妥酸鹽，例如異戊巴比妥、司可巴比妥、戊巴比妥、苯巴比妥和巴比妥；苯二氮雜類，例如利眠寧和安定；大麻素類，例如印度大麻和大麻；古柯鹼；芬太尼；LSD;安眠酮；鴉片製劑，例如海洛因、嗎啡、可待因、二氬嗎啡酮、氫可酮、美沙酮、氧可酮、氧嗎啡酮和鴉片；苯環利定；以及丙氧吩。其它可能的分析物在Everhart等人的U.S.6,436,651和Tom等人的U.S.4,366,241中有所記載。本文所用術語"測試樣品"通常是指被懷疑含有分析物的生物材料。測試樣品可以來自任何生物源，例如生理流體，包括血液、組織液、唾液、眼晶狀體液、腦脊髓液、汗液、尿液、乳液、腹水、粘液、鼻液、痰、滑液、腹膜液、陰道液、月經、羊膜液、精液等等。除了生理流體，也可以使用其它的液體樣品，例如用於實施環境或食品測定的水、食品等。此外，懷疑含有分析物的固體材料也可用作測試樣品。測試樣品可以從生物源獲得後直接使用，或者在預處理後使用以改良樣品的特性。例如預處理可包括用血液製備血漿、稀釋粘稠液等等。預處理方法還包括過濾、沉澱、稀釋、蒸餾、混合、濃縮、幹護L成分的滅活、以及添加試劑、溶菌等等。而且，有益的是，將固體測試樣品改變成液態介質或者釋放分析物。詳細i兌明現在詳細參照本發明的多個不同實施方案，其中的一個或多個實例在以下列出。每個實例都是為了解釋本發明，而對本發明沒有限定作用。事實上，對於本領域技術人員顯而易見的是，在不脫離本發明的範圍或精神的情況下能夠對本發明作出多種修改和變型。例如，作為一種實施方案的一部分而闡述或描述的特徵可用在另一種實施方案上，從而產生又一種實施方案。因而，本發明意在覆蓋這樣的修改和變型，即它8們在所附的權利要求書及其等同方式的範圍內。一般而言，本發明涉及一種用於檢測測試樣品中分析物的存在或數量的側流測定裝置。該裝置採用多個區，其中一個用作測試樣品中分析物是否處於"鉤狀效應"區域內的指示區。基於這種指示，可以選擇針對分析物的濃度或濃度範圍校正所測得信號強度的技術。例如，當確定測試樣品落在"鉤狀效應"區域之外時，可採用劑量響應曲線的一部分來確定分析物濃度。另一方面，當確定測試樣品落在"鉤狀效應"濃度之內時，可採用劑量響應曲線的另一部分來確定分析物濃度。或者，可以只將樣品進行稀釋以重新實施測定。本發明發明者發現這種才企測技術可以筒單、快速、準確地檢測以任何濃度存在的分析物。參見圖1，例如，現在將更詳細地描述可根據本發明製成的一種側流測定裝置20的實施方式。如圖所示，裝置20包含任選地由剛性材料21支撐著的多孔膜23。通常，多孔膜23可以由測試樣品能夠通過的任何材料製成。例如，用來形成多孔膜23的材料可包括但不限於，天然的、合成的、或者天然存在並被合成改性的材料，例如多糖(例如，纖維素材料，如紙和纖維素衍生物，如醋酸纖維素和硝化纖維素)；聚醚碸；聚乙烯；尼龍；聚偏二氟乙烯(PVDF);聚酯；聚丙烯；矽石；無機材料，如去活氧化鋁、硅藻土、MgS04或均勻分散在多孔聚合物基質中的其它無機細碎材料，其中所述聚合物是例如聚氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物和氯乙烯-醋酸乙烯酯共聚物；布，包括天然存在的(例如棉)和合成的(例如尼龍或人造纖維)；多孔凝膠，例如矽膠、瓊脂糖、右旋糖苷和明膠；聚合物膜，例如聚丙烯醯胺等等。在一種特別的實施方式中，所述多孔膜23是由硝化纖維素和/或聚酯碸材料製成的。應當理解，術語"硝化纖維素"是指纖維素的硝酸酯，其可以是單獨的硝化纖維素，或者是硝酸與其它酸，例如具有l-7個碳原子的脂肪族羧酸的混合酯。多孔膜23的尺寸和形狀通常可以有所不同，如本領域技術人員很容易理解的那樣。例如，多孔膜條帶的長度可以是從大約IO到大約100毫米，在一些實施方式中為大約20到大約80毫米，而在一些實施方式中，為大約40到大約60毫米。膜條帶的寬度範圍也可以在大約0.5到大約20毫米，在一些實施方式中，為大約1到大約15毫米，而在一些實施方式中，為大約2到大約10毫米。同樣，膜條帶厚度通常足夠小以允許基於透過的檢測。例如，所述膜條帶的厚度可以小於大約500微米，在一些實施方式中，小於大約250微米，而在一些實施方式中，小於大約150微米。如上所述，載體21承載著多孔膜23。例如，如圖1所示，載體21可以設置成直接鄰接多孔膜23，或者可以在多孔膜23和載體21之間設置一個或更多中間層。無論怎樣，載體21通常都可由能夠承載多孔膜23的任何材料形成。載體21可以由可透光的材料形成，例如透明的或光散射(例如半透明)材料。而且，通常希望載體21是不透液體的，這樣液體流過膜23時不會洩漏通過載體21。合適的載體材料的實例包括但不限於，玻璃；聚合物材料，例如聚苯乙烯，聚丙烯，聚酯(例如，Mylar⑧薄膜)，聚丁二烯，聚氯乙烯，聚醯胺，聚碳酸酯，環氧化物，曱基丙烯酸脂，和聚密胺(polymelamine)等等。為了向多孔膜23提供足夠的結構支撐，通常將載體21選擇成具有特定的最小厚度。同樣，載體21的厚度通常也不會大到反過來影響其光學屬性。因而，例如，載體21的厚度範圍在大約100到大約5000微米，在一些實施方式中，為大約150到大約2000微米，而在一些實施方式中，為大約250到大約1000微米。例如一種適合的膜條帶，厚度大約為125微米，可以購自MilliporeCorp.ofBedford,Massachusetts,名為"SHF180UB25"。正如本領域所公知，多孔膜23可以澆注在載體21上，其中可以將得到的疊層沖切成預期的大小和形狀。或者，所述多孔膜23可以僅利用諸如粘合劑之類的方式層壓到載體21上。在一些實施方式中，是將硝化纖維素或尼龍多孔膜粘貼在Mylar⑧薄膜上。粘合劑用於將多孔膜粘結到Mylar⑧薄膜上，例如壓力敏感型粘合劑。這類層壓結構能夠從MilliporeCorp.ofBedford,Massachusetts買到。還有其它合適的層壓測定裝置結構的實例記載於Durley，III等人的美國專利US5,075,077中，本文出於所有目的而引入它們的全文作為參考。裝置20還可以包含吸收墊28。所述吸收墊28通常4妄收已經遷移通過整個多孔膜23的流體。正如本領域內所公知，吸收墊28可以幫助促進毛細作用和流體流過膜23。為了啟動測試樣品中分析物的檢測，使用者可以直接將測試樣品加到所述多孔膜23的一部分，然後通過多孔膜23樣品沿著圖1中箭頭L所示的方向移動。或者，可以先將測試樣品加到與多孔膜23流體連通的樣品墊(未示出)上。可以用來形成樣品墊的一些適宜材料包括但不限於，硝化纖維素、纖維素、多孔聚乙烯墊和玻璃纖維濾紙。如果需要的話，樣品墊還可以含有以擴散或非擴散的形式附著於其上的一種或多種測定預處理試劑。在圖示的實施方式中，測試樣品從樣品墊(未示出)移動到設置成與該樣品墊一端連通的綴合墊22。綴合墊22由測試樣品能夠通過的材料製成。例如，在一種實施方式中，綴合墊22由玻璃纖維製成。雖然僅示出一個綴合墊22，但是應該理解，本發明中也可以使用多個綴合塾。為了幫助準確地檢測測試樣品中分析物是否存在，可將預定量的檢測探針施加到該裝置20的多個位點處。任何能夠產生在視覺上或通過儀器設備可測得的信號的物質都可用作檢測探針。合適的可檢測物質可包括，例如發光化合物(例如螢光的、磷光的等等)；放射性化合物；可見化合物(例如有色染料或金屬物質，如金)；脂質體或其它含有信號生成物質的嚢泡(vesicles);酶和/或底物等等。其它合適的可檢測物質記載於Jou等人的U.S.5,670,381和Tarcha等人的U.S.5,252,459有色的，則理想的電磁輻射是互補波長的光。例如，藍色的檢測探針強烈地吸收紅光。在一些實施方案中，可檢測物質可以是能產生光學可檢測信號的發光化合物。例如，合適的螢光分子可包括但不限於，螢光素、銪螯合物、藻膽蛋白、羅丹明，以及其衍生物和類似物。其它合適的螢光化合物有半導體納米晶體，通常稱作"量子點"。例如，所述納米晶體可包含通式為CdX的核心，其中X為Se、Te、和S等等。納米晶體還可以由通式為YZ的包被殼所鈍化，其中Y是Cd或者Zn,Z是S或Se。其它合適的半導體納米晶體實例還可以記載於Barbera-Guillem等人的U.S.6,261,779和Dapprich的U.S.6,585,939中,本文出於所有目的而引入它們的全文作為參考。此外，合適的磷光化合物可包括一種或多種金屬的金屬配合物，例如釕、鋨、錸、銥、銠、柏、銦、釔、鉬、鎝、銅、鐵、鉻、鶴、鋅等等。尤其優選的是釕、錸、鋨、鉑和鈀。金屬配合物可包含一個或多個有助於該配合物在含水或非含水環境中溶解的配體。例如，配體的一些合適實例包括但不限於，吡啶、吡。秦、異煙醯胺、咪唑、聯吡啶、三聯吡咬、菲咯啉；聯吡咬並吩嘸；p卜淋、p卜吩以及其衍生物。所述配體可以例如，由烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧酸根、曱醛(carboxaldehyde)、醯胺、氰基、氨基、羥基、亞氨基、羥基羰基、氨基羰基、脒、胍錙、醯脲基、含硫基團、含磷基團、N-羥基_琥珀醯亞胺的羧酸酯所取代。口卜啉和p卜吩金屬配合物具有用亞曱橋偶聯在一起的吡咯基，從而與金屬螯合的內部孔洞形成環狀結構。這些分子中的許多在室溫下在合適溶劑(例如水)中以及無氧環境下表現出強烈的磷光性質。能夠表現出磷光性質的一些合適卟啉配合物包括但不限於，鉑(II)糞卟啉-I和III，釔(II)糞p卜啉，釕糞口卜啉，鋅(II)-糞吟啉-I，及其衍生物等等。類似地，能夠表現出磷光性質的一些合適卟吩配合物包括但不限於，四-meso-氟苯基口卜吩柏(II)和四—meso-氟苯基口卜喻釔(II)。還有其它合適的卟啉和/或卟吩配合物記載於Schmidt等人的U.S.4,614,723;Hendrix的U.S.5,464,741;Soini的U.S.5,518,883;Ewart等人的U.S.5,922,537;Sagner等人的U.S.6,004，530;以及Ponomarev等還可以利用聯吡啶金屬配合物作為磷光化合物。合適的聯吡咬配合物的一些實例包括但不限於，二[(4,4，-曱氧基)-2，2，-聯吡啶]2-[3-(4-曱基-2,2，-聯吡啶-4-基)丙基]-1,3-二氧戊環釕(II);二(2,2，聯吡啶)[4_(丁-1-醛)4，-曱基-2，2，-聯吡啶]釕(II);二(2,2，聯吡啶)[4-(4，—甲基-2,2，-聯吡啶-4，-基)-丁酸]釕(II);三(2,2，聯吡啶)釕(II);(2，2，-聯吡啶)[二-二(1,2-二苯基膦基)亞乙基]2-[3—(4—曱基-2,2，-耳關p比p定—4，—基)丙基]-l,3-二氧戊環鋨(II);二(2,2，-聯吡啶)[4-(4，-曱基-2,2，-聯吡啶)—丁胺]釕(II);二(2,2，聯吡啶)[1_渙-4(4，-曱基-2,2，-聯吡啶-4-基)-丁烷]釕(II);二(2,2，-聯吡啶)馬來醯亞氨基己酸；4-甲基-2,2'-聯吡啶-4'-丁醯胺釕(II)等等。可表現出磷光性質的其它合適的金屬配合物還記載於Richter等人的U.S.6,613,583;Massey等人的U.S.6,468,741;Meade等人的U.S.6,444,423;Massey等人的U.S.6,362,011;Bard等人的U.S.5J31,147;以及Massey等人的U.S.5,591,581中，本文出於所有目的而引入它們的全文作為參考。在一些情況下，發光化合物可能具有較長的發光壽命和較大的"斯託克司頻移"。術語"斯託克司頻移"通常定義為，發光輻射的譜線或波段移向比激發線或波段更長的發射波長。較大的斯託克司頻移使得發光化合物的激發波長保持遠離其發射波長，並且由於激發和發射波長之間的較大差異使得較容易從發射信號中去除反射的激發輻射，因而是人們所希望的。而且，大斯託克司頻移還使得來自樣品中的發光分子和/或蛋白質或膠體的光散射的幹擾降到最低，這些蛋白質或者膠體存在於一些體液(例如血液)中。此外，大斯託克司頻移還使得對用來消除背景幹擾的昂貴、高精度濾光片的需要最小化。例如，在一些實施方案中，發光化合物具有大於大約50納米的斯託克司頻移，在一些實施方案中大於大約100納米，而在一些實施方案中為大約100到大約350納米。例如，具有大斯託克司頻移的示例性焚光化合物包括釤(Sm(III))、鏑(Dy(III))、銪(Eu(III))和鋱(Tb(III))的鑭系螯合物。在螯合物以相當短的波長激發之後所述螯合物可表現出強烈的紅移、窄帶、長壽命發光。通常，由於發色團位於分子中的鑭系元素附近，所以螯合物具有強烈的紫外發射波帶。由發色團激發之後，激發能量可以從激發的發色團傳遞到鑭系元素上。之後是該鑭系元素的螢光發射特性。例如，與螢光素僅為大約28納米相比，銪螯合物的斯託克司頻移在大約250到大約350納米。同樣，與其它熒光標記的大約1到大約IOO納秒的壽命相比，銪螯合物的螢光壽命很長，其壽命大約為100到大約1000微秒。此外，這些螯合物具有窄發射波譜，通常在大約50%的發射處帶寬小於大約10納米。一種合適的銪螯合物是N-(對異硫氰酸根合節基)二亞乙基三胺四乙酸-Eu"。此外，本發明中還可以使用在水溶液或懸液中惰性、穩定並且具有固有螢光的鑭系元素螯合物，從而無需膠束形成試劑，它們通常用來保護在水溶液或懸液中具有有限溶解度並存在猝滅問題的螯合物。這種螯合物的一個實例是4-[2-(4-異硫氰酸根合苯基)乙炔基]-2,6-二([N,N-二(羧甲基)氨基]曱基)吡啶[參見Lovgren,T.等;Clin.Chem.42,1196-1201(1996)]。一些鑭系元素螯合物還表現出特別高的信噪比。例如，一種此螯合物是四配位基P-二酮化物-銪螯合物[參見Yuan,J.和Matsumoto，K.;Anal.Chem.70,596-601(1998)]。除了上述螢光標記之外，適用於本發明的其它標記記載於Mullinax等人的U.S.6,030,840;Davidson的U.S.5,585,279;Singer等人的U.S.5,573,909;Wieder等的U.S.6,242,268;Hemmila等的U.S.5,637，509，可檢測物質，例如如上所述，可以單獨使用或者與顆粒(有時稱為"珠，，或"微珠，，)聯合使用。例如，可以使用天然形成的顆粒，例如胞核、支原體、質粒、質體、哺乳動物細胞(例如紅細胞影)、單細胞微生物(例如細菌)、多糖(例如瓊脂糖)等等。此外，也可以利用合成顆粒。例如，在一種實施方案中，採用了標記有螢光或有色染料的乳膠微粒。儘管本發明中可以使用任何合成顆粒，但所述顆粒典型地是由以下物質構成聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯乙烯丙烯酸-乙烯基三聚物、聚曱基丙烯酸甲酯、聚曱基丙烯酸乙酯、苯乙烯-馬來酐共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯基嘧啶、聚二乙烯笨、聚對苯二曱酸丁二醇酯、丙烯腈、氯乙烯-丙烯酸酯等等，或者其醛、羧基、氨基、羥基、或者醯肼衍生物。其它合適的顆粒記載於Jou等人的U.S.5,670,381，Tarcha等人的U.S.5,252,459和Bodzin等人的美國專利申請2003/139886中，光顆粒的實例包括MolecularProbes,Inc.出售的商品名為"FluoSphere"(Red580/605)和"TransfluoSphere"(543/620)的螢光羧化微球,以及同樣由MolecularProbes,Inc.出售的"TexasRed",和5-、6-羧基四曱基羅丹明。此外，市場上可買到的合適的有色乳膠微粒實例包括Bang'sLaboratory,Inc.出售的羧化乳膠微珠。本發明中也可以採用金屬顆粒(例如金顆粒)。當使用時，顆粒的形狀一般可以變化。例如，在一種特別的實施方案中，所述顆粒是球狀的。然而，應當明白的是本發明也可以構思其它的形狀，例如板狀、棒狀、盤狀、條狀、管狀、不規則形狀等等。此外，顆粒的大小也可以有所不同。例如，顆粒的平均尺寸(例如直徑)範圍可以在大約0.1納米到大約IOO微米，在一些實施方案中，為大約l納米到大約10微米，而在一些實施方案中，為大約10到大約IOO納米。在一些情況下，可能希望以一些方式改變檢測探針使其更容易與分析物結合。在這種情況下，檢測探針可以通過粘附於其上的某種特異性結合成員改性以形成綴合探針(conjugatedprobes)。特異性結合成員通常是指特異性結合對的成員，所述特異性結合對即兩個不同分子，其中一個分子化學和/或物理結合到第二個分子上。例如，免疫活性特異性結合成員可包括抗原、半抗原、適配體(aptamers)、抗體(第一或第二)、以及其複合物(complexes)，包4舌通過重組DNA方法或肽合成法製成的那些。抗體可以是單克隆或多克隆抗體，重組蛋白質或其混合物或片斷，以及抗體和其它特異性結合成員的混合物。這種抗體的製備細節以的特異性結合對包括但;限於生物素和抗l物素蛋白(或其衍生物)，生物素和抗生物素蛋白鏈菌素，碳水化合物和外源凝集素，互補核苷酸序列(包括在DNA雜交測定中用來檢測靶核酸序列的探針和捕獲核酸序列)，互補肽序列包括通過重組方法所形成的那些，效應物和受體分子，激素和激素結合蛋白，輔酶(enzymecofactors)和酶，酶抑制因子和酶等等。此外，特異性結合對可包括是原特異性結合成員的類似物的成員。例如，可以使用分析物的衍生物或片段(即"類似物")，只要其具有至少一個與分析物相同的抗原決定部位。特異性結合成員通常可以利用任何各種公知的技術與檢測探針相連。例如，利用羧基、氨基、醛基、溴乙醯基、碘乙醯基、硫醇基、環氧基和其它反應性或連接官能團，以及殘餘自由基和自由基陽離子，可以實現蛋白質的偶聯反應，從而可以實現特異性結合成員與檢測探針(例如，顆粒)的共價連接。表面官能團還可以作為官能化共聚單體被引入，因為所述檢測探針表面可含有較高表面濃度的極性基團。此外，儘管所述探針通常在合成後進行官能化，例如用聚(苯硫酚)官能化，但所述探針也可以直接與蛋白共價連接而無需進一步改性。例如，在一種實施方案中，綴合的第一步是使用碳二亞胺活化探針表面的羧基。在第二步中，活化的羧酸基團與抗體的氨基反應形成醯胺鍵。所述活化和/或抗體偶聯可以在緩衝液中進行，例如磷酸鹽緩沖液(PBS)(例如，pH值7.2)或2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸(MES)(例如，pH值5.3)。然後得到的檢測探針例如可以與乙醇胺接觸，用以阻斷任何殘餘的活性位點。總之，該過程形成了綴合的檢測探針，其中抗體與所述探針共價連接。除了共價連4妄外，本發明中還可以採用其它的連接技術，例如物理吸附。再參見圖1，多孔膜23限定出了用以進行測定的不同區。例如，多孔膜23限定出了含有第一受體材料的檢測區31。所述第一受體材料固定在多孔膜23上並可以選自與上述特異性結合成員相同的材料，包括，例如，抗原；半抗原；抗體結合蛋白，例如蛋白A,蛋白G，或蛋白A/G;中性抗生物素蛋白(neutravidin)(—種去糖基化(deglysolated)抗生物素蛋白衍生物)，抗生物素蛋白(66000道爾頓的高度陽離子型糖蛋白)，抗生物素蛋白鏈菌素(52800道爾頓的非糖基化蛋白)，或者captavidin(一種硝化抗生物素蛋白衍生物)；第一或第二抗體，及其衍生物或片段。在一些實施方式中，例如，第一受體材料是對測試樣品中的抗原特異性的抗體。所述第一受體材料可以用作針對分析物和綴合檢測探針之間形成的複合物的固定結合位點。具體而言，分析物例如抗體、抗原等，通常具有兩個或多個結合位點(例如，抗原決定部位)。在到達檢測區31後，這些結合位點之一被綴合探針的特異性結合成員所佔據。然而，分析物的自由結合位點可以結合到固定的第一受體材料上。在與所述固定的受體材料結合後，所述複合探針便形成了一種新的三元夾心複合物。測定裝置20還含有位於檢測區31下遊的指示區35。該指示區35含有固定在所述多孔膜23上的第二受體材料。該第二受體材料用作所述綴合檢測探針的固定結合位點。為了在指示區35內實現預期的結合，通常希望所述第二受體材料能夠區分與分析物複合在一起的那些檢測探針和保持未複合狀態那些檢測探針。例如，在一種實施方式中，第二受體材料包括具有至少一個與分析物相同的抗原決定部位的分子，例如分析物分子或其衍生物或片斷(即類似物)，使得其能夠特異性地結合到未與分析物複合的抗體綴合物上。物材;+，但其能;優先與未復口合的綴合探針結合。在」種實施^方式中，例如，第一受體材料可以是單克隆抗體，例如抗CRPIgG!。檢測探針與不同於第一受體材料單克隆抗體的單克隆抗體如抗CRPIgG2綴合。在這種特殊的實施方式中，第二受體材料可以是第二抗體，例如羊抗人IgGF(ab，)2，其Fc片斷已被吸附，因而只與IgG的F吐部分反應。因此，當不存在分析物時，第二抗體能夠與抗CRPIgG2單克隆抗體的自由"Fab"結合域結合。然而，當測試樣品中存在抗原時，其首先與抗CRPIgG2單克隆抗體的"Fab"結合域複合。所述抗原的存在使得"Fab"結合域之後不能與第二抗體結合。通過這種方式，指示區35內的第二抗體能夠優先與未複合的檢測探針結合。儘管檢測區31和指示區35提供了準確的結果，但有時難以確定在實際測試條件下測試樣品中分析物的相對濃度。因此，測定裝置20還可以包括校正區32。在該實施方式中，校正區32形成於多孔膜23上，並位於檢測區31和指示區35的下遊。然而可選擇地，校正區32還可以位於所述檢測區31和/或指示區35的上遊。校正區32具有第三受體材料，其能夠與通過了膜23長度的任何校正探針結合。當使用時，校正探針可以含有與用於檢測探針的可檢測物質相同或不同的可檢測物質。而且，所述校正探針還可以與例如如上所述的特異性結合成員綴合。例如在一種實施方式中，可以使用生物素化的(biotinylated)校正探針。一般來說，校正探針可以通過如下方式進行選擇使其不與檢測區31和指示區35的第一或第二受體材料結合。校正區32的第三受體材料可以與檢測區31或指示區35中使用的受體材料相同或不同。例如，在一種實施方式中，第三受體材料是生物受體材料，例如抗原，半抗原，抗體結合蛋白(例如蛋白A,蛋白G,或蛋白A/G),中性抗生物素蛋白，抗生物素蛋白，抗生物素蛋白鏈菌素，captavidin;第一或第二抗體，或其複合物。還希望採用各種非生物材料作為校正區32中的第三受體材料(例如聚電解質)，例如Song等人的美國專利申請公開No.2003/0124739中所述，本文出於所有的目的而引入其全文作為參考。當使用時，聚電解質可具有淨正電荷或負電荷，以及通常成中性的淨電荷。例如，具有淨正電荷的聚電解質的一些合適實例包括但是不限於，聚賴氨酸(可從Sigma-AldrichChemicalCo.,IncofStLouis,Missouri買到)，聚乙烯亞胺；環氧氯丙烷-官能化多胺和/或多醯氨基胺(polyamidoamines),例如聚(二曱胺-共-環氧氯丙烷)；聚二烯丙基二曱基氯化銨；陽離子纖維素衍生物，例如接枝有季銨水溶性單體的纖維素共聚物或纖維素衍生物；等等。在特定的實施方式中，可以使用CelQuatSC-230M或H-100(可從NationalStarch&Chemical,Inc.得到)，其是含有季銨水溶性單體的纖維素衍生物。此外，具有淨負電荷的聚電解質的一些合適實例包括但是不限於，聚丙烯酸類，例如聚(乙烯-共-甲基丙烯酸，鈉鹽)等等。應該明白的是，也可以使用其它的聚電解質，例如兩性聚電解質(即具有極性和非極性部分)。例如，合適的兩性聚電解質的一些實例包括但是不限於，聚(苯乙烯基-b-N-曱基2-乙烯基吡，定鏡砩化物)和聚(苯乙烯基-b-丙烯酸)，兩者都可以從PolymerSource,IncofDorval,Canada獲得。儘管通常可以使用任何聚電解質，但針對特殊應用選擇的聚電解質根據檢測探針、校正探針、膜等的性質可以有所不同。特別地，聚電解質的分布的電荷使其能夠結合具有相反電荷的物質。因此，例如，具有負電荷的聚^解;通常良好的具備結合帶正電探針的能力。因此，在這種情況下，這些分之間的離子相互作用使得所需要的結合作用發生在校正區32內。然而，儘管離子相互作用主要用於在校正區32內實現期望的結合，但聚電解質也可以與具有相似電荷的探針結合。由於聚電解質設計成與探針結合，故通常希望該聚電解質基本上不擴散地固定在所述多孔膜23的表面上。否則，該探針將不易被使用者檢測到。因此，所述聚電解質可以以這種方式應用到多孔膜23上使其基本上不擴散到多孔膜23的基質中。特別地，所述聚電基質通常與多孔膜23表面上存在的官能團形成離子和/或共價鍵，從而使其保持固定在上面。儘管不是必需的，但所希望在聚電解質和多孔膜23之間形成共價鍵以更加持久地將聚電解質固定在上面。例如，在一種實施方式中，首先將用於形成聚電解質的單體形成溶液，然後直接施加到多孔膜23上。可以採用各種溶劑(例如有機溶劑、水等等)來製備該溶液。一經施加後，就採用加熱、電子束輻射、自由基聚合等方式引發單體的聚合反應。在一些情況下，隨著單體的聚合，它們與多孔膜23的某些官能團形成共價鍵，從而將所得到的聚電解質固定於其上。例如，在一種實施方式中，乙撐亞胺單體可以與一些多孔膜(例如硝化纖維素)表面上存在的羧基形成共價鍵。在另一種實施方式中，聚電解質可以在施加到多孔膜23之前形成。如果需要的話，可以利用有機溶劑、水等等首先將聚電解質形成為溶液。之後，將聚電解質溶液直接施加到多孔膜23上然後乾燥。乾燥之後，所述聚電解質可以與該多孔膜23表面上存在的某些具有與電解質相反的電荷的官能團形成離子鍵。例如，在一個實施方式中，帶正電的聚乙烯亞胺可以與一些多孔膜(例如硝化纖維素)表面上存在的帶負電羧基形成離子鍵。此外，所述聚電解質還可以利用各種公知的技術交聯到所述多孔膜23上。例如，在一些實施方式中，可以使用表氯醇官能化的多胺和/或多醯氨基胺作為可交聯的帶正電聚電解質。這些材料的實例在Keim的美國專利U.S.3,700，623，Keim的U.S.3,772,076以及Keim的U.S.4,537,657中有所記載，本文出於所有的目的引入它們的全文作為參考，並且據說它們由Hercules,Inc.,Wilmington,Del.出售，商標名為KymeneTM。例如，KymeneTM450和2064是表氯醇官能化的多胺和/或多醯氨基胺化合物，其含有可以與一些類型的多孔膜(例如硝化纖維素)上存在的羧基形成共價鍵並且當固化時可與多孔膜的聚合物主鏈交聯的環氧化物環和季銨基團。在一些實施方式中，交聯溫度範圍可以在大約50。C到大約120°C,交聯時間範圍可以是從大約10到大約600秒。儘管上面已經描述了多種用於非擴散地將聚電解質固定在多孔膜23上的技術，但應當明白的是，本發明中也可以採用任何其它的用於非擴散地固定聚電解質化合物的技術。實際上，上述方法僅用於舉例說明可以用於本發明的技術。例如，在一些實施方式中，可以向聚電解質溶液中加入一些可以基本上抑制這種聚電解質擴散到多孔膜23的基質中的成分。檢測區31，指示區35和校正區32可以分別具有任意數量的不同檢測區域，使得使用者可以更好地確定測試樣品中一種或多種分析物的濃度。每個區域可以包含相同的受體材料，或者可以包含不同的受體材料。例如，所述區可以包括兩個或多個不同的區域(如線、點等)。所述區域可以設置成方向基本上垂直於測試樣品流動通過測定裝置20的方向的線條形式。類似地，在一些實施方式中，所述區域可以設置成方向基本上平行於測試樣品流動通過測定裝置20的方向的線條形式。在一些情況下，膜23還可以限定出對照區(未示出)，其向使用者提供測定正確實施的信號。例如，對照區(未示出)可以含有固定的受體材料，該受體材料通常能夠與探針或與固定在探針上的受體材料形成化學和/或物理鍵。這些受體材料的一些實例包括但不限於抗原、半抗原、抗體、蛋白A或蛋白G、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白鏈菌素、第二抗體及它們的複合物。此外，還希望利用各種非生物材料作為對照區受體材料。例如，在一些實施方式中，對照區受體材料還可以包括例如如上所述的聚電解質，其可以結合未捕獲的探針。由於對照區的受體材料僅特異於探針，故無論分析物是否存在都會形成信號。對照區可以位於沿膜23上的任何位置，但優選位於檢測區31和指示區35的下遊。儘管上面描述了多種裝置構造的實施方式，但應當明白，本發明的裝置通常可以具有任何需要的構造，並且無需包含所有的上述元件。例如，在Lambotte等人的U.S.5,395,754;Jou等人的U.S.5,670,381;Malick等人的U.S.6,194,220中描述了各種其它的裝置構造，本文出於所有目的而引入它們的全文作為參考。無論測定裝置20具有何種特殊的構型，指示區35和檢測區31都先後起作用以提高分析物的檢測準確度。參見圖3-4，現在將更加詳細地描述檢測過量濃度的抗原是否存在的方法的一種實施方式。首先，如圖3所示，將含有抗原A的測試樣品加入樣品墊(未示出)並沿"L"方向移動到綴合墊22,其中分析物A與綴合有抗體的檢測探針41以及綴合有生物素(即"生物素化的")的校正探針43混合。在圖3所示的實施方式中，抗原A與綴合的檢測探針41結合形成分析物/綴合探針複合物49。由於有限存在的綴合檢測探針41,一些抗原A保持游離。如圖4所示，游離抗原A和複合物49之後移動到檢測區31,其中固定有抗體51。游離抗原A和複合物49竟爭固定抗體51上的結合位點。任何剩餘的抗原A和複合物49移動到指示區35,其中固定有性質上與抗原A相同的分子A氣然而，由於抗原A和複合物49不具有結合分子A*的位點，它們通常會通過指示區35直到到達吸收墊28。最後，生物素化的校正探針43移動通過檢測區31和指示區35以與固定在校正區32內的抗生物素蛋白鏈菌素(未示出)結合。然後可以檢測在檢測區31和指示區35處捕獲的任何檢測探針41所產生的信號強度。此外，校正區32處的校正探針43所產生的信號強度也可以被檢測到，並通常應當對任何分析物濃度來說都保持恆定。如果需要的話，在一些實施方式中可以使用光學讀取裝置來測量探針強度。該光學讀取裝置的實際配置和結構通常可以有所不同，如本領域技術人員很容易理解的那樣。例如，可以利用的光學檢測技術包括但不限於，發光(例如螢光、磷光等)，吸光度(例如螢光的或非螢光的)，衍射等等。例如，在Kaylor等人的公開號為2003/0119202的美國專利申請中描述了一種適合的反射分光光度計，本文出於所有目的而引入其全文作為參考。在另一種實施方式中，可以使用反射模式分光光度計來檢測顯出焚光的探針的存在。例如，在Song等人的公開號為202004/0043502的美國專利申請中描述了適合的分光光度計和相關的檢測技術，本文出於所有目的而引入其全文作為參考。同樣地，透射模式才企測系統也可以用來檢測所述檢測探針的存在。典型地，光學讀取裝置包含能夠發射電磁輻射的照明源和能夠記錄信號(例如，透射或反射光，發射的螢光或磷光等)的檢測器。照明源可以是本領域中已知的能夠提供電磁輻射的任何設備，所述電磁輻射例如在可見或接近可見範圍內的(例如，紅外或紫外光)光。例如，可以用於本發明的合適照明源包括但不限於，發光二極體(LED),閃光燈，冷陰極螢光燈，電致發光燈等等。所述照明可以是複合的(multiplexed)和/或準直的(collimated)。在一些情況下，所述照明可以是脈衝化的以減小任何背景幹擾。此外，照明可以是連續的或可以組合連續波(CW)和脈衝照明，其中將多個照明光束進行複合(例如，脈沖光束與CW光束複合)，並且在CW光源引起的信號與脈衝光源引起的信號之間允許存在信號區別。例如，在一些實施方式中，用LED(例如，砷鋁化鎵紅光二極體，或磷化鎵綠光二極體，磷砷化鎵綠光二極體，或者銦鎵氮化物紫/藍/紫外(UV)光二級管)作為脈衝照明源。適用於本發明的一種市場上可買到的合適UVLED激發二極體實例是ModelNSHU550E(NichiaCorporation)，它在10毫安(3.5-3.9伏)的正向電流下發出750到1000微瓦的光能形成光束，該光束半高峰全寬為10度，峰值波長為370-375納米，光譜半寬為12納米。在一些情況下，照明源可以向所述測定裝置提供漫射照明。例如，可以僅採用多點光源(例如LED)陣列來提供相對漫射的照明。能夠以相對廉價的方式提供漫射照明的另一種特別符合需要的照明源是電致發光(EL)裝置。EL裝置通常是一種採用夾在電極之間的發光材料(例如磷光體(phosphor)顆粒)的電容結構，至少一個所述電極是透明的以使得光漏出。在所述電極之間施加電壓可在發光材料之中生成變化的電場，其引起發光材料發光。檢測器通常可以是本領域已知的能夠感測信號的任何設備。例如，所述檢測器可以是設置成用於空間辨別的電子成像檢測器。這種電子成像檢測器的一些實例包括高速線性電荷耦合器件(CCD),電荷注入器件(CID),互補金屬氧化物半導體(CMOS)器件等等。這些成像檢測器例如，通常是電子光傳感器的二維陣列，儘管也可以使用線性成像器)，所述線性成像檢測器包括單線的檢測器像素或者光傳感器，例如用於掃描圖像的那些。每個陣列都包括一套已知的唯一位點，其可以稱為"地址，，。在成像檢測器中每個地址都被覆蓋某一區域(例如，通常成方形或矩形的區域)的傳感器所佔據。這種區域通常稱為"像素，，或像素區域。例如，檢測器像素可以是CCD、CID或CMOS傳感器，或者其它可檢測或測量光的任何裝置或傳感器。檢測器像素的大小可以有很大不同，在一些情況下其直徑或長度可以小到0.2微米。在另一些實施方式中，檢測器可以是缺乏空間辨別能力的光傳感器。例如，這種光傳感器的實例可包括光電倍增裝置，光電二極體，例如雪崩光電二極體或矽光電二極體等等。有時矽光電二極體很有優勢，因為其廉價、靈敏、能夠高速工作(上升時間短/高帶寬)，並且容易集成到大多數其它的半導體技術和單片電路中。此外，矽光電二極體物理尺寸小，這使得其很容易嵌入與基於膜的裝置一起使用的系統中。如果使用矽光電二極體，則發射的信號的波長範圍可以在其靈敏度的範圍內，即400到1100納米。一般來說，根據本發明可以實現定性、定量或半定量地檢測分析物的存在或濃度。例如，如上所述，利用檢測區31和指示區35處捕獲的探針所產生的信號強度，以及可選擇的校正區32處的信號強度，可以定量或半定量地測定分析物的量。圖2圖示了利用不同信號強度來測定分析物濃度的可能性。應當明白，信號強度並非必須遵循所示的關係，這種關係僅出於示例性的目的而給出。在這方面，圖2示出了圖3和4中指示區35和檢測區31的檢測探針信號強度的關係。僅出於說明的目的，所以圖2不包括校正信號強度。然而，如上面所討論的那樣，校正信號強度可以用於校正所述結果。例如，可以將Id與Ic之比與分析物濃度的關係繪製成曲線，從而得到上述劑量響應曲線。如圖2所示，當測試樣品中不存在抗原A時，所有的檢測探針41都與指示區35內的抗原AW吉合，並產生處於最大值的指示信號強度("1。")。檢測區31不產生信號。隨著其濃度的提高，抗原開始與綴合探針41形成複合物49。複合物49具有能夠與檢測區31處的抗體51結合的抗原決定部位。這使得指示信號強度"1。"下降，也使得檢測區31處生成檢測信號強度"Id"。指示信號"1。"的強度持續下降，而檢測信號強度"Id"持續增加，直到抗原A的濃度超過存在的綴合檢測探針41的量。這被稱為分析物的"飽和濃度"。在飽和濃度下，游離分析物A和複合物49開始竟爭檢測區31處的結合位點。因此，檢測信號強度"Id"達到其最大值。該值通常已知，因為選擇的檢測探針41的量對應於檢測區31處存在的抗體51的量。隨著抗原濃度的進一步增加，由於檢測區31內游離的未標記抗原A的存在增加，檢測信號強度"Id"開始下降。而且，在分析物飽和濃度或飽和濃度附近，理論上不會檢測到指示信號強度，因為所有的檢測探針41都與分析物A複合並接著與檢測區31內的抗體51結合。然而，實際上，少量的檢測探針41會與指示區35內的抗原A"吉合，因而仍然會產生較低的指示信號強度"I。"。根據本發明，可以選擇性地採用圖2的劑量響應曲線的不同區域，以將測得的檢測信號強度轉換成分析物濃度。例如，曲線的"區域A"限定在分析物濃度"A。"和"A,之間。在該區域中，檢測信號強度與分析物濃度幾乎呈線性關係。因此，圖2的"區域A"可用於將測得的檢測信號強度"Id"準確地轉換為實際的分析物濃度。同樣，"區域C"限定在分析物濃度"A2"和"A3"之間定義的曲線。同樣，在該區域，檢測信號強度與分析物濃度幾乎呈線性關係。因此，圖2的"區域C"可用於將測得的檢測信號強度"Id"準確地轉換為實際的分析物濃度。限定在分析物濃度"A!"和"A2"之間的檢測曲線的"區域B"相對恆定，故其有時難以獲得與分析物濃度之間的準確關係。因此，如果需要定量結果，使用者可以稀釋之後的測試樣品然後重新進行測定。或者，可以單獨使用所述指示信號強度或者結合檢測信號強度來提供定量結果。如果只需要半定量結果，則可以只說分析物濃度落在分析物"A!"和"A2"濃度範圍之間。為了確定圖2的劑量響應曲線的哪個區域最適於特定的測試樣品，通常希望首先確定分析物濃度是否處於"鉤狀效應"區域內。在這種情況下，可以將測得的信號強度"1。"與針對已知飽和濃度的分析物預測定的參比標準相比較。所述"參比標準"可以是單一的強度值，或者其可以包括一個取值範圍，據信該範圍對應於在一定誤差餘地內的飽和濃度。該取值範圍上限和下限可以基於對相同的已知分析物飽和濃度進行多次測試時指示信號強度的變化程度選擇。例如，圖2中參比標準可以限定在強度值"ir和"I2"之間，其分別對應於分析物濃度"A,和"A2，，。23說明書第21/29頁大於參比標準(例如大於上限"ir)的測得的信號強度"1。"可用作分析物濃度在"鉤狀效應"區域之外的指示，而等於或小於參比標準(例如小於上限"ir)的測得的信號強度"1。"可用作分析物濃度在"鉤狀效應"區域之內的指示。例如，參見圖5,表示了用於測定分析物濃度是否處於"鉤狀效應，，區域內的方法100的一種實施方式。採用數種變量作為該方法100中的輸入值，包括測得的檢測信號強度"Id",測得的指示信號"1。"，以及參比標準的上限I!和下限l2。方法100的第一步是確定所測得的信號強度"i。"是否大於上限"ir。如果這樣，則分析物濃度處於"鉤狀效應"區之外，可用劑量響應曲線的"區域A"來將測得的檢測信號強度"Id"轉換成分析物濃度。如果所測得的信號強度"1。"小於上限"I!",則方法100的下一步是確定分析物的濃度是否在飽和濃度或其附近，或者其是否大大高於飽和濃度。這樣，方法100確定所測得的信號強度"1。"是否小於下限"12",如果這樣，則可用劑量響應曲線的"區域C"來將測得的檢測信號強度"Id"轉換成分析物濃度。如果所測得的信號強度"i。"大於下限"i2，，而小於上限"ir(即與參比標準相同)，則方法100的最後一步是確定是否需要半定量還是定量的結果。如果需要定量結果，則方法100指示使用者稀釋之後的測試樣品然後重新進行測定。或者，還可以單獨使用所測得的指示信號強度"1。"，或者與檢測信號強度"Id"結合使用來提供定量的結果。例如，如圖2所示，指示曲線在檢測信號曲線的"區域B，，相對呈線性。因此，在該區域內，指示曲線可提供準確的檢測結果。而且，如果只需要半定量的結果，則方法100僅表明分析物濃度落在圖2所示的分析物濃度"Ar和"A2"範圍內。如上面所述的校正方法可以自動和/或手動進4亍。例如，可以任選地採用微處理器來自動選擇所需要的校正技術並將檢測器的測量值轉換成表明分析物濃度的定量或半定量結果。所述微處理器可包括存儲能力，以使使用者能夠重新調用最後的幾個結果。本領域技術人員應當知道，可以採用任何合適的計算機可讀存儲裝置，例如RAM,ROM,EPROM,EEPROM,快閃記憶體卡，數字視頻光碟，Bernoulli磁帶等等。如果需要的話，可以將結果利用液晶(LCD)或LED顯示器傳送給使用者。參考下面的實施例可以更好地理解本發明。實施例1證實了製備側流測定裝置的可行性。將長度大約30釐米的硝化纖維素多孔膜(HF120,購自Milhpore，Inc.)層壓到載體卡片上。將C反應蛋白的單克隆抗體固定在該多孔膜上形成檢測區。所述抗體來自BioPacific，Inc.(Catalog#A58040136P)，濃度為1毫克每毫升。將CRP抗原固定在多孔膜上形成指示區。所述抗原購自BiogenesisInc.ofKingston,NewHampshire，濃度為2.78毫克每毫升。將Goldline(—種聚賴氨酸溶液，購自BritishBiocellInternational)在所述膜上製成條帶形成對照區。指示區位於檢測區和對照區之間。將纖維素芯吸墊(MilliporeCo.)與所述膜的一端(靠近對照區)一起進行層壓。然後將膜樣品在37。C的溫度下乾燥1小時。通過將180微升綴合有CRP單克隆抗體(BiosPacific，Inc.,Catalog#A58110228P)的金顆粒，375微升濕糖水溶液(20%)和945微升水混合形成顆粒懸浮液。所述金顆粒的顆粒尺寸為40納米，光密度為56,購自BritishBiocellInternational。將所述懸液加載到25釐米長的玻璃纖維綴合墊(MilliporeCo.)上。之後在37匸乾燥所述玻璃纖維墊2小時製成綴合墊。接著將該綴合墊層壓到所述多孔膜的另一端(靠近檢測區)。將纖維素芯吸墊(MilliporeCo.)樣品塾進一步層壓到所述綴合墊上。將層壓後的整個卡片切割成4毫米寬的側流測定裝置。實施例2如實施例1那樣製備側流裝置，只不過用2.23毫克每毫升的羊抗鼠IgG(Fc)來製備對照區。.實施例3證實了製備側流測定裝置的可行性。將長度大約30釐米的硝化纖維素多孔膜(HF120,購自Millipore,Inc.)層壓到載體卡片上。將在0.1%海藻糖水溶液中的C反應蛋白的單克隆抗體(BioPacific，Inc.,Catalog#A58040136P)固定在該多孔膜上形成檢測區。將CRP抗原固定在多孔膜上形成指示區。所述抗原購自BiogenesisInc.ofKingston,NewHampshire,濃度為2.78毫克每毫升。將羊抗石威性磷酸酶(2.5毫克每毫升,購自FitzgeraldIndustriesInternational,Inc.ofConcord,Massachusetts)在所述膜上製成條帶形成校正區。指示區位於檢測區和校正區之間。將纖維素芯吸墊(MilliporeCo.)與所述膜的一端(靠近對照區)一起進行層壓。然後將膜樣品在37。C的溫度下乾燥1小時。將160微升綴合有兔抗羊IgG的金顆粒，160微升綴合有CRP單克隆抗體(BiosPadfic,Inc.,Catalog#A58110228P)的金顆粒，375微升蔗糖水溶液(20%)和785微升水混合形成顆粒懸浮液。所述綴合有兔抗羊IgG的金顆粒的顆粒尺寸為10納米，購自Sigma-AldrichInc.ofSt.Louis,Missouri。所述綴合有CRP單克隆抗體的金顆粒的顆粒尺寸為40糹內米，購自BritishBiocellInternational將所述懸浮液加載到20釐米長的玻璃纖維綴合墊(Millipore,Co.)上。之後在37。C乾燥所述玻璃纖維墊2小時製成綴合墊。接著將該綴合墊層壓到所述多孔膜的另一端(靠近檢測區)。將纖維素芯吸墊(MilliporeCo.)樣品墊進一步層壓到所述綴合墊上。將層壓後的整個卡片切割成4毫米寬的側流測定裝置。實施例4證實了利用實施例1的側流測定裝置檢測分析物存在和數量的可能性。測試了十一個(11)測試裝置。將120微升在TBS緩沖液中的C反應蛋白施加到各裝置的樣品墊上。測試不同濃度的CRP,即0，10,50,200，500,1000,2000,5000，20000，100000，和500000納克每毫升。使所知裝置展開30分鐘。用基於反射的分光光度計檢測各裝置各區的顏色強度。各區的強度匯總於表l中。表l:針對CRP濃度的強度tableseeoriginaldocumentpage26圖6中繪製了強度與CRP濃度的關係曲線。如圖所示，指示區能夠預測CRP濃度是否處於"鉤狀效應"區域內。實施例5證實了利用實施例2的側流測定裝置檢測分析物存在和數量的可能性。測試了十一個(11)測試裝置。將120微升在TBS緩沖液中的C反應蛋白施加到各裝置的樣品墊上。測試不同濃度的CRP,即0，10,50,200，500，1000,2000,5000,20000,100000，和500000納克每毫升。使所述裝置展開30分鐘。用基於反射的分光光度計檢測各裝置各區的顏色強度。各區的強度匯總在表2中。表2:針對CRP濃度的強度CRP(ng/ml)檢測區指示區對照區0100.349117.180107.96210112.441116.806108.13150115.145113.111107.717200117.522108.417雨.247500119.923109.125110.5211000122.628110.936119.5012000121.988110.253124.6175000117.599107.891125.06220000112.510106.006123細100000107.082104.421121.370500000102.879101.487117.520圖7中繪製了強度與CRP濃度的關係曲線。如圖所示，指示區能夠預測CRP濃度是否處於"鉤狀效應"區域內。實施例6證實了利用實施例3的側流測定裝置檢測分析物存在和數量的可能性。測試了十一個(11)測試裝置。將120微升在TBS緩衝液中的C反應蛋白施加到各裝置的樣品墊上。測試不同濃度的CRP，即O,10,50,200,500,1000,2000,5000,20000，100000,和500000納克每毫升。使所述裝置展開30分鐘。用基於反射的分光光度計檢測各裝置各區的顏色強度。各區的強度匯總在表3中。表3:針對CRP濃度的強度_tableseeoriginaldocumentpage28圖8中繪製了強度與CRP濃度的關係曲線。如圖所示，指示區能夠預測CRP濃度是否處於"鉤狀效應"區域內。實施例7證實了改變測定裝置檢測靈敏度的可行性。首先通過將綴合有CRP單克隆抗體(BiosPacifk,Inc.,Catalog#A58110228P)的金顆粒稀釋在2毫摩爾Borax(pH7.2)中至光密度為10的濃度，形成顆粒懸浮液。所述金顆粒的顆粒尺寸為40納米。利用"Kinematic1600"試劑分配才莫塊(KinematicAutomation,Inc.ofTwainHarte,California)將該懸液以25微升每秒(5pi/cm,5cm/s)的速度噴到34毫米長的玻璃纖維綴合塾(Millipore,Co.)上。使該玻璃纖維墊在室溫和相對溼度小於20%的條件下乾燥過夜。然後將該綴合點層壓到長度大約30釐米的硝化纖維素多孔膜(HF180，購自Millipore,Inc.)的一端。將C反應蛋白的單克隆抗體(BioPacific，Inc.,Catalog#A58110228P)在PBS緩衝液中稀釋到0.2到0.3毫克每毫升的濃度。CRP抗原也購自BiogenesisInc.ofKingston,NewHampshire,並在TBS緩衝液中稀釋到3.4毫克每毫升的濃度。利用"Kinematic1600"試劑分配才莫塊(KinematicAutomation,Inc.ofTwainHarte,California)將試劑以5微升每秒(1pL/cm,5cm/s)的速度在多孔膜上製成條帶。固定的單克隆抗體在離所述膜一邊10毫米的位置處形成檢測區。將固定的CRP抗原在離所述膜另一邊10毫米以及檢測區下遊5毫米的位置處形成指示區。將CF6纖維素/玻璃芯吸墊(WhatmanpicofMiddlesex,UnitedKingdom)切割成20毫米的寬度並層壓到硝化纖維素膜上。然後將層壓後的卡片切割成4毫米寬的完全側流浸漬條。將得到的測定裝置放在殼體(可容納14條浸漬條)中並利用活塞式移液管(positivedisplacementpipette)用1微升校正後的CRP血清(0到480孩i克每毫升)(購自KamiyaBiomedicalCo.ofSeattle,Washington)手工畫條。將該血清條帶放在離GF33墊邊緣12mm的位點處。在血清應用位點上遊施加110微升PBS緩衝液(pH7.2，含2。/。的Tween20)以沿著測試條帶洗滌或"追趕，，血清，從而測試該測定裝置。使所述裝置展開30分鐘。用0-11範圍的可見標尺("Rann標尺")測定各裝置各區的顏色強度，其中0表示沒有顏色，11表示最強烈的顏色。各區的強度匯總於表4和5中。表4:0.2mg/ml檢測抗體濃度的區中的強度tableseeoriginaldocumentpage29表5:0.3mg/ml檢測抗體濃度的區中的強度tableseeoriginaldocumentpage30如上面所表示，用於檢測區的抗體濃度可以有所不同以提供不同的檢測靈敏度。通過這種方式，可以選擇性地控制抗體濃度以生成處於據信能更好地對應於測試條件的靈敏度範圍內的劑量響應曲線。例如，可以調整抗體濃度，使在較高的分析物濃度下存在劑量響應曲線的線性區域。實施例8證實了改變測定裝置檢測靈敏度的可行性。首先通過將綴合有CRP單克隆抗體(BiosPacific,Inc.,Catalog#A58110228P)的金顆粒在2毫摩爾Borax(pH7.2)中稀釋至光密度為5、8、10、12、15、18或20的濃度，形成顆粒懸浮液。所述金顆粒的顆粒尺寸為40納米。利用"Kinematic1600"{式劑分酉己才莫塊(KinematicAutomation,Inc.ofTwainHarte，California)將該懸浮液以25微升每秒(5j^l/cm，5cm/s)的速度噴到34毫米長的玻璃纖維綴合墊(Millipore，Co.)上。使該玻璃纖維墊在室溫和相對溼度小於20%的條件下乾燥過夜。然後將該綴合點層壓到長度大約30釐米的硝化纖維素多孔膜(HF180,購自Millipore,Inc.)的一端。將C反應蛋白的單克隆抗體(BioPacific,Inc.，Catalog#A58110228P)在PBS緩衝液中稀釋到0.1毫克每毫升的濃度。CRP4元原也購自BiogenesisInc.ofKingston,NewHampshire,並在TBS緩沖液中稀釋到3.4毫克每毫升的濃度。利用"Kinematic1600"i式齊'J分酉己才莫塊(KinematicAutomation,Inc.ofTwainHarte,California)將試劑以5微升每秒(1pL/cm，5cm/s)的速度在多孔膜上製成條帶。固定的單克隆抗體在離所述膜一邊10毫米的位置處形成檢測區。將固定的CRP抗原在離所述膜另一邊10毫米以及檢測區下遊5毫米的位置處形成指示區。將CF6纖維素/玻璃芯吸墊(WhatmanpicofMiddlesex,UnitedKingdom)切割成20毫米的寬度並層壓到硝化纖維素膜上。然後將層壓後的卡片切割成4毫米寬的完全側流浸漬條。將得到的測定裝置放在殼體(可容納14條浸漬條)中並利用活塞式移液管(positivedisplacementpipette)用1微升校正後的CRP血清(0到480孩i克每毫升)(購自KamiyaBiomedicalCo.ofSeattle,Washington)手工畫條。將該血清條帶放在離GF33墊邊緣12mm的位點處。在血清應用位點上遊施加110微升PBS緩衝液(pH7.2,含2。/。的Tween20)以沿著測試條帶洗滌或"追趕，，血清，從而測試該測定裝置。使所述裝置展開30分鐘。用上述"Rann"標尺測定各裝置各區的顏色強度。結果如圖9-10中所示。如圖9所示，通過改變綴合顆粒濃度(如光密度所反映的)可以改變抗體響應曲線("檢測區")和信號強度(例如"Rann"值)。類似地，如圖10所示，通過改變綴合顆粒濃度也可以改變CRP響應曲線("指示區")和信號強度。因此，如上所述，可以選擇性地控制綴合顆粒的濃度以生成處於據信能更好地對應於測試條件的靈敏度範圍內的劑量響應曲線。實施例9證實了改變測定裝置檢測靈敏度的可行性。製備用於首次試驗的半條帶(half-stick)測定裝置。通過將抗體儲備液稀釋在PBS0/0中製備兩種CRP單克隆抗體(BiosPacific,Inc.,Catalog#A58110228P)溶液，濃度為0.1和0.5毫克每毫升。然後將每種溶液在長度大約為30釐米的單個硝化纖維素膜(HF120,購自Millipore,Inc.)上製成條帶。利用"Kinematic1600"試劑分酉己才莫塊(KinematicAutomation,Inc.ofTwainHarte，California)將所述溶液以5微升每秒(1pL/cm的分配速率，5cm/秒的床速)的速度製成條帶。將一種CRP溶液(BiogenesisInc.ofKingston,NewHampshire)在PBS0/0(pH7.2)中稀釋到0.5mg/mL，也利用Kinematic1600在卡片上製成條帶。使該卡片在37°C下乾燥1小時，並與20毫米寬的纖維素纖維芯吸墊(MilliporeCFSP203000)—起層壓。利用"Kinematic2360，，+刀割才幾(KinematicAutomation,Inc.ofTwainHarte，California)將該卡片切割成4毫米寬的條，從而得到4毫米寬的半側流浸漬條("半條帶")。測試時，使用不同尺寸預先綴合有CRP單克隆抗體(BioPacific,Inc.,Catalog#A58110228P)的金顆粒懸浮液。本實施例中研究的尺寸是40和60納米直徑的金顆粒綴合物。將該顆粒綴合物在TBS1/0/1中稀釋到預期的測試光密度(OD)，即OD1和OD2.5。將來自Scipac的CRP標準品在PBS0/0中稀釋到0-40微克每毫升的濃度範圍，使得一旦與等體積的金綴合物混合，它們將形成0到20微克每毫升的CRP測試範圍。將20微升該CRP溶液和20微升金綴合物懸浮液加入96孔孔板中。然後將半條帶樣品放在板孔中，使測試進行15分鐘，之後對得到的測試線進行視覺評分。利用範圍在0(測試線上無可見顏色)到11(測試線上非常強烈的顏色)的"Rann標尺"對各裝置各區的顏色強度進行視覺評分。結果示於圖11-15中。例如，如圖11-12所示，在0.2到2(M鼓克每毫升的CRP濃度下，檢測區0.5mg/ml的抗體濃度造成在指示區要麼沒有信號，要麼信號很微弱(即Rann=l)。抗體濃度降低到0.1mg/ml(圖13-14)，增加了CRP線("指示區，，)信號強度，並得到較淺的CRP曲線。進一步，通過將金綴合物濃度提高到光密度2.5,則抗體和CRP線的信號強度均增加(圖15)。該CRP線也在抗體信號達到其峰值(例如"鉤狀效應"點)的位點附近開始下降。儘管已經就本發明的具體實施方式詳細描述了本發明，但本領域技術人員應該理解，在領會上述內容之後，很容易構思這些實施方式的替換形式、變型方式和等同方式。因此，本發明的範圍應當由所附權利要求書及其等同方式來確定。權利要求1.一種用於檢測測試樣品中分析物的存在或數量的側流測定裝置，該側流測定裝置包括與綴合檢測探針連通的多孔膜，其中所述分析物能夠與該綴合檢測探針形成複合物，所述多孔膜限定出檢測區，該檢測區內固定有第一受體材料，該第一受體材料設計成優先與所述分析物結合，而無論分析物是否與綴合檢測探針複合，所述檢測區能夠產生可測量的檢測信號；以及指示區，該指示區位於所述檢測區下遊並且該指示區內固定有第二受體材料，該第二受體材料設計成優先與未複合的綴合檢測探針結合，所述指示區能夠產生可測量的指示信號；其中所述可測量的指示信號的強度可與參比標準相比較以確定測試樣品中的分析物濃度是否處於構狀效應區域內，所述參比標準表示在處於分析物的飽和濃度或飽和濃度附近時指示信號的強度或強度範圍。2.權利要求1的側流測定裝置，其中所述第二受體材料具有至少一個與分析物相同的抗原決定部位。3.權利要求1或2的側流測定裝置，其中所迷第二受體材料包括抗原或其類似物。4.權利要求3的側流測定裝置，其中所述分析物是C反應蛋白。5.權利要求1到4中任意一項的側流測定裝置，其中所述第一受體材料包括抗體或其類似物。6.上述權利要求中任何一項的側流測定裝置，其中所述多孔膜進一步限定出能夠產生校正信號的校正區。7.上述權利要求中任何一項的側流測定裝置，其中所述分析物的濃度至少部分決定於所述檢測信號的強度。8.上述權利要求中任何一項的側流測定裝置，其中所述分析物的濃度至少部分決定於所述指示信號的強度。9.一種定量或半定量地;險測測試4f品中的分析物的方法，該方法包括i)使測試樣品與側流裝置的多孔膜接觸，所述多孔膜與綴合檢測探針連通，該多孔膜還進一步限定出檢測區和位於檢測區下遊的指示區；il)測量檢測區產生的檢測信號強度以及指示區產生的指示信號強度；以及iii)將測得的指示信號強度與參比標準相比較，所述參比標準表示在處於分析物的飽和濃度或飽和濃度附近時指示信號的強度或強度範圍。10.權利要求9的方法，進一步包括基於測得的指示信號強度是否小於、大於或等於參比標準而選擇用於將測得的檢測信號強度轉換成分析物濃度或濃度範圍的技術。11.權利要求10的方法，進一步包括對已知的分析物濃度繪製檢測信號強度而製成劑量響應曲線。12.權利要求11的方法，其中當所測得的指示信號強度大於參比標準時，利用所述劑量響應曲線的第一區域確定所述測試樣品中分析物的濃度。13.權利要求12的方法，其中在所述第一區域內所述劑量響應曲線的檢測信號強度與分析物濃度大致呈線性關係。14.權利要求11的方法，其中當所測得的指示信號強度小於參比標準時，利用所述劑量響應曲線的第二區域確定所述測試樣品中分析物的濃度。15.權利要求14的方法，其中在所述第二區域內所述劑量響應曲線的檢測信號強度與分析物濃度大致呈線性關係。16.權利要求11的方法，其中當所測得的指示信號強度等於參比標準時，採用所述劑量響應曲線的第三區域，該第三區域提供所述分析物濃度所在的範圍。17.權利要求16的方法，其中在所述第三區域內所述指示信號強度與分析物濃度大致呈線性關係。18.權利要求11到17中任何一項的方法，進一步包括選擇性地控制用於形成劑量響應曲線的受體材料和/或綴合檢測探針的濃度，以幫助獲得所述劑量響應曲線的一定靈敏度範圍。19.權利要求11到18中任何一項的方法，其中還使用校正信號強度來形成劑量響應曲線。20.權利要求10的方法，其中當測得的指示信號強度大約等於參比標準時，將第二測試樣品稀釋以與所述多孔膜接觸。全文摘要本發明公開了一種用於檢測測試樣品中分析物的存在或數量的側流測定裝置。該裝置採用多個區，其中一個用作測試樣品中分析物是否處於「鉤狀效應」區域內的指示區。基於這種指示，可以選擇針對分析物的濃度或濃度範圍校正所測得信號強度的技術。例如，當確定測試樣品落在「鉤狀效應」區域之外時，可採用劑量響應曲線的一部分來確定分析物濃度。另一方面，當確定測試樣品落在「鉤狀效應」濃度之內時，可採用劑量響應曲線的另一部分來確定分析物濃度。或者，可以只將樣品進行稀釋以重新實施測定。本發明發明者發現這種檢測技術可以簡單、快速、準確地檢測以任何濃度存在的分析物。文檔編號G01N33/543GK101326440SQ200680014726公開日2008年12月17日申請日期2006年2月28日優先權日2005年4月29日發明者X·宋,保羅·克裡斯多佛申請人:金伯利-克拉克環球有限公司