一種大菱鮃c型溶菌酶及其構建和應用的製作方法

2023-12-05 19:20:41

專利名稱：一種大菱鮃c型溶菌酶及其構建和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子微生物學領域，具體的說是一種大菱鮃C型溶菌酶及其構建和應用。
背景技術：
溶菌酶(lysozyme)，又稱為胞壁質酶或N-乙醯胞壁質聚糖水解酶，它能降解細菌細胞壁中N-乙醯胞壁酸和N-乙醯氨基葡糖之間的P -I, 4糖苷鍵，從而破壞細胞壁，使得胞內容物釋放，由此導致細菌死亡。根據其序列結構特點,溶菌酶可分為六大類,其中C型溶菌酶(C-type lysozyme)在動物中是一種主要類群,廣泛存在哺乳動物、鳥類、魚類等。溶菌酶是一種重要的天然免疫因子，在抗病原感染過程中發揮重要作用，因此在臨床上，溶菌 酶用於抗細菌和病毒感染以及消腫止痛等。另外，溶菌酶在食品工業中被用作防腐劑。

發明內容
本發明目的在於提供一種大菱鮃C型溶菌酶及其構建和應用。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種大菱鮃C型溶菌酶，溶菌酶為序列表SEQ ID No. I中的胺基酸序列所示。大菱鮃C型溶菌酶的製備方法，I)菌株 BL21/pSmLysC 的構建以大菱鮃cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增，PCR產物純化後與載體PEASY-E2於室溫連接2 — 8小時，連接混合液轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，篩選轉化子，即為 BL21/pSmLysC ;所述 Fl 為 5』 -GATATCATGAAAGTCTTCGAACGCTGT-3』，Rl 為5』 -GATATCCACACCACATCCTGCCAC-3』 ；2)溶菌酶的表達和製備將上述步驟I)的BL21/pSmLysC在含有安卡青黴素的LB培養基上培養至OD6tltl為0. 5，加入異丙基-P -D-硫代半乳糖苷使其終濃度達到lmM，28°C繼續搖動培養5 — 6小時，而後用親和層析柱純化重組蛋白，即為SEQ IDNo. I中胺基酸序列所示。大菱鮃C型溶菌酶的應用，所述溶菌酶可作為革蘭氏陽性菌的抑菌劑。所述革蘭氏陽性菌為藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、海豚鏈球菌(Strep tococcus iniae)或金黃色葡萄球菌(Staphyl ococcus aureus)。本發明具有如下優點本發明的溶菌酶可以有效裂解多種革蘭氏陽性菌，因而可以用於防控革蘭氏陽性菌相關疾病。


圖I為本發明實施例純化得到的溶菌酶電泳圖譜(其中，純化得到的溶菌酶為泳道2 ;泳道I :分子量marker。)。圖2為本發明實施例溶菌酶的殺菌效應例圖(其中，圖A為本發明實施例製備的溶菌酶產生的抑菌圈；圖B為PBS陰性對照)。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而非以任何形式對本發明進行限制。在本發明實施例中所涉及到的常規性實驗方法均採用如下方法I.質粒提取、DNA(PCR)產物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用「天根生化科技(北京)有限公司」的相應試劑盒。2.大腸桿菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning: ALaboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；酵母轉化按Invitrogen公司的方法(Catalog no. V175-20);聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS — PAGE)按照·Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual. Cold Spring HarborLaboratory Press2001o3.所有限制性內切酶和連接酶皆購自於「紐英倫生物技術有限公司」，北京。實施例I本發明的溶菌酶為序列表SEQ ID No. I中的胺基酸序列。序列表SEQ ID No. I 為:MRCLLLLLLVPVPGAKVFERCEWARLLKRNGMSNYRGISLADWVCLSQWESSYNTRATNRNTDGSTDYGIFQINSRffffCDNGQTPTSNACGISCSALLTDDVGAAIICAKHVVRDPNGIGAffVAWKRHCQGQDLSSYVAGCGV(a)序列特徵 長度143 類型胺基酸序列籲鏈型單鏈 拓撲結構線性(b)分子類型蛋白質(C)假設否(d)反義否( e )最初來源大菱鮃空間結構該蛋白含有I個C型溶菌酶結構域，由胺基酸16 - 141構成。實施例2溶菌酶的製備方法I)菌株 BL21/pSmLysC 的構建以大菱鮃cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增。PCR條件為94° C60s預變性模板DNA,然後 94° C 40s, 55° C 60s, 72° C 60s, 5 個循環後改為 94° C 40s, 63° C60s, 72° C 60s，25個循環後再在72° C延伸反應7 — lOmin。PCR產物純化後與載體PEASY-E2 (購於北京全式金生物技術有限公司)於室溫連接2 — 8小時，連接混合液轉化大腸桿菌BL21(DE 3)(購於天根生化科技(北京)有限公司)，在含安卡青黴素(50ug/ml)、Xga I (40ug/ml)、異丙基-P -D-硫代半乳糖苷(24ug/ml)的LB培養基上培養18 — 24小時，篩選轉化子，即為BL21/pSmLysC。
所述LB組成成分按重量百分比計1. 0 %蛋白腖，0. 5 %酵母粉，I. 0 %氯化鈉，97.5 % 蒸餾水。所述 Fl 為 5』 -GATATCATGAAAGTCTTCGAACGCTGT-3』 ；R1 為5』 -GATATCCACACCACATCCTGCCAC-3』。2)溶菌酶的表達和製備將BL21/pSmLysC在含有卡那黴素的LB培養基中於37°C培養至OD6tltl為0. 5，加入異丙基-P -D-硫代半乳糖苷使其終濃度達到lmM，28°C繼續搖動培養5 — 6小時，而後用GE Healthcare (美國)公司的nickel-nitrilotriacetic acid親和層析柱純化重組蛋白(層析條件用4 - 5ml洗滌液洗柱兩次，隨後用0. 5 - Iml洗脫緩衝液洗柱，收集所有洗脫液)。將重組蛋白用聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS — PAGE)分析，發現其分子量與表SEQ IDNo. I中序列的G3BP分子量一致(參見圖I)。將重組蛋白進行質譜分析，證實 其與序列表SEQ ID No. I中序列一致。上述洗滌液成分為50mMNaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazole, pH8. 0;上述洗脫緩衝液成分為50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM imidazole, pH 8. 0.實施例3溶菌酶的殺菌檢測I)細菌平板製備。在LB培養基中培養內分別培養革蘭氏陽性菌藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、海豚鏈球菌(Streptococcus inie)(保存於 CGMCC,編號為 CGMCC1984)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(保存於 CGMCC,編號為 CGMCC I. 363)分別培養至OD6tltl為0. 5，將上述各菌種與含有0. 8% (質量百分比)瓊脂的LB混合；將混合液倒入培養皿，凝固後即為細菌平板。2)溶菌酶的殺菌效應。將高壓滅菌處理過的濾紙片(直徑5mm)置於細菌平板上。將實施例2製備的溶菌酶在PBS中稀釋至lmg/ml，將IOul溶菌酶或PBS (陰性對照)加至細菌平板的濾紙片上。將平板於28° C保溫24 — 32h後觀察發現，在含有溶菌酶的濾紙片周圍形成明顯的抑菌圈(即無細菌生長)，而含有PBS的濾紙片周圍則無抑菌圈(參見圖2)。因此本發明的溶菌酶對於革蘭氏陽性菌具有明顯的殺菌效應，可望作為抑菌劑用於防治革蘭氏陽性菌細菌性病害。
權利要求
1.一種大菱鮃C型溶菌酶，其特徵在於溶菌酶為序列表SEQ I D No. I中的胺基酸序列所示。
2.—種權利要求I所述的大菱鮃C型溶菌酶的製備方法，其特徵在於 1)菌株BL21/pSmLysC的構建 以大菱鮃cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增，PCR產物純化後與載體PEASY-E2於室溫連接2 — 8小時，連接混合液轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，篩選轉化子，即為 BL21/pSmLys C ;所述 Fl 為 5』 -GATATCATGAAAGTCTTCGAACGCTGT-3』，Rl 為5』 -GATATCCACACCACATCCTGCCAC-3』 ； 2)溶菌酶的表達和製備 將上述步驟I)的BL21/pSmLysC在含有安卡青黴素的LB培養基上培養至OD6tltl為O. 5，加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷使其終濃度達到ImM，28°C繼續搖動培養5 — 6小時，而後用親和層析柱純化重組蛋白，即為SEQ IDNo. I中胺基酸序列所示。
3.—種權利要求I所述的大菱鮃C型溶菌酶的應用，其特徵在於所述溶菌酶可作為革蘭氏陽性菌的抑菌劑。
4.按權利要求3所述的大菱鮃C型溶菌酶的應用，其特徵在於所述革蘭氏陽性菌為藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)或金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
全文摘要
本發明涉及分子微生物學領域，具體的說是一種大菱鮃C型溶菌酶及其構建和應用。溶菌酶為序列表SEQ ID No.1中的胺基酸序列所示。具體為以大菱鮃cDNA為模板PCR擴增溶菌酶基因，將PCR產物與載體pEASY-E2連接，將連接液轉化大腸桿菌BL21(DE3)，得轉化子BL21/pSmLysC，經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導後，利用親和層析柱純化重組蛋白，即得C型溶菌酶。本發明的溶菌酶可以有效裂解多種革蘭氏陽性菌，因而可以用於防控革蘭氏陽性菌相關疾病。
文檔編號A61K38/47GK102952788SQ20121045226
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月9日 優先權日2012年9月11日
發明者孫黎, 於蘭萍 申請人:中國科學院海洋研究所