含sod基因的重組雙表達家蠶多角體杆狀病毒的構建方法

2023-12-10 01:49:16

專利名稱：含sod基因的重組雙表達家蠶多角體杆狀病毒的構建方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及基因工程生產MnSOD的方法。具體地講，本發明涉及含有 SOD基因及多角體基因的重組雙表達家蠶杆狀病毒的構建方法。
背景技術：
超氧化物歧化酶(SOD)能使人體內自由基保持在"自穩態"。超氧化物歧化酶清除超氧 化物自由基，防止對機體直接或間接的損傷作用；SOD使(V-成為細胞內自由基的排汙漕；調
節機體內(V—的水平；調節機體內NO的水平；催化反應產物貼2的作用(《自由基生物學的理
論與應用》ppl78-180)。
現在市售SOD多數為從哺乳動物牛、豬等的肝臟中提取，隨著狂牛症、口啼疫、禽流感 等流行，安全性有很大問題。家蠶重組病毒穿梭載體表達系統(Bac-to-Bac Bacnlovirus Expression System)是真核表達系統，該技術自1983年Smith等首創以來，已有千種外源 基因在該系統表達(《昆蟲病毒分子生物學》，1998， pP547-178)，由於有家蠶血淋巴本身的 大量蛋白的保護作用和一些未知機理的作用，家蠶表達的蛋白質表達後修飾加工的方式與哺 乳動物接近，能識別並正確地進行信號肽切除及磷酸化、糖基化、醯基化等作用，表達產物 具有很高的生物活性，其抗原性、免疫原性和功能均與天然蛋白相似。
目前構建的重組杆狀病毒大多是多角體缺失型病毒，這種病毒因為沒有多角體包埋的病 毒粒子，經家蠶中腸強鹼性破壞而失活，因此不能經口添食感染，需逐個個體注射接種，並 引起宿主死亡，使得每批生產時都要接種病毒，操作繁瑣。注射接種就成為大規模、工業化 生產的瓶頸。
添食感染可採取重組病毒噴散到桑葉上的方法感染家蠶，結合現階段的養蠶技術，可實 現規模化和工業化接種，操作簡單，節省勞力和成本。

發明內容
為此本發明的目的是採用家蠶杆狀病毒穿梭載體表達系統，構建含有SOD基因及多角 體基因的重組雙表達杆狀病毒，提供可以添食感染家蠶幼蟲的病毒粒子。以期通過家蠶表達 目的基因MnSOD，實現規模化和工業化生產。
本發明含MnSOD基因的重組雙表達家蠶多角體杆狀病毒的構建方法包括以下步驟 (1)以家蠶5齡第3天幼蟲以RNA抽提試劑盒提取總RNA，設計MnSOD引物，正反向引物5' 端分別引進fcoRI和A>/7l酶切位點；
(2) 以總RNA為模板，在通用引物oligo-dTw和反向轉錄酶(Super script II reverse transcriptase)作用下合成單鏈cDNA;
(3) 以單鏈cDNA為模板，在SOD正反向引物下PCR合成MnSOD基因，條件為94'C預變性5分 鍾，再以94"C1分鐘，55°C l分鐘，72°C 2分鐘，共35個循環，最後72'C延長10分鐘；
(4) 合成的MnSOD基因經乙醇沉澱和fcdU和yf/wl雙酶切，電泳並切膠回收將MnSOD基 因與pFastBacHTa以連接試劑盒連接並轉化XL-Blue細胞，挑斑在含每毫升100 U g氨苄青黴 素的LB培養基中培養繁殖，提取重組供體質粒pFastBacHTa/MnSOD;
(5) 以家蠶杆狀病毒DNA為模板，以多角體啟動子5'端和多角體基因3'設計引物，通過 PCR方法合成家蠶部分多角體基因，並將其克隆到pFastBac Dual plasmid質粒；
(6) 以Afco工和/T/wI限制性內切酶分別酶切pFastBacHTa/MnSOD和含部分多角體基因的雙 表達質粒，凝膠回收目的片段，將MnSOD基因插入雙表達質粒的P10啟動子下構建成雙表達 載體Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD;
(7) 將Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD轉染到￡ coh DH10Bac/BmNPV, 37. 5。C培養24 48小時，從中挑選容易分離、獨立的白斑，在含有50ug/ml卡那黴素、7ug/ral慶大黴素、 10ug/ml四環素的液體培養基上培養過夜，收集並提取含有MnSOD基因和多角體基因的雙表 達病毒DNA;
(8) 將上述提取的DNA，在轉染試劑脂質體(Cellfectin)介導下導入轉染家蠶培養細胞， 獲得重組病毒。
步驟(1)所述Mn-SOD引物的序列為
正向引物5' -atcgaattcATGTTAATGTCACAAAGGATTG-3，，
反向引物5' -gatggtaccgcCTTGAGCGCTTTTTCATATCTCTG-3'。 步驟(5)所述合成家蠶部分多角體基因所用引物的序列如下 5' BM PH: GTCGACMGCTCTGTCCGT
Polyhedrin 3' Pstl: TTTTCTGCAGTTAATACGCCGGACCAGTG
本發明提供了含有提取家蠶幼蟲總RNA，再經RT-PCR獲得MnSOD基因的方法，經測序證 明其核苷酸序列完全正確。
本發明提供了含MnSOD基因的重組家蠶杆狀病毒Bacmid。將MnSOD基因插入到Bacmid 中，獲得重組的含SOD基因的BmBacmid/MnSOD。
本發明提供了經改造後的含多角體蛋白基因的雙克隆位點供體質粒，重組病毒可經口添 食感染家蠶。
本發明提供了 MnSOD基因在家蠶幼蟲中的表達產物。
綜上所述，本發明的優點如下，通過構建含有MnSOD基因及多角體基因的重組雙表達杆 狀病毒，添食感染家蠶幼蟲表達目的基因MnS0D;與哺乳動物組織提取的MnS0D在臨床應用 中有種種不足(例如排異，瘋中病等，交叉感染)相比，在家蠶幼蟲的MnS0D更具有實用價 值；家蠶是可以無菌大規模生產的昆蟲，可以低成本大規模的飼養。蠶體中有多種天然蛋白 質保護劑，對表達產物有保護作用，使基因表達產物十分穩定。
具體實施例方式
本發明通過以下實施例作進一步闡述。 實施例l、 Mn-SOD基因的合成
以家蠶N4蠶品種為材料，取5齡第3天幼蟲以RNA抽提試劑盒(TRIzol RNA extraction reagent kit)提取總RNA，經電泳檢測。
設計MnS0D引物。正向引物5' -atc卿ttcATGTTAATGTCACAAAGGATTG-3'， 反向引物 5' -gatggtaccgcCTTGAGCGCTTTTTCATATCTCTG-3'.為便於克隆正反向引物5'端分別引進5boRI 和命/ I酶切位點。
以總RNA為模板，在通用引物oligo-dT18和反向轉錄酶(Super script II reverse transcriptase)作用下合成單鏈cDNA，再以此為模板在SOD正反向引物下PCR合成MnSOD 基因，PCR合成的條件為94'C預變性5分鐘，再以94'C1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 2分鐘， 共35個循環，最後72'C延長10分鐘。
合成的MnS0D基因經乙醇沉澱和fc凍I和f/wl雙酶切，電泳並切膠回收。將MnS0D基因與 pFastBacHTa以連接試劑盒連接並轉化XL-Blue細胞，挑斑在含每毫升100 u g氨苄青黴素的 LB培養基中培養繁殖，提取重組供體質粒pFastBacHTa/MnSOD; 實施例2、含SOD基因的家蠶雙表達重組載體構建
以家蠶杆狀病毒DNA為模板，以5' BM PH: GTCGACAAGCTCTGTCCGT (for the 5' BM promoter) and Polyhedrin 3' Pstl: TTTTCTGCAGTTMTACGCCGGACCAGTG (the 3' of the Polyhedrin coding sequense)為引物，通過PCR方法合成家蠶多角體基因，並將其克隆到 pFastBac Dual plasmid質粒。
以/Ifcol和《w I限制性內切酶分別酶切pFastBacHTa/MnSOD和含家蠶多角體基因的雙表 達質粒，凝膠回收目的片段，將MnS0D基因插入雙表達載體的P10啟動子下構建成雙表達載 體Bm polyhedrin pFB dual/MnS0D。 實施例3、含MnSOD基因的家蠶雙表達重組病毒構建
將Bm polyhedrin pFB dual/MnS0D轉染到￡ DH10Bac/BmNPV， 37. 5。C培養24
48小時，每個培養板40小時平均產生菌斑264，白斑率4.5%，從中挑選容易分離、獨立的
白斑6個，在含有50u g/ral卡那黴素、7ng/ml慶大黴素、10ug/ml四環素的液體培養基上
培養過夜，收集並提取含有MnSOD基因和多角體基因的雙表達病毒DNA;
實施例4、含Mn SOD基因及多角體基因的雙表達重組病毒添食感染家蠶表達目的蛋白MnSOD
的應用實例
將上述提取出的含有MnSOD基因和多角體基因的雙表達病毒DNA,在轉染試劑 Cellfectin (脂質體)介導下導入轉染家蠶培養細胞(BraN)，獲得雙表達重組病毒，避光保 存於-4'C備用。
將上述雙表達重組病毒DNA，與轉染試劑Lipofectin—起注射到5齡起蠶，DNA 1 u g力口 入轉染試劑Lipofectin 6u 1，混合均勻，放置30分，用微量注射器按每條5齡起蠶5 u 1 的劑量，在家蠶第三節間膜處注射進家蠶體腔中。
在注射混合液96小時後，調査家蠶發病情況，收集發病家蠶，對發病家蠶的血淋巴、屍 體進行400倍、600倍的顯微鏡檢査，確定是否NPV病毒病。
對收集到的發病家蠶，經顯微鏡檢查，確定是家蠶杆狀病毒(NPV)病的家蠶，加水研碎， 塗抹桑葉，伺餵5齡起蠶二次，以後正常飼養。
添食後第2天開始收集家蠶NPV病毒病家蠶，取家蠶血淋巴進行SDS-PAGE， WESTERN BLOTTING和SOD活性測定。
測定結果注射重組杆狀病毒DNA到家蠶，再將感染的家蠶磨碎液添食家蠶後96小時血 液中的MnSOD活性為125單位(U) /毫升血液(mL),比未感染重組病毒對照蠶(25 U/mL) 高5倍。 序列表
Mn-SOD引物的序列
正向引物5' -atcgaattcATGTTAATGTCACAAAGGATTG-3，, 反向引物5' -gat鵬accg cCTTGAGCGCTTTTTCATATCTCTG-3，。
合成家蠶部分多角體基因所用引物的序列
5' BM PH: GTCGACAAGCTCTGTCCGT
Polyhedrin 3' Pstl: TTTTCTGCAGTTAATACGCCGGACCAGTG
權利要求
1、含SOD基因的重組雙表達家蠶多角體杆狀病毒的構建方法，其特徵在於以下步驟(1)取家蠶5齡第3天幼蟲以RNA抽提試劑盒提取總RNA，設計MnSOD引物，正反向引物5』端分別引進EcoRI和KpnI酶切位點；(2)以總RNA為模板，在通用引物oligo-dT18和反向轉錄酶(Super script II reversetranscriptase)作用下合成單鏈cDNA；(3)以單鏈cDNA為模板，在SOD正反向引物下PCR合成MnSOD基因，條件為94℃預變性5分鐘，再以94℃ 1分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘，共35個循環，最後72℃延長10分鐘；(4)合成的MnSOD基因經乙醇沉澱和EcoRI和KpnI雙酶切，電泳並切膠回收；將MnSOD基因與pFastBacHTa以連接試劑盒連接並轉化XL-Blue細胞，挑斑在含每毫升100μg氨苄青黴素的LB培養基中培養繁殖，提取重組供體質粒pFastBacHTa/MnSOD；(5)以家蠶杆狀病毒DNA為模板，以多角體啟動子5』端和多角體基因3』設計引物，通過PCR方法合成家蠶多角體基因，並將其克隆到pFastBac Dual plasmid質粒；(6)以NcoI和KpnI限制性內切酶分別酶切pFastBacHTa/MnSOD和含家蠶多角體基因的雙表達質粒，凝膠回收目的片段，將MnSOD基因插入雙表達質粒的P10啟動子下構建成雙表達載體Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD；(7)將Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD轉染到E.coli DH10Bac/BmNPV，37.5℃培養24～48小時，從中挑選獨立的白斑，在每毫升含有50μg卡那黴素、7μg慶大黴素和10μg四環素的液體培養基上培養過夜，收集並提取含有MnSOD基因和多角體基因的雙表達病毒DNA；(8)將上述提取的DNA，在轉染試劑脂質體(Cellfectin)介導下導入轉染家蠶培養細胞，獲得重組病毒。
2、 如權利要求1所述含S0D基因的重組雙表達家蠶多角體杆狀病毒的構建方法，其特徵在於 所述MnSOD引物的序列為正向引物5' -atcgaattcA TGTTAATGTCACAAAGGATTG-3'， 反向引物5' -gatggtaccg cCTTGAGCGCTTTTTCATATCTCTG-3'。
3、 如權利要求1所述含S0D基因的重組雙表達家蠶多角體杆狀病毒的構建方法，其特徵在於 合成家蠶部分多角體基因所用引物的序列如下5' BM PH: GTCGACAAGCTCTGTCCGTPolyhedrin 3' Pstl: TTTTCTGCAGTTAATACGCCGGACCAGTG
全文摘要
含SOD基因的重組雙表達家蠶多角體杆狀病毒的構建方法，包括提取家蠶總RNA，設計MnSOD引物，合成單鏈cDNA，合成MnSOD基因，將MnSOD基因與pFastBacHTa連接並轉化XL-Blue細胞，提取重組供體質粒pFastBacHTa/MnSOD；以家蠶杆狀病毒DNA為模板，合成家蠶多角體基因，並將其克隆到pFastBac Dual plasmid質粒；將MnSOD基因插入雙表達質粒的P10啟動子下構建成雙表達載體Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD；將其轉染後提取含有MnSOD基因和多角體基因的雙表達病毒DNA；在轉染試劑脂質體介導下導入轉染家蠶培養細胞，獲得重組病毒。提供可以添食感染家蠶幼蟲的病毒粒子，通過家蠶表達目的基因MnSOD，實現規模化和工業化生產。
文檔編號C12N15/866GK101182549SQ20071016449
公開日2008年5月21日 申請日期2007年12月5日 優先權日2007年12月5日
發明者嶽萬福, 繆雲根 申請人:浙江大學