普洱茶在消除甲醛生物危害中的應用的製作方法

2023-11-04 04:55:27

專利名稱：普洱茶在消除甲醛生物危害中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及普洱茶的用途，更具體地說，本發明涉及普洱茶在消除甲醛生物危害 中的應用。
背景技術：
甲醛(formaldehyde，FA)，是一種無色的刺激性氣體。由於甲醛在人類生產、生活 中極為廣泛的應用，甲醛已成為人類經常遇到的有害化學物質之一。甲醛生產行業、木材加 工行業、醫院系統、食品加工行業，甚至普通家庭裝修，都有接觸到高濃度甲醛的危險。因 而，甲醛的汙染及其對人類的生物毒性作用越來越受到人們的廣泛關注，如何防止甲醛的 生物危害也已成為人們廣泛關注的話題。2004 年 6 月世界衛生組織的下屬機構 IARC(The International Agency for Research on Cancer)發表了專題論文，公布了一些致癌劑對人類健康危害的最新研究成 果已有的研究提供了充分的證據表明甲醛可以導致人類和動物的癌症，尤其是直接吸入 甲醛的部位(如鼻腔)的癌症。有很強的證據表明甲醛可以導致白血病，但尚需要進一步 充分的研究來加以證實。研究表明，甲醛具有廣泛的毒性，可以導致呼吸道和眼部刺激作用，組織器官的氧 化損傷。同時，甲醛作用可導致細胞內形成高氧化環境，導致細胞內穀胱甘肽(GSH)，超氧化 物歧化酶(SOD)的大量消耗，導致細胞損傷或死亡。甲醛的致癌作用最終來源於它的遺傳 毒性，甲醛作用可以導致DNA —蛋白質交聯、DNA-DNA交聯、DNA鏈的斷裂、染色體的畸變、姐 妹染色單體的交換等等，進而導致癌症的發生。因此，研發防治甲醛生物危害的保健品，對防止甲醛所致的生物毒性，降低甲醛所 致癌症的發病率，有重要的社會和經濟價值。普洱茶是是以雲南原產地的大葉種曬青茶加工而成，是人們常用的茶飲料。普洱 茶具有性溫味香，解油膩牛羊毒，苦澀逐痰，刮腸通洩等功效。現代生物醫學研究也表明，普 洱茶具有降血糖、降血脂、降血壓、抗炎等功效，使普洱茶成為人們喜愛的保健飲品。但迄今為止，普洱茶用於消除甲醛的生物危害尚未發現相關資料報導。

發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種普洱茶的新用途，即普洱茶在 消除甲醛生物危害中的應用。本發明的目的通過下述技術方案予以實現。*除非另有說明，本發明中所採用的百分數均為質量百分數。本發明進行了下述深入的試驗研究A.本發明利用野生型的小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryo fibroblast，MEF)測 試甲醛對正常細胞的殺傷作用，同時對普洱茶水提取物對正常細胞的保護作用，從而揭示 普洱茶水提取物對甲醛生物危害的防治功效。
實驗證實，不加普洱茶水提取物的細胞在100 300 μ mol/L甲醛處理後大量死 亡；預先加入普洱茶水提取物進行保護的細胞，在同樣濃度甲醛處理後只有少量細胞死亡。 表明普洱茶水提取物有效地預防了甲醛引起的正常細胞死亡。B.本發明利用Armexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測甲醛處理後細胞的凋亡 及普洱茶的保護作用。檢測所依據的原理如下Armexin V選擇性結合磷酯醯絲氨酸。磷酯醯絲氨酸主 要分布在細胞膜內側，即與細胞漿相鄰的一側。在細胞發生凋亡的早期，不同類型的細胞都 會把磷酯醯絲氨酸外翻到細胞表面，即細胞膜外側。磷酯醯絲氨酸暴露到細胞表面後會促 進凝血和炎症反應。而Armexin V和外翻到細胞表面的磷酯醯絲氨酸結合後可以阻斷磷酯 醯絲氨酸的促凝血和促炎症反應活性。用帶有綠色螢光的螢光探針FITC標記的Armexin V，即Armexin V-FITC，就可以用流式細胞儀或螢光顯微鏡非常簡單而直接地檢測到磷酯醯 絲氨酸的外翻這一細胞凋亡的重要特徵。用Armexin V-FITC和碘化丙啶染色後，正常的活 細胞不被AnnexinV-FITC和碘化丙啶染色；凋亡早期的細胞僅被Annexin V-FITC染色，碘 化丙啶染色呈陰性；壞死細胞和凋亡晚期的細胞可以同時被ArmexinV-FITC和碘化丙啶染 色。C.檢測方法採用以下步驟1.甲醛處理結束後，吸除細胞培養液，加入PBS洗滌一次；2.加入 195 μ 1 Annexin V-FITC 結合液；3.加入5μ 1 Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫O0_25°C )避光孵育10分鐘；4.吸除溶液，加入 190 μ 1 Annexin V-FITC 結合液。5.加入10 μ 1碘化丙啶染色液，輕輕混勻，室溫避光放置。隨即在螢光顯微鏡下觀察，AnnexinV-FITC為綠色螢光，碘化丙啶為紅色螢光。細胞凋亡檢測表明，90%以上的細胞在甲醛處理1小時後Armexin V染色為陽性， 表明甲醛的生物毒性啟動了細胞凋亡程序；而預先加入普洱茶水提取物進行保護的細胞， 在甲醛處理1小時後只有約20% ArmexinV染色為陽性，表明普洱茶對甲醛誘導的細胞凋亡 有很好的保護作用。因此，本發明的試驗研究表明，普洱茶對甲醛導致的細胞毒性有很好的保護作用， 從而預示著普洱茶在消除甲醛生物危害方面有很好的應用前景。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果1.本發明涉及保健醫學、毒物化學、腫瘤學、細胞生物學領域的研究與應用，首次提 出應用普洱茶防治甲醛所致的生物危害，為普洱茶用於防治甲醛生物危害提供了科學依據。2.普洱茶可以防止暴露於甲醛後導致的正常細胞死亡，避免甲醛導致的生物毒 性。將常見的普洱茶飲料，用於研發防治甲醛生物危害的保健品，進而解決甲醛工業、裝修 行業、家庭居住環境等甲醛汙染導致生物危害的防治問題。3.提供了經濟實惠、簡單易行的甲醛生物危害的防治方法，揭示了普洱茶的新用 途，開拓了一個新的應用領域。


圖1為微分幹涉顯微成像(DIC)觀察到細胞形態。
圖2為螢光顯微成像觀察到的細胞凋亡染色。圖3為螢光顯微成像觀察到的細胞凋亡染色。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明作進一步詳細說明。應該理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，並不用 於限定本發明。需要特別說明的是:圖1顯示了普洱茶水提取物對甲醛導致細胞毒性的保護作用。圖中A為正常 細胞經200ymol/L甲醛處理後3小時的細胞形態，可以見到大部分細胞都已脫落死亡， 少數殘留的細胞也已變圓待脫落；圖中B為預先加入普洱茶水提取物進行保護的細胞經 200ymol/L甲醛處理後3小時的細胞形態，可以見到大部分細胞形態正常。圖2顯示了正常細胞經200 μ mol/L甲醛處理後1小時細胞凋亡染色，殘存的細胞 已進入晚期凋亡。圖中A為微分幹涉成像(DIC)顯微技術觀察細胞的形態變化，可見少量 殘存的細胞；圖中B為Armexin V-FITC染色，細胞膜標記上綠色螢光的細胞為凋亡陽性細 胞；圖中C為碘化丙啶染色，標記上紅色螢光的細胞為進入晚期凋亡的細胞。圖中D為A， B，C疊加的合成圖像。圖3顯示了預先加入普洱茶水提取物進行保護的細胞經200 μ mol/L甲醛處理 後1小時細胞凋亡染色，少數細胞進入凋亡早期，少數進入凋亡晚期，大部分細胞不發生 凋亡，證明了普洱茶水提取物對甲醛誘導細胞凋亡的保護作用。圖中A為微分幹涉成像 (DIC)顯微技術觀察細胞的形態變化，可見大量正常細胞和少數變圓待脫落細胞；圖中B為 AnnexinV-FITC染色，細胞膜標記上綠色螢光的細胞為凋亡陽性細胞，少數隻標記上綠色熒 光的細胞為凋亡早期細胞；圖中C為PI染色，少數標記上紅色螢光的細胞為進入晚期凋亡 的細胞。圖中D為A，B，C疊加的合成圖像。實施例1接種IxIO5-IxIO6個小鼠胚胎成纖維細胞到六孔細胞培養板中的玻璃載玻片上， 使用DMEM+10% FBS培養基，在37°C，5% C02，3% 02培養箱中培養12 M小時後，加入終 濃度為0. 05mg/ml的普洱茶共培養6小時，空白對照不加普洱茶共培養。然後對普洱茶保 護組細胞和空白對照組細胞分別添加100 300 μ mol/L的甲醛進行處理。在處理30min， Ihrdhrjhr四個時間點，通過微分幹涉成像(DIC)顯微技術觀察細胞的形態變化，並進行 Annexin V螢光染色。實施例2接種IxIO5-IxIO6個小鼠胚胎成纖維細胞到六孔細胞培養板中的玻璃載玻片上， 使用DMEM+10% FBS培養基，在37°C，5% C02,3% 02培養箱中培養12-24小時後，加入終 濃度為0.25mg/ml的普洱茶共培養6小時，空白對照不加普洱茶共培養。然後對普洱茶保 護組細胞和空白對照組細胞分別添加100-300 μ mol/L的甲醛進行處理。在處理30min， Ihrdhrjhr四個時間點，通過微分幹涉成像(DIC)顯微技術觀察細胞的形態變化，並進行 Annexin V螢光染色。實施例3
接種IxIO5-IxIO6個小鼠胚胎成纖維細胞到六孔細胞培養板中的玻璃載玻片上， 使用DMEM+10% FBS培養基，在37°C，5% C02,3% 02培養箱中培養12 M小時後，加入 終濃度為0. 05mg/ml的普洱茶共培養M小時，空白對照不加普洱茶共培養。然後對普洱茶 保護組細胞和空白對照組細胞分別添加100-300 μ mol/L的甲醛進行處理。在處理30min， lhr,3hr,5hr四個時間點，通過微分幹涉成像(DIC)顯微技術觀察細胞的形態變化，並進行 Annexin V螢光染色。實施例4接種IxIO5-IxIO6個小鼠胚胎成纖維細胞到六孔細胞培養板中的玻璃載玻片上， 使用DMEM+10% FBS培養基，在37°C，5% C02,3% 02培養箱中培養12 M小時後，加入 終濃度為0. 25mg/ml的普洱茶共培養M小時，空白對照不加普洱茶共培養。然後對普洱茶 保護組細胞和空白對照組細胞分別添加100-300 μ mol/L的甲醛進行處理。在處理30min， Ihrdhrjhr四個時間點，通過微分幹涉成像(DIC)顯微技術觀察細胞的形態變化，並進行 Annexin V螢光染色。實施例5——普洱茶提取物的製備，採用以下步驟(1)把乾燥的普洱茶按1 10 20的重量/體積比加入飲用水中；(2)在100°C下煮沸10 30分鐘，然後，用120目篩過濾除渣，收集水提液，重複 此步驟2 4次；(3)合併每次的提取液；(4)將總提取液先用200目篩、再用0.45 μ M濾器過濾，濾液經高溫噴霧乾燥得到 普洱茶粉劑，即為所需的普洱茶提取物。
*以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明。凡在本發明的精 神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.普洱茶在消除甲醛生物危害中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的普洱茶選自普洱生茶、熟茶、緊壓 茶或散茶中的一種，或它們的混合物。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特徵在於，將所述的普洱茶製備成普洱茶提取 物，其製備方法包括下述順序的步驟(1)把乾燥的普洱茶按1 10 20的重量/體積比加入飲用水中；(2)在100°C下煮沸10 30分鐘，然後，用120目篩過濾除渣，收集水提液，重複此步 驟2 4次；(3)合併每次的提取液；(4)將總提取液先用200目篩、再用0.45μ M濾器過濾，濾液經高溫噴霧乾燥得到普洱 茶粉劑，即為所需的普洱茶提取物。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於進一步包括將步驟4所得的普洱茶提取 物製成普洱茶浸膏、普洱茶丸劑、普洱茶口服液或普洱茶針劑。
全文摘要
本發明涉及普洱茶的一種新用途，尤其涉及在消除甲醛生物危害中的應用。本發明進行了深入的試驗研究，利用野生型的小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryo fibroblast，MEF)測試甲醛對正常細胞的殺傷作用及普洱茶對正常細胞的保護作用。所述的細胞用100～300μmol/L甲醛處理後大量死亡；而預先加入普洱茶水提取物進行保護的細胞，在同樣濃度甲醛處理後只有少量細胞死亡。同時，利用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測甲醛處理後細胞的凋亡及普洱茶的保護作用。試驗數據清楚地表明，普洱茶可有效地預防甲醛導致的正常細胞死亡，揭示普洱茶對甲醛生物危害的防治功效。
文檔編號A23F3/18GK102047998SQ201010501079
公開日2011年5月11日 申請日期2010年10月9日 優先權日2010年10月9日
發明者司曉宇, 唐文如, 盛軍, 羅瑛 申請人:昆明理工大學, 普洱市人民政府茶產業發展辦公室科技服務中心