一種高產替考拉寧的替考遊動放線菌誘變菌株及其應用的製作方法

2023-12-05 05:38:36 2

【
技術領域：
】本發明屬於微生物領域，具體涉及一種高產替考拉寧的替考遊動放線菌誘變菌株及其應用。
背景技術：
：替考拉寧(teicoplanin)是最新開發的一種抗耐藥菌的糖肽類抗生素，與當前國際上公認的抗耐藥菌抗生素萬古黴素相比，替考拉寧具有與之相似的抗菌活性，相同的作用機制，相近或更優的臨床療效，而且毒性反應更低，特別是腎毒性更低，是目前臨床上為數不多的對多重耐藥性金葡菌和腸球菌仍有抗菌活性的藥物之一。現有生產方法中，一般採用微生物發酵生產替考拉寧為主，並對發酵獲得的替考拉寧粗品進行純化。發酵液中替考拉寧，包括tal～ta2，其中ta2是替考拉寧的主要活性成分，主要由5個化學結構十分相似的化合物(ta2-1，ta2-2，ta2-3，ta2-4，ta2-5)組成。1978年最早發現能產生替考拉寧的菌株，鑑定為放線菌a.teichomyceticusnov.sp.(atcc31121)，該菌株被美國標準生物品收藏中心(atcc)收錄，即atcc31121。我國最早從江西省井崗山土壤中分離到1株產生替考拉寧的稀有放線菌siia92-363，後經生物學鑑定，定名為替考遊動放線菌吉安變種(a.teichomyceticusvar.jisnensis.nov.siia92-363)。目前針對替考拉寧菌株改良的選育技術中主要是採用的是紫外誘變結合不同誘變劑，和原生質體融合技術等育種手段；例如：cheong等從韓國採集的土樣裡分離出1株突變株，稱為a.teichomyceticusbng23，為了進一步提高其產能，對其進行紫外處理並獲得了菌株a.teichomyceticusbng2315，該菌株的產能已達atcc31121菌株的60倍，現在已被保存在韓國菌種保藏中心，編號為kccm-10601；金志華等對出發菌a.teichomyceticus987-5-74(四川抗菌素菌種保藏中心保藏)進行紫外誘變後，用纈氨酸氧肟酸為篩選劑，獲得了1株抗性變株a.teichomyceticus98-1-227，其發酵總效價達2091μg/ml；吳軍營等以替考遊動放線菌xyu-28為出發菌株，經紫外線誘變處理，將誘變後的孢子懸液塗布在含有0.25％醋酸鈉的分離培養基上，篩選醋酸鈉抗性突變菌株，得到的04-10-3菌株的發酵單位比出發菌株xyu-28提高了55％；由上可知紫外誘變結合不同誘變劑已取得一定的效果，然而長期使用這些誘變劑處理同一菌種，由於突變的不定向性及突變的累積使得在獲得高產的同時菌株在生活能力、產孢量等方面會明顯減弱，並且多次誘變往往導致較高的負突變率和抗性飽和，從而使得菌株改善的空間不足。徐波等利用基因組重排(genomeshuffling)技術通過菌絲體製備、原生質體融合、再生方法，獲得3株高產菌株，其中siia05-03-136菌株的產量(3016μg/ml)；雖然以分子生物學為基礎的基因組重排定向構建功能細胞株提供了廣闊前景，但要真正實現以這些功能細胞培養來達到改造目標卻極其困難；且由於微生物體內代謝網絡的複雜性和多結點性，基因操作後菌株的代謝流往往並不朝著預期設計的方向轉移，尤其是在產生抗生素等次級代謝產物的複雜體系中，要想得到優良的工業生產菌株是非常有難度的。有鑑於此，獲得一株符合工業化生產且能夠高產替考拉寧的菌株是從業人員所迫切期望地。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題在於提供一種高產替考拉寧的替考遊動放線菌誘變菌株，誘變菌株為替考遊動放線菌fim-68-66(actinoplanesteichomycoticus)，於2016年12月19日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為cgmccno.13469。本發明是通過以下技術方案解決上述技術問題的：本實驗室以替考遊動放線菌fim-68(actinoplanesteichomycoticus)為出發菌株，採用常壓室溫等離子體誘變技術並篩選得到的菌株，對該菌株的理化特性等進行鑑定，最終鑑定其為替考遊動放線菌菌屬的一株菌株。同時，本發明揭露了該替考遊動放線菌fim-68-66(actinoplanesteichomycoticus)在發酵生產替考拉寧中的應用。本發明的有益效果在於：提供了一種替考遊動放線菌fim-68-66(actinoplanesteichomycoticus)，其能夠發酵高產替考拉寧，大幅度提高了替考拉寧的產量，能夠應用於工業化發酵生產；且該菌株fim-68-66穩定性良好，連續傳代三代其產替考拉寧效價基本穩定，維持在同一較高水平，能夠作為進一步研究和開發的生產菌株。【附圖說明】下面參照附圖結合實施例對本發明作進一步的描述。圖1是本發明中致死率曲線。【具體實施方式】本發明中替考遊動放線菌fim-68-66(actinoplanesteichomycoticus)是以替考遊動放線菌fim-68(actinoplanesteichomycoticus)為出發菌株、並採用常壓室溫等離子體誘變技術篩選得到的菌株，該菌株能夠發酵生產替考拉寧，且產量優異。實施例1、菌株fim-68的分離(1)於福建省南平市武夷山茶園採集土壤，具體地，用取樣鏟將表層10cm左右的浮土除去，採集10cm處土樣10g～25g；稱取2g土樣並加入10ml無菌生理鹽水，振蕩後靜置30min，取上清液即原液並用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，選用稀釋度為10-2、10-3、10-4和10-5的懸浮液；(2)分別取原液及選用的懸浮液0.1ml塗布於添加50mg/l重鉻酸鉀的水配製的isp-4培養基上，每個樣重複3個平行板，然後將塗布後的平板置於28℃培養，觀察菌落外觀、大小、顏色、邊緣形狀、表面乾濕狀態等形態特徵；(3)在無菌操作條件下，培養8-12天後挑出菌落圓形或橢圓形，表面呈皺褶，淺橘黃色或暗紅色，產色素等具有代表性的單菌落，劃線接種於isp-4培養基斜面，置於28℃條件下培養8-12天，分離純化得到菌株，將得到的菌株命名為菌株fim-68，並於-80℃條件下將分離獲得的菌株fim-68以20％甘油保存。實施例2、菌株fim-68的鑑定(1)生理生化特性鑑定：將獲得的菌株fim-68在isp-4培養基平板上劃線塗菌並插入蓋玻片，30℃培養7～20d，用光學顯微鏡、透射和掃描電子顯微鏡觀察單菌落的形態特徵及其菌絲，得到該菌株fim-68的主要形態及生理生化特性如下：菌體為革蘭氏陽性菌，基內菌絲分枝好，無橫隔；孢囊直接著生在基內菌絲上或孢囊梗上，孢囊梗長2.3～2.8μm，直徑1.4～1.8μm，無橫隔，孢囊呈球形，直徑14～17μm；孢囊內孢子不規則排列，孢子呈圓形或橢圓形，直徑0.5～0.7×1.0～1.3μm，靠極生單鞭毛遊動；在平板上，菌落圓形，菌落培養10d直徑達3～4mm，表面呈皺褶、且呈淺橘黃，基內菌絲為褐色，並產褐色可溶性色素；在蛋白腖-明膠培養基上能液化明膠，水解澱粉能力強,還原硝酸鹽，可分解纖維素，酪氨酸不水解，酪蛋白水解，產生黑色素，牛奶先腖化後微弱凝固；能很好利用阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、澱粉、甘露醇；對乳糖、水楊素、纖維素利用較弱；不能利用鼠李糖、肌醇和棉籽糖。且此菌株fim-68為高耗氧菌，生長溫度為23～37℃，最適生長溫度為28-32℃，生長ph值為5.5～10，最佳生長ph為7且偏鹼性。(2)分子生物學鑑定：對菌株fim-68的16srdna序列進行測序，測得的16srdna序列如seqidno.1所示；將所測的菌株的16srdna序列與genbank資料庫中已有序列進行比對，及進行同源性分析；在lpsn(http://www.bacterio.cict.fr)網站上選取相應的模式株16srrna基因序列，系統進化分析用clustal-x軟體進行比對，生成的比對文件用treecon軟體鄰接法進行系統進化分析，拓撲分析為1000次重複取樣的結果；通過16srdna序列分析表明，菌株fim-68與替考遊動放線菌(actinoplanesteichomycoticus)的序列同源性為100％。結合上述形態、生理生化特徵與分子生物學鑑定，最終確定菌株fim-68為替考遊動放線菌(actinoplanesteichomycoticus)。且菌株fim-68即替考遊動放線菌fim-68(actinoplanesteichomycoticus)，於2017年02月13日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為cgmccno.13658。實施例3、菌株fim-68-66的獲得(1)、取所述菌株fim-68並轉接至isp-4培養基上，並於恆溫培養箱中培養8-15天，且培養溫度為30℃；之後用生理鹽水洗下isp-4培養基上的孢子，玻璃珠打散，經紗布過濾，製成106個/ml的孢子懸液；(2)、用移液槍吸取10μl步驟(1)製得的孢子懸液於直徑為1cm的圓形鐵片上，置於以氦氣作為工作氣體、電源功率為110w、工作氣流量10l/min的常壓室溫等離子體誘變系統中，且處理距離為2mm，分別處理15s、30s、40s、45s、50s、55s、60s、65s、70s，將處理後的孢子懸液進行梯度稀釋塗平板，製作致死率曲線(如圖1所示)；從圖1中可以看出誘變處理劑量與菌株fim-68菌株致死率之間存在明顯的劑量效應關係，隨著處理時間的延長，致死率逐漸升高；(3)、根據步驟(1)的致死率曲線，選擇15s、40s、60s三個不同致死劑量的照射時間，對菌株fim-68的孢子懸液進行等離子體誘變；(4)、將步驟(3)中三個不同處理時間的孢子懸液混合於裝有生理鹽水的試管中，混合均勻，得誘變孢子懸液，備用；(5)、取步驟(1)中的孢子懸液，並分別塗布於含替考拉寧的平板培養基中，其中平板培養基中替考拉寧濃度分別為0.5g/l、1g/l、2g/l、4g/l、6g/l、7g/l、8g/l；於30℃培養8-15天後，觀察不同平板上的菌落生長情況(觀察結果如下表1所示)，未長出菌落的平板培養基中對應替考拉寧最低作用濃度為抗自身代謝產物替考拉寧最小抑菌濃度，則由表1確定抗替考拉寧最小抑菌濃度為6g/l；表1替考拉寧濃度對菌株fim-68孢子生長的影響替考拉寧(μg/ml)50010002000400060008000菌落生長情況++++++---注:+有菌落生長,-無菌落生長。(6)、將步驟(4)所得誘變孢子懸液進行梯度稀釋，稀釋度分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，選取10-4、10-5、10-6三個稀釋度的孢子懸液，分別塗布於含6g/l替考拉寧的抗性平板上，於30℃避光培養8-15d；(7)、將步驟(6)中各個抗性平板上長出的單菌落轉接斜面培養基上培養10天後，以1％的接種量接種於種子培養基中，於30℃、230r/min條件下培養45-50h後得種子液；以10％的接種量將種子液接種於發酵培養基種，於30℃、230r/min條件下培養5-10d，得發酵液；(8)取步驟(7)中所得發酵液適量，加入等體積的無水乙醇，充分振蕩、靜置、4000r/min離心10min，上清液過有機濾膜後，利用高效液相色譜法測定替考拉寧的產量，通過此方法即篩選出產替考拉寧量最大的菌株，為了方便描述，將篩選所得的菌株命名為菌株fim-68-66，且菌株fim-68-66於甘油中保存。實施例4、菌株fim-68-66的鑑定(1)生理生化特性鑑定：將獲得的菌株fim-68-66在isp-4培養基平板上劃線塗菌並插入蓋玻片，30℃培養7～20d，用光學顯微鏡、透射和掃描電子顯微鏡觀察單菌落的形態特徵及其菌絲，得到該菌株fim-68-66的主要形態及生理生化特性如下：菌體為革蘭氏陽性菌，基內菌絲分枝好，無橫隔；孢囊直接著生在基內菌絲上或孢囊梗上，孢囊梗長2.3～3.0μm，直徑1.5～1.8μm，無橫隔，孢囊呈球形，直徑14～17μm；孢囊內孢子不規則排列，孢子呈圓形或橢圓形，直徑0.5～0.7×1.0～1.3μm，靠極生單鞭毛遊動；在平板上，菌落不規則，中心呈草帽狀突起，表面呈皺褶、粒狀，橘黃色，基內菌絲為褐色，並產褐色可溶性色素，隨著培養時間的延長，菌落由橘黃色變成黃褐色；在蛋白腖-明膠培養基上能液化明膠，水解澱粉能力強，還原硝酸鹽，可分解纖維素，酪氨酸不水解，酪蛋白水解，產生黑色素，牛奶先腖化後微弱凝固；能很好利用阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、澱粉、甘露醇；對乳糖、水楊素、纖維素利用較弱；不能利用鼠李糖、肌醇和棉籽糖。此菌株fim-68-66為高耗氧菌，最適生長溫度為28-32℃，最適生長ph為7.0-7.5；在搖床轉速為210～280r/min，培養5-9d時，替考拉寧產量最高，發酵過程中溶氧對替考拉寧的產生具有顯著作用。(2)分子生物學鑑定：對菌株fim-68-66的16srdna序列進行測序，測得的16srdna序列如seqidno.2所示；將所測的菌株的16srdna序列與genbank資料庫中已有序列進行比對，及進行同源性分析；在lpsn(http://www.bacterio.cict.fr)網站上選取相應的模式株16srrna基因序列，系統進化分析用clustal-x軟體進行比對，生成的比對文件用treecon軟體鄰接法進行系統進化分析，拓撲分析為1000次重複取樣的結果；通過16srdna序列分析表明，菌株fim-68-66與替考遊動放線菌(actinoplanesteichomycoticus)的序列同源性為100％。結合上述形態、生理生化特徵與分子生物學鑑定，最終確定菌株fim-68-66為替考遊動放線菌(actinoplanesteichomycoticus)。實施例5、菌株fim-68-66發酵生產替考拉寧菌株fim-68-66的活化：將採用甘油保存的菌株fim-68-66轉接至斜面培養基上，並於恆溫培養箱中培養8-15天，且培養溫度為30℃；製備種子液：將菌株fim-68-66活化所得的單菌落接種於種子培養基(500ml三角瓶內裝50ml種子培養基)中，於30℃、230r/min條件下培養45-50h，得種子液；發酵培養：將製得的種子液以10％(v/v)接種量接種於發酵培養基(500ml三角瓶內裝50ml發酵培養基)中，於30℃、230r/min條件下發酵培養6d，之後將所得發酵液進行檢測；檢測結果：菌株fim-68-66在發酵培養基上替考拉寧的產量為5800-6035mg/l。實施例6、菌株fim-68-66的遺傳穩定性驗證將經實施例5驗證過的高產替考拉寧的菌株fim-68-66進行500ml搖瓶連續培養3～5代，以檢測其遺傳穩定性，菌株傳代發酵實驗結果如下：對高產抗性發菌株fim-68-66連續傳代5次：f1、f2、f3、f4、f5，經搖瓶發酵後測定發酵效價，以生長良好的原代菌株(f0)為對照，結果見如下表2。表2傳代對菌株fim-68-66產替考拉寧的影響菌株代數f0f1f2f3f4f5相對效價(％)100100.799.898.685.777.2由表2可知，菌株fim-68-66傳三代發酵水平無明顯影響，其產替考拉寧效價基本穩定，維持在同一較高水平；從而表明菌株fim-68-66具有較好的遺傳穩定特性，目標菌種即菌株fim-68-66替考拉寧水平最終維持在5800μg/ml左右，相對於出發菌株即菌株fim-68(2000μg/ml左右)提高了190％左右，所以突變菌株替考遊動放線菌fim-68-66(actinoplanesteichomycoticus)能夠作為進一步研究和開發的生產菌株。另外，需要說明的是，在發明所涉及的各培養基的組分如下：平板培養基、斜面培養基、抗性平板及isp-4培養基的組分均為：可溶性澱粉1％、k2hpo40.1％、mgso4·7h2o0.1％、nacl0.1％、(nh4)2so40.2％、caco30.2％，feso4·7h2o0.0001％、mncl2·7h2o0.0001％、瓊脂1.8％、餘量為蒸餾水補足，ph7.2-8.0，121℃高壓蒸汽滅菌30min；種子培養基的組分為：可溶性澱粉4.0％、黃豆粉2.0％、葡萄糖1.0％、酵母粉0.3％、硫酸鎂0.05％、硫酸銨0.2％、碳酸鈣0.5％、餘量為蒸餾水，ph7.2-8.0，121℃高壓蒸汽滅菌30min；發酵培養基的組分為：可溶性澱粉2.0％、糊精1.0％、葡糖糖0.5％、黃豆粉2.5％、棉籽餅粉1.2％、蛋白腖0.5％、磷酸氫二鉀0.02％、氯化鎂0.04％、硫酸銨0.02％、碳酸鈣0.3％、餘量為蒸餾水，ph7.2-8.0，121℃高壓蒸汽滅菌30min；且在無特殊說明的情形下，本發明中的百分數均為質量百分數。綜上，本發明提供一種替考遊動放線菌fim-68-66(actinoplanesteichomycoticus)，其能夠發酵高產替考拉寧，大幅度提高了替考拉寧的產量，能夠應用於工業化發酵生產；且該菌株fim-68-66穩定性良好，連續傳代三代其產替考拉寧效價基本穩定，維持在同一較高水平，能夠作為進一步研究和開發的生產菌株。sequencelisting福建省微生物研究所一種高產替考拉寧的替考遊動放線菌誘變菌株及其應用100002patentinversion3.511386dna替考遊動放線菌fim-68（actinoplanesteichomycoticus）1tgcagtcgagcggaaggcccttcggggtactcgagcggcgaacgggtgagtaacacgtga60gtaacctgccccagactttgggataaccctcggaaacgggggctaataccggatatgacc120ttcggccgcatggttgttggtggaaagtttttcggtttgggatgggctcgcggcctatca180gcttgttggtggggtgatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcga240ccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaata300ttgcacaatgggcggaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggt360tgtaaacctctttcagcagggacgaagcgtaagtgacggtacctgcagaagaagcgccgg420ccaactacgtgccagcagccgcggtaagacgtagggcgcgagcgttgtccggatttattg480ggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcgcgtcgtctgtgaaaacttggggctcaacccc540aagcttgcagtcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagactggaattcctggtgt600agcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggccg660atactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtcc720acgctgtaaacgttgggcgctaggtgtgggggacctctccggtcttctgcgccgcagcta780acgcattaagcgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgac840gggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttac900ctgggtttgacatcaccgcaaatcttccagagatgggaggtccttcgggggcggtgacag960gtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagc1020gcaaccctcgttcgatgttgccagcgcgttatggcggggactcatcgaagactgccgggg1080tcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgtccagggcttc1140acgcatgctacaatggccggtacaaagggctgcgaaatcgtaaggtggagcgaatcccaa1200aaagccggtctcagttcggatcggggtctgcaactcgaccccgtgaagtcggagtcgcta1260gtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccg1320tcacgtcacgaaagtcggcaacacccgaagccggtggcctaaccccttgtgggagggagc1380cgtcga138621386dna替考遊動放線菌fim-68-66（actinoplanesteichomycoticus）2tgcagtcgagcggaaggcccttcggggtactcgagcggcgaacgggtgagtaacacgtga60gtaacctgccccagactttgggataaccctcggaaacgggggctaataccggatatgacc120ttcggccgcatggttgttggtggaaagtttttcggtttgggatgggctcgcggcctatca180gcttgttggtggggtgatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcga240ccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaata300ttgcacaatgggcggaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggt360tgtaaacctctttcagcagggacgaagcgtaagtgacggtacctgcagaagaagcgccgg420ccaactacgtgccagcagccgcggtaagacgtagggcgcgagcgttgtccggatttattg480ggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcgcgtcgtctgtgaaaacttggggctcaacccc540aagcttgcagtcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagactggaattcctggtgt600agcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggccg660atactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtcc720acgctgtaaacgttgggcgctaggtgtgggggacctctccggtcttctgcgccgcagcta780acgcattaagcgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgac840gggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttac900ctgggtttgacatcaccgcaaatcttccagagatgggaggtccttcgggggcggtgacag960gtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagc1020gcaaccctcgttcgatgttgccagcgcgttatggcggggactcatcgaagactgccgggg1080tcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgtccagggcttc1140acgcatgctacaatggccggtacaaagggctgcgaaatcgtaaggtggagcgaatcccaa1200aaagccggtctcagttcggatc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