一種免疫抑制藥物及其製備方法和應用的製作方法

2023-12-03 11:59:06 5

專利名稱：一種免疫抑制藥物及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬製藥領域，具體涉及一種以去甲澤拉木醛為有效成分的免疫抑制藥物及其製備方法以及由其製劑在器官移植後抗排斥反應及治療某些自身免疫性疾病的應用。
已有研究從植物雷公藤中分離到一種淡黃色結晶物質，其分子量為480，熔點為260℃(分解)，分子式為C29H36O6的酚性去甲基三萜化合物，其英文名稱為demethylzeylasteral(簡稱Dzy，T-96，TZ-93)，定名去甲澤拉木醛。其化學結構式如下所表示
本發明藥物按下述步驟進行製備1.原料藥去甲澤拉木醛的提取工藝過程包括雷公藤原料的乾燥、粉碎、有機溶劑的提取，有機溶劑的回收，用矽膠分離，單體化合物的鑑定。其特徵是將經乾燥並粉碎藥材，置回流鍋內，加入1-3倍的乙酸乙酯，加熱回流3小時，重複2次，得乙酸乙酯提取液，回收溶媒，得幹浸膏，得率為8.25％，取浸膏5-10倍量的矽膠進行柱層析，採用正己烷/丙酮梯度洗脫，得到去甲澤拉木醛淡黃色結晶物質。2.去甲澤拉木醛製劑的製備1)由去甲澤拉木醛原料藥製備去甲澤拉木醛緩釋膠囊的工藝如下將硬脂醇在水浴上加熱熔融，加入去甲澤拉木醛攪勻，冷後，研碎，加羥丙甲纖維素凝膠製成軟材，制粒，乾燥，整粒，裝入膠囊即得。
2)由去甲澤拉木醛原料藥製備去甲澤拉木醛軟膠囊的工藝如下去甲澤拉木醛與少量植物油混合，待分散均勻後加入餘量植物油混溶，得藥液。另配明膠液，其中明膠100份，甘油55份，水100份備用，採用滴製法，製得去甲澤拉木醛軟膠囊。
3)由去甲澤拉木醛原料藥製備去甲澤拉木醛的注射劑工藝如下去甲澤拉木醛加適量乙醇和丙二醇研勻，分次加入水混合，微孔濾膜過濾，分裝玻璃安瓿中，滅菌，即得。
4)由去甲澤拉木醛原料藥製備去甲澤拉木醛的軟膏劑工藝如下取單甘酯，十八醇和液狀石蠟加熱使熔融。另取去甲澤拉木醛10倍量的氯仿和等量的甲醇，加入到去甲澤拉木醛中，使溶解，再緩緩加入上述已熔融的藥液中，溫度在80℃，不斷攪拌，使均勻。另將尼泊金乙酯、十二烷基流酸鈉、甘油和水混合後在直火加熱至90℃時全部溶解，待溫度至80℃時與上述藥液在不停攪伴的情況下，緩緩加入完，再繼續不停攪伴直至冷成稠膏狀，加入適量阿唑蒽，攪勻即得。
本發明對原料藥去甲澤拉木醛進行了藥效及毒理實驗，結果如下(一)藥效結果1、去甲澤拉木醛在體外對免疫抑制的實驗研究1)、去甲澤拉木醛對脾細胞在絲裂原刺激下轉化的抑制作用取BALB/c小鼠脾臟製成脾細胞懸液，在含有10％小牛血清的RPMI-1640培養液中孵育，加入不同濃度的去甲澤拉木醛、環胞素A(CsA)和雷公藤多甙(TII)，分別在ConA和PHA有絲分裂原刺激下，應用MTT方法測定脾細胞的轉化情況，了解去甲澤拉木醛對脾細胞轉化的抑制程度。
結果對脾細胞轉化的抑制作用在加入濃度為0.125、0.25μg/ml去甲澤拉木醛時，無論是ConA還是PHA刺激，其0D值與未加去甲澤拉木醛的相當(P＞0.05)，而在濃度為0.5μg/ml和1.0μg/ml的去甲澤拉木醛中，OD值明顯下降，與未加去甲澤拉木醛比較有顯著性差異(P＜0.001)，顯示去甲澤拉木醛對ConA、PHA誘導的脾細胞轉化有明顯的抑制作用。其中加0.5μg/ml去甲澤拉木醛的0D值比加入1μg/ml的TII的OD值更小(p＜0.05)，與加入1μg/ml的CsA時OD值無差異(p＞0.05)，說明去甲澤拉木醛的抑制作用比TII強，且達到一定濃度時與CsA的抑制作用相當。
2)、去甲澤拉木醛對混合淋巴細胞培養的抑制試驗取C57BL/6小鼠脾細胞與滅活的BALB/c小鼠脾細胞混合，在RPMI-1640培養液中孵育，並分別加不同濃度的去甲澤拉木醛、CsA或TII，在終止培養前4h加入1μci3H-TdR，將細胞收集於玻璃纖維濾紙上，在β液閃爍計數儀上測定dpm值，觀察脾細胞轉化情況，了解去甲澤拉木醛、TII與CsA對脾細胞轉化的抑制程度。
結果混合脾細胞轉化的抑制作用與絲裂原刺激脾細胞轉化的試驗研究相似，本試驗加入不同濃度的去甲澤拉木醛、TII或CsA均顯示對脾細胞轉化有抑制作用，不同濃度抑制強度不一。加入1μg/ml濃度的去甲澤拉木醛對混合脾細胞轉化抑制作用特別強。3)、去甲澤拉木醛對誘生IL-2抑制作用的試驗.
取BALB/c小鼠脾製成脾細胞懸液，在RPMI-1640培養液中孵育，不加或加ConA刺激觀察細胞生成IL-2，並加不同濃度的去甲澤拉木醛、TII或CsA，取上清液為待測樣本。用依賴IL-2的CTLL-2細胞和已製備的待測樣本在RPMI-1640培養液中培養，用MTT方法測定CTLL-2的轉化，以標準的rIL-2結果計算樣本的IL-2活性。
結果去甲澤拉木醛對淋巴細胞生成IL-2的抑制作用在對淋巴細胞的培養中，不加ConA刺激，成熟的淋巴細胞也生成並釋放IL-2，其釋放量較低。不加抑制藥時，在12小時、24小時和36小時培養時間，IL-2的釋放量分別是7.50±0.26、2.43±0.12和2.37±0.007u/ml，其中12小時與另兩個時間組比較有明顯差異(p＜0.001)，顯示淋巴細胞釋放的IL-2活性以培養12小時最高，去甲澤拉木醛、TII和CsA對成熟淋巴細胞釋放的IL-2無影響，證實去甲澤拉木醛無直接的殺傷細胞作用。在培養的淋巴細胞中，加入有絲分裂原ConA後，IL-2的活性顯著增高，在不加抑制劑的樣本中，其在培養12小時、24小時和36小時中IL-2量分別為48.75±3.14、45.33±2.24和27.37±1.16U/ml，36小時較1 2小時為低(p＜0.05)。在加入去甲澤拉木醛藥後，培養12小時去甲澤拉木醛濃度為1μg/ml時，IL-2的抑制十分顯著(12.36±2.39U/ml)，與對照樣本(48.75±3.14U/ml)比較有顯著差別(p＜0.001)，與1μg/ml濃度的TII樣本(43.17±2.65U/ml)比較，去甲澤拉木醛樣本內IL-2明顯低於TII樣本，提示去甲澤拉木醛較TII的抑制作用強(p＜0.001)；與各濃度的CsA抑制作用比較，去甲澤拉木醛的抑制作用不及CsA作用強，CsA在0.25、0.5、1μg/ml時的IL-2活性分別是10.17±1.59、8.70±0.46、5.37±0.70u/ml，均有顯著性抑制，其IL-2的生成量較1μg/ml濃度的去甲澤拉木醛均低。值得提出的是與CsA和對照樣本比較，IL-2活性應隨12小時、24小時、36小時時間的延長而逐漸消耗減少，但在有去甲澤拉木醛的樣本內培養12小時至36小時，IL-2活性並未見減低的趨勢，提示去甲澤拉木醛除有抑制IL-2生成外，還有抑制IL-2受體活性的作用，而減少IL-2的消耗。
4)、去甲澤拉木醛對重組IL-2促進CTLL-2細胞增殖的抑制作用在依賴IL-2的CTLL-2細胞懸液中加入不同濃度的去甲澤拉木醛、TII、CsA，並加rIL-2使CTLL-2轉化，用MTT方法測定OD值，了解去甲澤拉木醛對rIL-2促CTLL-2細胞轉化的抑制作用。
結果在培養的依賴IL-2的CTLL-2細胞中加入rIL-2，空白OD值為0.154±0.013，當加入0.5μg/ml和1μg/ml濃度的去甲澤拉木醛後，其OD值明顯下降，分別為0.024±0.001和0.014±0.003，提示去甲澤拉木醛有抑制IL-2受體活性的作用(p＜0.001)。在0.5μg/ml和1μg/ml濃度的TII組中，其OD值與對照組比較也有小幅下降(P＜0.05和P＜0.01)，但不及去甲澤拉木醛強。各濃度的CsA OD值均與空白樣本相當(p＞0.05)，表明CsA對IL-2受體活性無影響。
上述實驗結果證實去甲澤拉木醛對有絲分裂原ConA或PHA以及異體MHC抗原刺激小鼠脾細胞的轉化有明確的抑制作用，去甲澤拉木醛抑制免疫反應的作用比TII的作用更強，在達到一定濃度時，其抑制作用的強度甚至與CsA相當。去甲澤拉木醛不僅有抑制脾淋巴細胞生成或釋放IL-2的作用，還有對IL-2受體活性的抑制作用。
2、去甲澤拉木醛對大鼠原位腎移植模型的實驗研究1)、建立大鼠原位腎移植研究模型採用250-300g體重，雄性Wistar和SD大鼠作為腎移植的供、受體鼠。暴露供體大鼠的左腎並在手術顯微鏡下解剖游離左腎動靜脈、輸尿管上段，阻斷左腎血管的上下腹主動脈，經腹主動脈對左腎灌注0～4℃的腎保存液8ml，切取左腎並修整左腎血管和輸尿管。充分暴露受體大鼠的左側腎臟，在手術顯微鏡下游離左腎及血管、輸尿管上段，緊靠腹主動脈阻斷腎動脈、靜脈，橫斷動靜脈及輸尿管上段切除左腎，殘端血管肝素鹽水衝洗，分別間斷端端吻合供腎動脈與受體腎動脈，兩定點連續端端縫合腎靜脈，開放血管見腎血供良好、顏色紅潤、輸尿管流尿，輸尿管與輸尿管上段間斷縫合，切除右腎。術畢大鼠保溫直到甦醒。結果經本方法建立的大鼠腎移植模型的成功率較高，可達80％的成功率，手術成功的大鼠排洩性尿路造影見移植腎功能好，排洩通暢，無明顯尿路梗阻。血BUN、Cr檢查正常範圍。與術前自身的BUN、Cr比較，t檢驗P＞0.05，差別無顯著性，提示腎功能良好。手術3天移植腎切取做病理觀察，鏡下腎組織有少量淋巴細胞浸潤，腎小球及腎小管完好。結論在手術顯微鏡下建立左腎原位大鼠腎移植模型，能達到腎功能正常的要求。
2)、去甲澤拉木醛與TII抑制大鼠移植腎排斥作用的比較研究雄性Wistar、SD大鼠為供、受體，行腎移植大鼠70隻，隨機分為7個組，每組8隻，其一為對照組。每組另有2隻預備在14天時處死。對照組每天每隻鼠生理鹽水4ml灌胃，去甲澤拉木醛用藥三個組分別每天每鼠灌4ml內含5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg的去甲澤拉木醛藥液，TII分三個組，分別每天每鼠灌胃4ml內含20mg/kg、40mg/kg和60mg/kg藥液。灌胃時間為每天至死亡或14天。觀察大鼠活動和進食情況，用藥前及用藥14天各取血一次檢查血紅蛋白、肝功能情況，用藥14天處死1隻或死亡時取腸、肝、腎行病理組織學檢查。分別記錄各組大鼠存活天數。
結果去甲澤拉木醛用藥5mg/kg大鼠平均存活時間為7.1±0.65天，與對照組6.9±0.64天比較無顯著性差異(P＞0.05)，提示去甲澤拉木醛5mg/kg對大鼠移植腎排斥無抑制作用；去甲澤拉木醛用10mg/kg和20mg/kg時，其平均生存期提高到14.7±1.04天和18.0±1.51天，與對照組比較差異顯著(p＜0.001)，表明此兩個劑量去甲澤拉木醛對大鼠移植腎存活有延長作用。其兩組間比較20mg/kg組較10mg/kg組存活期長。與TII用藥組比較，去甲澤拉木醛10mg/kg存活期與TII 40mg/kg和60mg/kg的存活期相當(p＞0.05)，但去甲澤拉木醛20mg/kg的存活期較TII任何一組都長(p＜0.01)。組織病理學檢查對照組死亡鼠腎臟表現為典型及嚴重的急性排斥反應，去甲澤拉木醛5mg/kg組與TII 20mg/kg組的移植腎改變與對照組相似。去甲澤拉木醛10mg/kg組與TII 40mg/kg和60mg/kg組，在14天移植腎組織中見較多的淋巴細胞，已有排斥反應出現，只有去甲澤拉木醛20mg/kg組14天時腎組織中僅見少量淋巴細胞浸潤，未見有明顯的排異徵象。小腸和肝組織檢查未見異常。用藥前和用藥14天的血紅蛋白、ALT、TP檢查差別無顯著性(p＞0.05)。
結論去甲澤拉木醛給藥對大鼠移植腎的排斥有確切的抑制作用，其作用強度與劑量呈正相關。，10mg/kg和20mg/kg用藥14天均能顯著延長移植腎的存活，但以20mg/kg組更為理想，與TII用藥組比較，去甲澤拉木醛20mg/kg作用要強。去甲澤拉木醛20mg/kg給藥14天尚不至於對大鼠造成毒性副作用。3)、去甲澤拉木醛與CsA抑制大鼠移植腎排斥作用的比較研究以雄性Wistar、SD大鼠為供、受體，行腎移植大鼠80隻，隨機分為8組，每組8隻。每組另有2隻預備在14天時處死。各組分別給予4ml含Pred 10mg/kg、去甲澤拉木醛10mg/kg、去甲澤拉木醛20mg/kg、去甲澤拉木醛10mg/kg+Pred 10mg/kg、CsA 5mg/kg、CsA10mg/kg和CsA 10mg/kg+Pred 10mg/kg藥液，每鼠每天灌胃一次至死亡或14天。同時觀察記錄各組大鼠的生存天數，取死亡鼠或14天處死預備大鼠取小腸、肝、腎等做組織病理切片檢查，以及用藥前和14天時的血紅蛋白、ATL、TP檢查。
結果單用去甲澤拉木醛兩個劑量組(10mg/kg和20mg/kg)均能顯著延長大鼠的存活時間，與對照組比較均有明顯差異(p＜0.01)。其中10mg/kg組存活時間與單用CsA的5mg/kg劑量組相當，差別無顯著性(p＞0.05)。單用強的松10mg/kg預防大鼠移植腎排斥幾乎無作用，其平均生存期與對照組比較差別無顯著性意義(p＞0.05)。但去甲澤拉木醛10mg/kg與Pred 10mg/kg合用卻能延長大鼠的生存期至31.75±6.48天。用藥14天時的移植腎在去甲澤拉木醛20mg/kg、CsA10mg/kg組及兩個聯合用藥組，腎病理檢查無明顯病變，而其他組已有不同程度的排斥徵象如淋巴細胞浸潤。各組在用藥14天的血紅蛋白、ALT、TP檢查無異常，14天時取肝、小腸做病理檢查也未見異常。
結論證實去甲澤拉木醛具有較強的免疫抑制作用，單獨應用10mg/kg或20mg/kg能顯著地延長大鼠移植腎的存活時間，存活時間在一定範圍內隨劑量加大而延長。單獨應用Pred 10mg/kg對腎移植大鼠存活期無延長作用，但與去甲澤拉木醛10mg/kg合用，卻能成倍地延長單用同劑量的去甲澤拉木醛的大鼠存活時間，在短時間內應用適當劑量的去甲澤拉木醛，不會出現可見的毒性副作用。(二)、毒理實驗結果1、急性毒性試驗取雌雄小鼠體重為18～22g，各30隻，隨機分為6組，每組雌雄小鼠各5隻，各組分別按192mg/kg、240mg/kg、300mg/kg、375mg/kg和468mg/kg給每隻小鼠去甲澤拉木醛一次灌胃，對照組給生理鹽水，容積為0.8-0.9ml，觀察小鼠死亡情況，求LD50值，並取臟器病理檢查。
結果去甲澤拉木醛的LD50為286.135mg/kg。LD50的95％可信限283.92-288.39mg/kg。去甲澤拉木醛的主要毒性器官是腸道和肝。
2、亞急性毒性試驗取小鼠40隻，隨機分為4個組，每組10隻，雌雄各半。分別給予各組按生理鹽水、去甲澤拉木醛10mg、20mg、和80mg/kg，給每隻小鼠每天灌胃一次，共14天，容積為0.8ml，觀察小鼠活動、飲食、體重、血常規、血生化和臟器的病理檢查。
結果去甲澤拉木醛每天80mg/kg給藥時，初始可造成小鼠厭食，體重下降，可能與進食減少有關。80mg/kg組用藥14天，血紅蛋白和WBC有一定下降，肝功能檢查及病理檢查提示80mg/kg對肝臟有輕度的毒性作用，小腸黏膜絨毛輕度腫脹，固有膜內少量炎症細胞浸潤，而10mg和20mg/kg組未見有上述病變。
毒理研究證明去甲澤拉木醛與目前雷公藤中提到的主要成分相比，如雷公藤多甙(TII)小鼠口服LD50為159.70mg/kg，腹腔注射為93.99mg/kg；雷公藤甲素(雷公藤內酯醇)小鼠腹腔注射的LD50為0.9mg/kg；雷公藤紅素是10.9mg/kg；而去甲澤拉木醛的小鼠口服LD50為286.135mg/kg，毒性明顯低於這些化合物。
本發明免疫抑制藥物毒性副作用極少、來源廣泛、生產成本低，價格便宜、應用方便，還可用於治療臨床其他自身免疫性疾病如紅斑狼瘡等。
權利要求
1.種免疫抑制藥物，其特徵是含有有效劑量的去甲澤拉木醛和藥學上可接受的賦形劑。2、根據權利要求1所述的免疫抑制藥物，其特徵是所述的去甲澤拉木醛和賦形劑配比是1∶20-300。3、根據權利要求1和2所述的免疫抑制藥物，其特徵是可製成緩釋膠囊、軟膠囊，注射劑和軟膏劑。4、根據權利要求3所述的藥物，其特徵是去甲澤拉木醛的含量是a、緩釋膠囊每粒在10-30mg，，b、軟膠囊每粒在10-20mg，，c、注射劑每ml在1-5mg，，d、軟膏劑為0.15-3％。5、根據權利要求1所述的免疫抑制藥物的製備方法，其中所述的去甲澤拉木醛是由下列方法得到雷公藤根皮經乾燥並粉碎處理，向已處理的原料中加入乙酸乙酯，，加熱回流，得提取液，回收溶媒，得幹浸膏，進行矽膠柱層析，用正己烷/丙酮梯度洗脫，得淡黃色粉狀物--去甲澤拉木醛原料藥。6、根據權利要求5所述的製備方法，其中所述的乙酸乙酯加入量為原料的1-3倍，所述的矽膠加入量為浸膏的5-10倍量。
全文摘要
本發明屬製藥領域,具體涉及一種從雷公藤中提取得到單體化合物去甲澤拉木醛,以其為有效成分的免疫抑制藥物及其製備方法。本發明單體化合物去甲澤拉木醛可作為藥物原料製成口服緩釋製劑、軟膠囊、注射劑、軟膏劑等。本發明免疫抑制藥物毒性副作用極少、來源廣泛、生產成本低,價格便宜、應用方便,本發明藥物用於器官移植後抗排斥反應效果明顯,還可用於治療臨床其他自身免疫性疾病如紅斑狼瘡等。
文檔編號C07J63/00GK1369266SQ0211082
公開日2002年9月18日 申請日期2002年2月8日 優先權日2002年2月8日
發明者楊春欣, 林宗明 申請人:復旦大學附屬中山醫院