一株青春雙歧桿菌菌株的製作方法
2023-11-12 05:55:17 1
專利名稱：一株青春雙歧桿菌菌株的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株青春雙歧桿菌及其作為工作菌株在食品中樂果殘留篩檢的應用。
背景技術：
樂果是一種高效中等毒性的有機磷農藥，化學名為0，0- 二甲基-S_(N-甲基氨基甲醯甲基)二硫代磷酸酯(C6H12NO3PS2),因其見效快、價格低廉等優勢，已在我國廣泛用於蔬菜水果等農作物的殺蟲、殺菌及殺蟎。但樂果的過量使用，使其在蔬菜水果中高殘留，給人們的健康帶來巨大的威脅，因此我國已限量使用。2005年1月中華人民共和國衛生部和中國國家標準化管理委員會發布 GB2763-2005規定在葉菜類蔬菜的最大殘留限量(maximum residue limits, MRL)為lmg/ kg,梨果類水果MRL為lmg/kg，核果類水果MRL為ang/kg，柑橘類水果MRL為ang/kg，並將檢測食品中樂果殘留量列為殘留監控重點。目前，測定樂果的方法主要有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、化學發光法、酶抑制法、毛細管電泳技術(CE)等。用上述方法檢測存在儀器設備複雜、樣本前處理和測定操作繁瑣的缺陷，不適合大量樣本篩檢，而且費用高昂，使其推廣使用受到限制。微生物法突出優點是簡便而經濟，不需要複雜的儀器設備，在一般的實驗條件下就可以進行，可以對大量樣本進行快速初篩。但是，工作菌株對待測物質的敏感性和特異性高低是影響微生物法準確度和精密度的最關鍵問題。迄今為止，尚無篩選出對樂果農藥敏感性高、特異性高的雙歧桿菌工作菌株及其在食品中樂果殘留篩檢應用的相關報導。
發明內容
本發明目的是提供一株對樂果敏感性高的雙歧桿菌。本發明的雙歧桿菌是青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis) LJM-OOICGMCC No. 4090。本發明的青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)LJM-001,已於 2010 年 8月17日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)，保藏編號為 CGMCC No. 4090。本發明的青春雙歧桿菌LJM-001分離於一名浙江省健康青年人糞便中。本發明的青春雙歧桿菌LJM-001具有下述微生物學特徵(1)菌落形態呈淡黃色或乳白色，中央隆起，邊緣整齊，圓形，光滑，直徑1 2mm 大小。(2)個體形態為不規則G+無芽孢桿菌，菌體呈杆狀，稍彎曲，有的呈V型，少量呈 Y型，兩端著色深。(3)生理生化特徵:D_核糖(+) ；L-阿拉伯糖(+)；乳糖(+)；纖維二糖(+)；松三糖⑴；棉籽糖⑴；山梨醇⑴；澱粉⑴；葡萄糖⑴；木糖⑴；甘露糖⑴；果糖⑴；半乳糖⑴；麥芽糖⑴；海藻糖⑴；密二糖⑴；甘露醇⑴；水楊苷⑴；硝酸鹽還原㈠； 觸酶(「)；精氨酸水解試驗(「)；明膠液化反應試驗(「)；吲哚試驗(「)；F6PPK Bl (+)。厭氧下生長良好，有氧環境中不生長。最適生長溫度37 41°C ；最低生長溫度 25 ；最高43 45°C ；生長最適pH 6. 5 7. 0 ；pH4. 5 5. 0或8. 0 8. 5不生長。本發明的青春雙歧桿菌LJM-001與同屬同種標準菌株相比對樂果敏感性提高了 100倍以上。本發明的另一目的是建立一種應用青春雙歧桿菌LJM-001作為工作菌株篩檢食品樂果殘留的微生物法。本發明篩檢食品樂果殘留的原理是基於樂果對其敏感的青春雙歧桿菌LJM-001 具有明顯的抑制作用，將食品樣品點樣雙歧桿菌菌層篩檢培養基上，厭氧培養18-24小時後，測定其形成的抑菌圈，根據抑菌圈的大小即可判定待測食品樣品中樂果殘留量是否合格。本發明利用青春雙歧桿菌LJM-001作為工作菌株篩檢食品樂果殘留的微生物法， 包括步驟1、篩檢培養基製備蛋白腖10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g， K2HPO4 2g，MgSO4 · 7 H2O 0. 5g，MnSO4 · 4H20 0. 2g，低聚果糖 3g，檸檬酸二銨 2g，吐溫-80 lml，瓊脂15g，顯色劑0. lg，蒸餾水1L，將以上成分加熱溶解校正pH6.5，115°C高壓滅菌 15-20分鐘。顯色劑為5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D半乳糖苷(X-Gal)。2、菌懸液製備青春雙歧桿菌LJM-001接種於營養瓊脂的斜面培養基，35士2°C厭氧培養M小時，用滅菌生理鹽水將菌苔洗下，製成菌懸液，，在721分光光度計580nm波長下將光透過率控制為0. 8，置2-8°C冰箱中保存。3、菌層平板製備取直徑約90mm、高16 17mm的平板，注入加熱融化的篩檢培養基20mL，使在碟底內均勻攤布，放置水平臺上使凝固，作為底層；在已凝固的底層培養基 (放冷至48 50°C )上加入菌懸液0. 5mL，充分混勻，使在底層上均勻攤布，作為菌層。4、樣品前處理取待檢的食品樣品勻漿組織5g，用無菌磷酸鹽緩衝液 (pH6. 0)25ml稀釋，漩渦混勻，於80°C水浴加熱5min，冷卻後於5000r/min離心15min，取上清液作為供試樣品液。5、樣品測定在菌層平板的培養皿中放置圓濾紙片(直徑13士 1mm)，用鑷子輕壓紙片，使紙片與培養基緊密接觸，用微量移液器在圓濾紙片上滴加供試樣品液90μ 1。每個供試樣至少重複2個培養皿，35士2°C厭氧培養18 M小時，抑菌圈直徑通過抑菌圈電腦測量分析儀測量。6、結果判定當抑菌圈彡15mm，判斷食品樣品中樂果殘留陽性(+)。本發明工作菌株為青春雙歧桿菌LJM-001，已於2010年08月17日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 4090。本發明所述的食品樣品包括白菜、茄子、黃瓜、南瓜、冬瓜、蘋果、梨子、桃子等蔬菜水果。本發明的優點及效果
(1)本發明青春雙歧桿菌LJM-001對樂果敏感性高、特異性好，可以作為微生物方法篩檢食品中樂果殘留的工作菌種；(2)本發明篩檢培養基中添加了 X-Gal指示劑，使產生的抑菌圈更加清晰；(3)本發明樣品前處理簡單，能同時篩檢大量食品樣品；(4)本發明檢測方法簡便易行，具有靈敏度高，精確度高等特點，在蔬菜中最低檢測限為0. lmg/kg，低於國家標準的最大殘留限量，回收率均大於70%，變異係數在10%以內，符合食品樂果殘留篩檢的準確度和精密度要求，完全適合食品中樂果殘留的篩檢。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但所舉實施例不作為對本發明的限定。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1青春雙歧桿菌LJM-001的分離與鑑定以一名浙江省健康青年人的糞便作為分離樣品，在改良MRS瓊脂培養基上，37°C 厭氧條件下，4 塗布分離培養，獲得本發明所述的青春雙歧桿菌LJM-001，鑑定為青春雙歧桿菌，已於2010年08月17日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區大屯路甲3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)，保藏號為 CGMCC No. 4090。改良MRS瓊脂培養基的配方蛋白腖10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸鈉 5g，K2HPO4 2g，MgSO4 · 7 H2O 0. 5g，MnSO4 · 4H20 0. 2g，低聚果糖 3g，檸檬酸二銨 2g，吐溫-80 lml，瓊脂15g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D半乳糖苷(X-Gal) 0. Ig,蒸餾水1L，調ρΗ 至7. 0，115°C滅菌15分鐘。本發明的青春雙歧桿菌LJM-001具有下述微生物學特徵(1)菌落形態呈淡黃色或乳白色，中央隆起，邊緣整齊，圓形，光滑，直徑1 2mm 大小。(2)個體形態為不規則G+無芽孢桿菌，菌體呈杆狀，稍彎曲，有的呈V型，少量呈 Y型，兩端著色深。(3)生理生化特徵D_核糖⑴；L-阿拉伯糖⑴；乳糖⑴；纖維二糖⑴；松三糖(+)；棉籽糖(+)；山梨醇(+)；澱粉(+)；葡萄糖(+)；木糖(+)；甘露糖(+)；果糖(+)；半乳糖⑴；麥芽糖⑴；海藻糖⑴；密二糖⑴；甘露醇⑴；水楊苷⑴；硝酸鹽還原㈠； 觸酶(「)；精氨酸水解試驗(「)；明膠液化反應試驗(「)；吲哚試驗(「)；F6PPK Bl (+)。厭氧下生長良好，有氧環境中不生長。最適生長溫度37 41°C ；最低生長溫度 25 ；最高43 45°C ；生長最適ρΗ 6. 5 7. 0 ；在pH4. 5 5. 0或8. 0 8. 5不生長。試驗1敏感性試驗採用紙片瓊脂擴散(K-B)法，選取不同濃度的樂果標準液，以改良MRS瓊脂培養基，培養基配方見實施例1，以本發明青春雙歧桿菌LJM-001為測試菌，置於37°C培養箱中厭氧培養24h後觀察LJM-001菌株的生長情況，用紙片瓊脂擴散法做樂果敏感性試驗，測定樂果對LJM-001菌株的抑菌性能。上述試驗做3次重複，以同屬同種的青春雙歧桿菌標準菌株為對照。
表1敏感性試驗
權利要求
1. 一株青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis) LJM-001，保藏編號為 CGMCC No.4090。
全文摘要
本發明提供了一株雙歧桿菌LJM-001菌株，保藏號為CGMCC No.4090。LJM-001菌株對樂果超敏感，是檢測食品中樂果殘留的工作菌株。本發明還提供了一種篩檢食品中樂果殘留的微生物法，根據篩檢培養基上抑菌圈的大小判定待測食品樣品中樂果殘留量是否超標。本發明提供篩查食品中樂果殘留的方法具有操作簡便、費用低廉、靈敏度高、適合樣本篩查的特點，更符合我國農藥殘留檢測部門的大量樣品篩檢要求。
文檔編號C12N1/20GK102304481SQ201110187988
公開日2012年1月4日 申請日期2011年6月25日 優先權日2011年6月25日
發明者劉佳明 申請人:溫州醫學院