一種人肥大細胞羧肽酶hMC－CP的製備方法

2023-12-03 13:55:21 1

專利名稱：一種人肥大細胞羧肽酶hMC－CP的製備方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地說是一種人肥大細胞羧肽酶hMC-CP的製備方法。
背景技術：
變態反應疾病的發生極為廣泛，其發病率約佔全球人口的25％，其中我國的發病率也在20％以上，而發達國家的發病率更高(約為30％)。無論在國外或國內，變態反應疾病均列為多發病，呈逐年增高之勢，增長率約為1％(J Allergy Clin Immunol，2002，110341-348；Curr Opin Immunol，2001，13701-708)，其對人民的健康造成極大威脅。
肥大細胞是變態反應發生的始動效應細胞，其炎性介質在變態反應性疾病中起重要作用。肥大細胞炎性介質有多種，蛋白酶是其中的一類重要介質，主要以中性蛋白酶為主，約佔肥大細胞蛋白總量的50％，它不僅在變態反應性疾病中起重要的病理生理作用，同時也是肥大細胞活化和脫顆粒的標誌，作為一類特異的蛋白酶，是變態反應性疾病的體外診斷指標和治療靶位。hMC-CP是重要的中性蛋白酶之一，hMC-CP的生物學功能尚不清楚。hMC-CP在肥大細胞內與肝素及蛋白聚糖形成分子量約400-560kDa的大分子複合物(JImmunol，1992，1482475-2482)，其分離純化工作極為困難。另外，hMC-CP的分離純化需用大量的新鮮人體組織作提取材料，但材料難得，來源有限，使得天然hMC-CP難於獲取。所以，hMC-CP的獲取成為hMC-CP生物學功能研究是否順利進行下去的一個關鍵瓶頸。

發明內容
本發明的目的在於提供一種採用基因工程方法製備人肥大細胞羧肽酶hMC-CP的方法。
本發明的人肥大細胞羧肽酶hMC-CP的製備方法，是採用基因工程方法製備人肥大細胞羧肽酶hMC-CP，其具體步驟為(1)提取人皮膚組織的總RNA；(2)引物合成引物15′-GCTGAATTCATCCCAGGCAGGCACAGCTAC-3′，引物25′-TACGCGGCCGC TTAGGAAGTATGCTTGAGGATATAC-3′；(3)以上述提取的總RNA為模板和合成的引物進行RT-PCR擴增人肥大細胞羧肽酶hMC-CP的cDNA；(4)將hMC-CP cDNA與pGEM-T載體連接，構建重組克隆質粒pGEM/hMC-CP；(5)將用EcoRI和NotI酶切重組質粒pGEM/hMC-CP得到的含有hMC-CP cDNA的片斷與同樣酶切處理的pPIC9K載體連接，構建重組表達載體pPIC9K/hMC-CP；(6)重組表達質粒pPIC9K/hMC-CP轉化宿主菌；(7)誘導重組宿主菌表達人肥大細胞羧酶hMC-CP。
上述的RT-PCR擴增的反應條件為94℃變性30s、55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環後於72℃延伸10min。
上述步驟(4)為用T4DNA連接酶連接hMC-CP cDNA與pGEM-T載體，構建重組克隆質粒pGEM/hMC-CP。
上述步驟(6)為先用BglII酶切質粒pPIC9K/hMC-CP，再轉化宿主菌。
上述的宿主菌為GS115酵母菌。
上述步驟(7)是用甲醇誘導重組宿主菌表達人肥大細胞羧酶hMC-CP。
本發明的有益效果hMC-CP在肥大細胞內與肝素及蛋白聚糖形成大分子複合物，其分離純化工作極為困難。另外，hMC-CP的分離純化需用大量的新鮮人體組織作提取材料，但材料難得，來源有限，使得天然hMC-CP難於獲取。本發明採用基因工程的方法來製備人肥大細胞羧肽酶hMC-CP，克服了以上種種問題，具有方法簡便，成本低，適於產業化的特點，對hMC-CP的後續生物學研究具有深遠的意義。


圖1是以RT-PCR技術從人皮膚組織中擴增hMC-CP的瓊脂糖凝膠電泳分析圖；圖2為pPIC9K/hMC-CP表達載體的構建圖；圖3是重組hMC-CP基因表達產物的SDS-PAGE電泳分析圖及western blot檢測分析圖；圖4是hMC-CP的酶活動力學檢測分析圖；
其中，圖1中，1為Marker，2為PCR產物；圖3中，1、2、3、4分別用1％的甲醇分別誘導0h、24h、48h、72h的表達上清的SDS-PAGE電泳分析；圖4中，左為重組產物上清，右為陽性對照。
具體實施例方式
實施例1(1)總RNA的提取用適量的人皮膚組織，按Invitrogen公司試劑盒的說明書進行人皮膚組織總RNA的提取。
(2)引物的合成用ABI DNA自動合成儀合成如下引物。
引物15′-GCTGAATTCATCCCAGGCAGGCACAGCTAC-3′(含EcoRI酶切位點)；引物25′-TACGCGGCCGC TTAGGAAGTATGCTTGAGGATATAC-3′(含NotI酶切位點和終止子)。
(3)hMC-CP cDNA的製備利用上述總RNA和引物RT-PCR擴增hMC-CP cDNA。反轉錄體系20μL，加入2μL 10×RT Buffer，4μL dNTPs(2.5mM)，0.5μLrRNasin(40u/μL)，2μL AMV反轉錄酶(25u/μL)，2μL引物oligo(dT)。42℃溫浴60min，95℃加熱10min，滅活反轉錄酶。在PCR擴增的50μL體系中，加入2μL cDNA，引物(10μmol/L)各1μL、5μL的10×Buffer、4μL dNTP(2.5mM)及0.5μL Taq酶(5U/μL)，混勻後進行PCR擴增。PCR條件設定94℃變性30s、55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環後於72℃延伸10min。PCR產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖1所示，1為DNA Marker，2為PCR產物。
(4)PCR產物與pGEM-T載體連接按DNA快速純化回收試劑盒回收PCR產物，與pGEM-T載體連接，20μL連接體系中，加入50ng載體，50ngPCR產物，2μL 10×Buffer，1U T4DNA連接酶，4℃過夜，以構建重組克隆質粒pGEM/hMC-CP。
(5)連接產物轉化DH5α感受態菌連接產物轉化DH5α感受態菌按照《分子克隆》實驗手冊(科學出版社，1999)進行操作，37℃培養過夜後挑取白色菌落進行培養，提取重組質粒進行酶切初步鑑定，用美國ABI DNA自動測序儀測序，結果與文獻報導一致。
(6)表達質粒的構建EcoRI和NotI酶切重組質粒重得到的所需片斷與同樣酶切處理的pPIC9K載體連接，構建表達載體pPIC9K/hMC-CP，如圖2所示。轉化DH5α感受態菌，培養後，挑選連接成功的陽性克隆，提取pPIC9K/hMC-CP質粒。
(7)表達質粒轉化GS115感受態酵母菌純化的質粒pPIC9K/hMC-CP用BglII進行酶切處理，使其線性化，回收，轉化GS115感受態酵母菌。用Bio-Rad Gene Pulser電轉儀於1500V、25μF和200Ω條件下進行電轉化。轉完畢立即加入1mL預冷1M山梨醇。將菌液鋪500μl至MD/-His(1.34％YNB、4×10-5％生物素、1％甲醇、2％葡萄糖及1.5％瓊脂)選擇平板上。將平板置30℃培養箱孵育3d，觀察轉化子的生長。
(8)多拷貝整合轉化子的篩選將His+選轉化子分別對應地點在逐步增高G418(0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0及4.0g/L)的YPD平板上，於30℃孵育3d，篩選具有高G418抗性、且生長良好的菌株作為表達株。
(9)重組酵母克隆的鑑定PCR檢測重組酵母克隆的鑑定用PCR檢測法進行鑑定。取菌落少計懸浮於50μl無菌水中，將菌液置於液氮中1min，然後沸水煮10min，離心後取上清，加入0.5倍體積的7.5M NH4Ac(pH7.5)和2倍體積的無水乙醇，混勻後在-20℃放置30min。4℃，12000r/min離心5min，吹乾沉澱，並溶於10μL無菌水中，取5μL作模板DNA進行PCR檢測，取前述的引物1和引物2各2μL，加入4μL 2.5mM dNTP，0.5μL Taq酶，加水補齊反應體積至50μL。擴增條件為94℃變性30s、57℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環後於72℃延伸10min。經證實的高拷貝轉化子用於下一步的誘導表達。
(10)誘導表達接種經篩選的陽性轉化子於100mlBMGY培養基中，於30℃振蕩培養至培養物OD到4左右，3000g×5min離心，去上清收集細胞，加20mlBMMY培養基，置於30℃振蕩培養。每24h加入100％甲醇至終濃度為1％，維持誘導，連續培養4d。12000g×15min離心收集上清。
(11)SDS-PAGE與表達產物的免疫學測定(Western blot)用SDS-PAGE凝膠分離蛋白質，濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為15％。轉膜採用電轉裝置，電壓40V，轉移4h。電轉緩衝液48mmol/LTris鹼，29mmol/L甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇。轉移後的硝酸纖維膜用3％BSA封閉4h，再與適當稀釋的抗hMC-CP單克隆抗體37℃作用2h，洗滌後用DAB顯色，PBS終止反應。如圖3所示，左為SDS-PAGE電泳分析圖，右為Western blot，lane1、2、3、4分別用1％的甲醇分別誘導0h、24h、48h、72h的表達上清。Westernblot顯示誘導48h時的表達量較高。
(12)表達產物的酶活性測定hMC-CP的酶活鑑定採用分光光度計法。方法是用分光光度計測定hMC-CP水解合成肽底物hippurl-L-phenlalanine時在波長為254nm時每分鐘所增加的吸光度的速率。反應時底物濃度為1mM，緩衝液為50mM Tris-HCl(含500mM NaCl，Ph＝7.5)。單位定義在25℃和pH＝7.5的條件下，1分鐘水解1μg底物hippurl-L-phenlalanine定義為1U。反應時在90μL底溶液中加入10μL的待測表達上清液，反應時底物濃度為1mM，以牛胰腺羧肽酶(51U/mg)作為陽性參照，以未帶有pPIC9K/hMC-CP表達載體酵母菌培養物上清為陰性對照。結果顯示陰性對照未見有酶活性，重組產物上清和陽性對照表現出明顯的酶活性。
權利要求
1.一種人肥大細胞羧肽酶hMC-CP的製備方法，其特徵在於採用基因工程方法製備人肥大細胞羧肽酶hMC-CP。
2.根據權利要求1所述的人肥大細胞羧肽酶hMC-CP的製備方法，其特徵在於所述基因工程方法的步驟為(1)提取人皮膚組織的總RNA；(2)引物合成引物15′-GCTGAATTCATCCCAGGCAGGCACAGCTAC-3′，引物25′-TACGCGGCCGC TTAGGAAGTATGCTTGAGGATATAC-3′；(3)以上述提取的總RNA為模板和合成的引物進行RT-PCR擴增人肥大細胞羧肽酶hMC-CP的cDNA；(4)將hMC-CPcDNA與pGEM-T載體連接，構建重組克隆質粒pGEM/hMC-CP；(5)將用EcoRI和NotI酶切重組質粒pGEM/hMC-CP得到的含有hMC-CPcDNA的片斷與同樣酶切處理的pPIC9K載體連接，構建重組表達載體pPIC9K/hMC-CP；(6)重組表達質粒pPIC9K/hMC-CP轉化宿主菌；(7)誘導重組宿主菌表達人肥大細胞羧肽酶hMC-CP。
3.根據權利要求2所述的人肥大細胞羧肽酶hMC-CP的製備方法，其特徵在於步驟(3)所述的RT-PCR擴增的反應條件為94℃變性30s、55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環後於72℃延伸10min。
4.根據權利要求2所述的人肥大細胞羧肽酶hMC-CP的製備方法，其特徵在於步驟(4)為用T4DNA連接酶連接hMC-CP cDNA與pGEM-T載體，構建重組克隆質粒pGEM/hMC-CP。
5.根據權利要求2所述的人肥大細胞羧酶hMC-CP的製備方法，其特徵在於步驟(6)為先用BglII酶切質粒pPIC9K/hMC-CP，再轉化宿主菌。
6.根據權利要求2所述的人肥大細胞羧肽酶hMC-CP的製備方法，其特徵在於步驟(6)所述的宿主菌為酵母菌。
7.根據權利要求6所述的人肥大細胞羧肽酶hMC-CP的製備方法，其特徵在於所述的酵母菌為GS115酵母菌。
8.根據權利要求2所述的人肥大細胞羧肽酶hMC-CP的製備方法，其特徵在於步驟(7)是用甲醇誘導重組宿主菌表達人肥大細胞羧肽酶hMC-CP。
全文摘要
本發明公開了一種人肥大細胞羧酶hMC－CP的製備方法。hMC－CP在肥大細胞內與肝素及蛋白聚糖形成大分子複合物，其分離純化工作極為困難。另外，hMC－CP的分離純化需用大量的新鮮人體組織作提取材料，但材料難得，來源有限，使得天然hMC－CP難於獲取。本發明採用基因工程的方法來製備人肥大細胞羧酶hMC－CP，克服了以上種種問題，具有方法簡便，成本低，適於產業化的特點。對hMC－CP的後續生物學研究具有深遠的意義。
文檔編號C12N9/48GK1644688SQ20041005237
公開日2005年7月27日 申請日期2004年11月25日 優先權日2004年11月25日
發明者何韶衡, 陳章權 申請人:汕頭大學醫學院