一種雷公藤多苷及其製劑的質量控制方法
2023-12-05 15:23:11
專利名稱：一種雷公藤多苷及其製劑的質量控制方法
技術領域：
本發明涉及一種雷公藤多苷及其製劑的質量控制方法。
背景技術：
雷公藤以其獨特的功效引起國內外醫藥界的廣泛關注。雷公藤屬在我國主要分布於長江流域以南山區和東北長白山區，民間廣泛流傳用作為治療關節炎、跌打損傷、皮膚病等的草藥，也用於農藥。明朝《滇南本草》以其異名「紫金皮」作為藥物進行記載並用於臨床。清代《植物名實圖考》對其植物形態有較詳細的文字描述，並附有與之相符的插圖。在臨床上國內對雷公藤的研究取得了顯著的成效和突破，從治療風溼性關節炎已發展到治療紅斑狼瘡、銀屑病、腎炎和腫瘤研究等多種常見病和疑難雜症，所治病種不斷增多，涉及到臨床內、外、兒、婦、骨科、皮膚、傳染、神經、腫瘤、風溼、口腔等十餘個學科的數十種疾病，新近又顯示出其器官移植抗排斥方面廣闊前景。由於其應用面廣、療效顯著，且對疑難頑症具有獨特治療作用而逐漸成為國內外、中醫、西醫、中西醫各專家矚目和研究的熱點。因此為保證臨床用藥的可控性、安全性，建立一個穩定，有效的質量控制方法十分重要。
目前雷公藤提取物的質量控制方法主要從單一方面來衡量，如僅依靠對其中某些成分的含量測定來控制，科學性及可靠性不夠高。
發明內容
本發明的目的是為了提高雷公藤提取物質量控制方法的科學性，而提供一種從多方面考察產品質量的雷公藤多苷及其製劑的質量控制方法。
本發明中，所數的雷公藤多苷為衛矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordiiHook F.)的根部經去皮，粉碎，提取，層析精製得到，其製劑指所有以雷公藤多苷為原料的各種劑型。本發明的方法適用於雷公藤多苷及其製劑的質量控制，及含雷公藤多苷的藥物及製劑的質量控制。本發明中，製劑的質量控制以雷公藤多苷為基礎物質進行換算。
本發明的方法包括三個方面的質量控制(1)以標準品為對照，採用薄層色譜進行分離檢測。
其中，所述的薄層色譜中，溶解樣品的溶劑較佳的為環己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇或乙腈；薄層板較佳的為矽膠；展開劑較佳的為環己烷/丙酮或氯仿/甲醇。
具體實驗步驟可如下取相當於雷公藤多苷0.3～1g的固體，加入有機溶劑(可以是環己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈等)50mL，超聲提取30分鐘，搖勻。取上述溶液25mL，置蒸發皿中，水浴蒸乾，殘渣加有機溶劑(可以是環己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈等)2mL溶解，作為供試品溶液。另取雷公藤甲素對照品，加氯仿製成每毫升含0.5mg的溶液，作為對照品溶液(1)。取雷公藤酯甲對照品加氯仿製成每毫升含1mg的溶液，作為對照品溶液(2)。照薄層色譜法(藥典2005版附錄)試驗，吸取上述供試品溶液、對照品溶液(1)、(2)各5uL，分別點於同一矽膠G薄層板上，以展開劑展開[展開劑可以是氯仿∶甲醇(90～70∶1～3)；也可以是環己烷∶丙酮(3-10∶1-7)]，展開，取出，涼幹，噴以5％磷鉬酸乙醇溶液，熱風吹至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在於對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
(2)乾燥失重、熾灼殘渣和重金屬含量檢測。
其中，乾燥失重的方法依照中國藥典2005年一部附錄，具體為標準為60℃減壓乾燥4小時後，減失重量不得超過質量百分比5.0％。
其中，熾灼殘渣的檢測方法依照中國藥典2005年一部附錄，標準為重量不超過質量百分比1.0％。
其中，重金屬含量的檢測方法依照中國藥典2005年一部，標準為不得超過百萬分之二十的重量。
本發明中，製劑的質量控制檢測依照藥典製劑項下規定進行。
(3)高效液相色譜測定雷公藤甲素和雷公藤內酯甲含量，以及毒力試驗。
其中，雷公藤甲素含量的測定的實驗條件及具體操作如下1.色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以有機溶劑(可以是環己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈等)0.01mol/L磷酸二氫鹽(可以是鉀鹽、鈉鹽等)溶液(PH2-6)(20-60∶80-40)為流動相，柱溫25～50℃，以1mL/min流速進行洗脫，檢測波長為218nm、225nm。理論板數按雷公藤甲素峰計算應不低於2500。
2.對照品溶液的製備取雷公藤甲素對照品適量，精密稱定，加(可以是甲醇或流動相)溶解並製成每毫升約含50ug的溶液。
3.供試品溶液的製備取相當於雷公藤多苷約0.3g的固體，精密稱定，加入有機溶劑(可以是環己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈、流動相等)10mL溶解，稱重，超聲提取，再稱重加相同的有機溶劑補足損失量，搖勻，離心(3000r/min)。精密吸取上清液5mL，加至用相同的有機溶劑溼法裝好的中性氧化鋁(3g，內徑1cm，70-350目，20-40度)柱上，用相同的有機溶劑洗脫，收集洗脫液，旋轉蒸發儀蒸除有機溶劑，殘渣以有機溶劑(可以是環己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈、流動相等)轉移至5mL量瓶中，加相同的有機溶劑定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。
4.測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，即得。雷公藤多苷中含雷公藤甲素為質量百分比0.10～0.20％。
其中，雷公藤內酯甲含量的測定的實驗條件及具體操作如下1.色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，以甲醇-乙腈-水(75～50∶10～30∶5～20)為流動相，柱溫25～50℃，以1mL/min流速進行洗脫，檢測波長為210nm。理論板數按雷公藤內酯甲峰計算應不低於2500。
2.對照品溶液的製備取雷公藤內酯甲對照品適量，精密稱定，加(可以是甲醇或流動相)溶解並製成每毫升中約含0.1mg的溶液。
3.供試品溶液的製備取相當於雷公藤多苷約0.3g的固體，精密稱定，加入有機溶劑(可以是環己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈、流動相等)10mL溶解，稱重，超聲提取，稱重並加入相同的有機溶劑補足損失量，離心(3000r/min)。精密吸取上清液5mL至已用相同的有機溶劑溼法裝好的中性氧化鋁(3g，內徑1cm，70-350目，20-40度)柱上，用相同的有機溶劑洗脫，收集洗脫液，旋轉蒸發除去有機溶劑，殘渣以有機溶劑(可以是環己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、乙腈、流動相等)轉移至5mL量瓶中，加相同的有機溶劑定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。
4.測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，測定，即得。雷公藤多苷中含雷公藤內酯甲0.25～0.40％。
其中，毒力試驗的實驗條件及操作如下對照品溶液的製備，精密稱取對照品適量，每20mg加吐溫-80，0.1ml，攪勻，加熱使溶解，逐滴加水稀釋至所需體積。
供試品溶的製備精密稱取本品適量，按對照品溶液的製備方法配製。
測定法取同一來源，體重18-22g的健康小白鼠，灌胃給藥，分別測定對照品和供試品的半數至死量，供試品與對照品兩者LD50的比值應為0.90～1.10，即LD50的平均可信限率不得超過15％，P＝0.95。
本發明所用試劑及原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於本發明打破了只從某個方面因素決定雷公藤多苷質量的局面，從多個因素入手，協同控制雷公藤多苷的質量，結果更科學有效，更加可靠。本專利方法經科學統計方法驗證，精密度高、重現性強、方法穩定，回收率、線性都很好。
圖1為雷公藤甲素標準曲線圖。
圖2雷公藤內酯甲標準曲線圖。
具體實施例方式
下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。
實施例(1)以標準品為對照，採用薄層色譜進行分離檢測。
取相當於雷公藤多苷約0.3g的固體，加入氯仿50mL，超聲提取，搖勻。取上述溶液25mL，置蒸發皿中，水浴蒸乾，殘渣加氯仿2mL溶解，作為供試品溶液。另取雷公藤甲素對照品，加氯仿製成每毫升含0.5mg的溶液，作為對照品溶液(1)。取雷公藤內酯甲對照品加氯仿製成每毫升含1mg的溶液，作為對照品溶液(2)。照薄層色譜法(附錄VIB)試驗，吸取上述供試品溶液、對照品溶液(1)、(2)各5uL，分別點於同一矽膠G薄層板上，以氯仿-甲醇(80∶1)為展開劑，展開，取出，涼幹，噴以5％磷鉬酸乙醇溶液，熱風吹至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在於對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
(2)乾燥失重、熾灼殘渣和重金屬含量檢測。
乾燥失重的方法依照中國藥典2005年一部附錄，具體為標準為60℃減壓乾燥4小時後，減失重量不得超過質量百分比5.0％。
熾灼殘渣的檢測方法依照中國藥典2005年一部附錄，標準為重量不超過質量百分比1.0％。
重金屬含量的檢測方法依照中國藥典2005年一部，標準為不得超過百萬分之二十的重量。
(3)高效液相色譜測定雷公藤甲素和雷公藤內酯甲含量，以及毒力試驗。
儀器Agilent.1100 Series高效液相色譜儀。
(一)雷公藤甲素測定1、對照品溶液的製備取雷公藤甲素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解並製成每毫升約含50ug的溶液。
2、供試品溶液的製備取相當於雷公藤多苷約0.3g的固體，精密稱定，加入乙酸乙酯10mL溶解，稱重，超聲提取，再稱重加乙酸乙酯補足損失量，搖勻，離心(3000r/min)。精密吸取上清液5mL，加至用乙酸乙酯溼法裝好的中性氧化鋁(3g內徑1cm，70-350目)柱上(室溫條件下)，用乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，旋轉蒸發儀蒸除乙酸乙酯，殘渣以甲醇轉移至5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。
3、測定精密吸取供試品溶液10μL，照HPLC法(中國藥典2005年版一部)操作。色譜條件柱溫30℃，流動相甲醇-0.01mol/L磷酸二氫鉀(35∶65)，流速1.00mL/min。在225nm波長處測定供試品和對照品的峰面積，計算即得。
(二)雷公藤內酯甲測定1、對照品溶液的製備取雷公藤內酯甲對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解並製成每毫升中約含0.1mg的溶液。
2、試品溶液的製備取相當於雷公藤多苷約0.3g的固體，精密稱定，加入乙酸乙酯10mL溶解，稱重，超聲提取，稱重並加入乙酸乙酯補足損失量，離心(3000r/min)。精密吸取上清液5mL至已用乙酸乙酯溼法裝好的中性氧化鋁(3g，內徑1cm，70-350目)柱上(室溫條件下)，用乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，旋轉蒸發除去乙酸乙酯，殘渣以甲醇轉移至5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。
3、測定精密吸取供試品溶液20μL，照HPLC法(中國藥典2005年版一部附錄)操作。色譜條件柱溫30℃，流動相甲醇-乙晴-水(60∶25∶15)，流速1.0mL/min。在210nm波長處測定供試品和對照品的峰面積，計算即得。
標準曲線的製備分別精密稱取雷公藤甲素和雷公藤內酯甲對照品8.15mg、6.04mg，用甲醇溶解並定容至25mL作為儲備液。分別精密吸取儲備液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL和0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0置5mL量瓶中，按色譜條件與系統適用性試驗。分別繪製曲線，並計算得回歸方程Y1＝1714.2X+0.7818，Y2＝507.02X-0.0258；R1＝1.0000，R2＝0.9998。表明在0.163～1.630μg、0.484～4.840μg之間兩者有較好的線性關係(見圖1)。
表1雷公藤甲素標準曲線測定
表2雷公藤酯甲標準曲線測定
精密度試驗精密吸取雷公藤甲素對照品溶液(0.0326mg/mL)10μL，連續進樣5次，計算平均峰面積及RSD(％)，結果見表3。
表3精密度試驗結果(雷公藤甲素)
精密吸取雷公藤酯甲對照品溶液(0.0966mg/mL)20μL，連續進樣6次，計算平均峰面積及RSD(％)，結果見表4。
表4精密度試驗結果(雷公藤內酯甲)
穩定性試驗取含量測定項下的供試品溶液分別在0、3、6、12、24小時測定含量，結果見表5。
表5穩定性試驗
表明雷公藤甲素和雷公藤酯甲含量在24小時內基本穩定。
重現性試驗取供試品每份約0.3g，共計5份，精密稱定，同前製備成供試品液，同前述方法操作測定雷公藤甲素，結果見表6。
表6重現性試驗結果(雷公藤甲素)
另取供試品每份約0.3g，共計5份，精密稱定，同前製備成供試品溶液，同前述方法操作測定雷公藤內酯甲，結果見表7。
表7重現性試驗結果(雷公藤內酯甲)
加樣回收率試驗精密稱定已知雷公藤甲素含量的雷公藤多苷，添加一定量的雷公藤甲素對照品溶液，按照「供試品溶液的製備」項下方法製備加樣樣品，按上述色譜條件測定，結果表明，本法具有良好的加樣回收率，平均回收率為98.6％，RSD為2.71％，結果見表8。
表8雷公藤多苷(雷公藤甲素)加樣回收率試驗
精密稱定已知雷公藤酯甲含量的雷公藤多苷(批號041126)，添加一定量的雷公藤酯甲對照品溶液，按照「供試品溶液的製備」項下方法製備加樣樣品，按上述色譜條件測定，結果表明，本法具有良好的加樣回收率，平均回收率為98.1％，RSD為3.01％，結果見表9。
表9雷公藤多苷(雷公藤酯甲)加樣回收率試驗
樣品測定取不同批號雷公藤多苷精密稱定，按含量測定項下製備並測定，用隨行標準曲線計算，結果見表10、11。
表10雷公藤多苷中的雷公藤甲素含量
表11雷公藤多苷中的雷公藤內酯甲含量
權利要求
1.一種雷公藤多苷及其製劑的質量控制方法，其特徵在於採用下述三個方法進行質量檢測(1)以標準品為對照，採用薄層色譜進行分離檢測；(2)乾燥失重、熾灼殘渣和重金屬含量檢測；(3)高效液相色譜測定雷公藤甲素和雷公藤內酯甲含量，以及毒力試驗。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的薄層色譜中，溶解樣品的溶劑為環己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇或乙腈。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的薄層色譜中，薄層板為矽膠。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的薄層色譜中，展開劑為環己烷/丙酮或氯仿/甲醇。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的乾燥失重的檢測標準為60℃減壓乾燥4小時後，減失重量不得超過質量百分比5.0％；熾灼殘渣的檢測標準為重量不超過質量百分比1.0％；重金屬含量的檢測標準為不得超過百萬分之二十的重量。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的雷公藤甲素含量測定的色譜條件為，十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以體積比為20～60∶80～40的有機溶劑0.01mol/L磷酸二氫鹽溶液為流動相，柱溫25～45℃，以1mL/min流速進行洗脫，檢測波長為218nm或225nm，理論板數按雷公藤甲素峰計算不低於2500，雷公藤甲素的含量為質量百分比0.10～0.20％；所述的雷公藤內酯甲的色譜條件為，以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，以體積比為75～50∶10～30∶5～20的甲醇-乙腈-水為流動相，柱溫25～50℃，以1mL/min流速進行洗脫，檢測波長為210nm，理論板數按雷公藤內酯甲峰計算應不低於2500，雷公藤內酯甲的含量為質量百分比0.25～0.40％。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於所述的有機溶劑為甲醇或乙腈，所述的磷酸二氫鹽為鉀鹽或鈉鹽。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的毒力試驗的標準為供試品與對照品兩者LD50的比值應為0.90～1.10，LD50的平均可信限率不得超過15％，P＝0.95。
全文摘要
本發明提供了一種雷公藤多苷及其製劑的質量控制方法。本發明通過鑑別、檢查、含量測定等多個方面檢測，共同控制雷公藤多苷及其製劑的質量，適用於雷公藤多苷及其製劑的質量控制，及含雷公藤多苷的藥物及製劑的質量控制。本發明打破了只從某個方面因素決定雷公藤多苷質量的局面，從多個因素入手，協同控制雷公藤多苷的質量，結果更科學有效，更加可靠。
文檔編號G01N35/00GK101093219SQ200710043859
公開日2007年12月26日 申請日期2007年7月17日 優先權日2007年7月17日
發明者林健 申請人:上海美通生物科技有限公司, 江蘇美通製藥有限公司