紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC3及其應用的製作方法
2023-12-08 19:49:36 1
紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC3及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC3及其應用。本發明應用RT-PCR技術從紫花苜蓿基因組中克隆並鑑定了一個新的NAC家族相關基因，命名為MsNAC3，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.11所示，並構建了含有加強型綠色螢光蛋白（EGFP）基因的融合表達載體。本發明應用螢光定量PCR技術分析了MsNAC3基因在紫花苜蓿中的表達模式，以及該基因與逆境脅迫（冷害，鹽害，乾旱）之間的關係，發現該基因在菸草中過表達可提高轉基因菸草植株的抗寒、抗旱和耐鹽性，該基因可用於其他單雙子葉植物的遺傳轉化，提高其抗逆性。
【專利說明】紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC3及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因工程領域，具體地說，涉及紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC3及其應用。
【背景技術】
[0002]NAC轉錄因子(包括NAM、ATAFl/2和⑶C2)是植物特有的一種具有多種調控作用的轉錄因子，廣泛存在與陸生植物中，這類轉錄因子的主要結構特點是N端為保守的大約150個胺基酸殘基的NAC結構域，可以結合DNA和其他蛋白，可以分成從A~E5個保守區；C端則為高度多樣性的轉錄激活調控區，富含絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、穀氨酸等，研究發現有些NAC蛋白的C-端具有蛋白結合活性。目前已有研究表明NAC家族的一些成員在逆境應答網絡中起作用。擬南芥中ANAC019、ANAC055和ANAC072受到乾旱、高鹽以及脫落酸(ABA)的誘導表達，它們能顯著提高植株的耐旱能力(Tran et al.，2004)。擬南芥LOVl基因能增強植株的抗凍能力(Yoo et al.，2007)。來自水稻的 SNACl/2 (stress-responsive NAC2)基因受到乾旱、高鹽、低溫、傷以及ABA的誘導表達，其過表達植株耐冷、抗鹽並能抵禦乾旱(Hu et al., 2008) ?過量表達0sNAC6基因的水稻雖然生長慢、產量低，但卻顯示出對乾旱、高鹽以及枯萎病的較強抗性(Nakashima et al.，2007)。儘管NAC基因的功能還有待深入研究，但它們在植 物遺傳工程方面已展現出了巨大的應用潛力。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC3及其應用。
[0004]本發明提供紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC3，其具有:
[0005]I) SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列；或
[0006]2) SEQ ID N0.11所示核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸；或
[0007]3)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
[0008]本發明提供了含有上述基因MsNAC3的表達載體。
[0009]在本發明的一個實施例中，得到的含有基因MsNAC3的表達載體為pBIGFP-MsNAC3。
[0010]該表達載體的構建方法為:以紫花苜蓿葉的總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，進行PCR反應，上遊引物序列如SEQ ID N0.7所示，下遊引物序列如SEQ ID N0.8所示；
[0011]將RT-PCR擴增產物回收後連接在PMD18-T載體上，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α菌株，選取陽性克隆進行測序，用XbaI和KpnI進行雙酶切，回收目的片段，連接到含有eGFP植物表達載體pBIGFP的XbaI和KpnI位點中，構建得到pBIGFP_MsNAC3。
[0012]含有上述表達載體的宿主細胞也屬於本發明的保護範圍。
[0013]本發明還提供了含有基因MsNAC3的轉化植物細胞。
[0014]本發明提供了 MsNAC3基因在製備轉基因植物中的應用。
[0015]優選地，所述的植物為擬南芥、菸草、洋蔥、水稻、小麥、玉米、苜蓿、大豆或棉花。[0016]本發明提供了 MsNAC3基因在提高植物抗逆性方面的應用。
[0017]所述的抗逆性是指抗寒、抗旱或耐鹽性。
[0018]本發明還提供了克隆紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC3的方法，包括以下步驟:
[0019](I)以紫花苜蓿總RNA為模板，反轉錄合成cDNA第一鏈；
[0020](2)以步驟(1)的cDNA為模板進行PCR，回收產物，測序正確的為紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC3。
[0021 ] 其中，步驟(1)將紫花苜蓿幼苗放於4°C進行冷脅迫處理之後，取提取紫花苜蓿總RNA,以總RNA為模板，反轉合成cDNA第一鏈。
[0022]其中，步驟(2)的PCR方法中，所用引物序列中上遊引物序列如SEQ ID N0.1所示，下遊序列如SEQ ID N0.2所示。
[0023]步驟(2)的PCR 反應程序為 940C 3min ；94°C 10s，55。。20s, 72°C lmin，31 個循環；72°C IOmin。
[0024]步驟(2)中，回收擴增產物並將其連接在PMD18-T載體上進行測序。最後用DNAMAN5.2軟體分析，MsNAC3基因長度為1041bp，編碼331aa。將這個序列輸入NCBIblastp中發現，這個基因編碼的胺基酸序列與其他NAC家族基因結構高度相似，其N端含有NAC保守結構域，包括A、B、C、D、E5個保守的亞結構域，蛋白C端高度變異。為進一步分析該基因的結構，應用在線軟體SOPMA來推測其蛋白的二級結構，結果表明這種蛋白是以無規則捲曲為主，同時含有18.43%的α -螺旋，3.02%的β -轉角和14.20%的延伸鏈等結構。應用ProtScale在線軟體來預測其蛋白胺基酸序列的疏水性/親水性，結果表明，該蛋白為親水性蛋白。這些數據表明，該基因是一個`新鑑定的NAC家族的基因，本發明將其命名為MsNAC3。
[0025]本發明具有下列優點及有益效果:
[0026]本發明提供了紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC3 (核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示)及其在作物育種中的應用。該基因不僅受低溫和高鹽誘導高表達，而且還受乾旱和ABA脅迫誘導表達。洋蔥表皮亞細胞定位研究表明MsNAC3為核定位基因。先前報導的抗逆基因在功能方面多數具有單一性，而研究發現本發明MsNAC3基因在提高轉基因菸草植株的抗寒、抗旱和耐鹽性等方面均據有較明顯的功效。該基因可用於其他單雙子葉植物的遺傳轉化，顯著提高其抗逆性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1為RT-PCR方法獲得MsNAC3的電泳圖片，其中M為2000bp Marker，1、2為PCR產物。
[0028]圖2為融合表達載體pBIGFP_MsNAC3結構示意圖。
[0029]圖3為MsNAC3在脅迫誘導後的相對表達。其中，A圖為250mMNaCl、10%PEG6000、100 μ mo I.L4ABA和4°C脅迫處理下MsNAC3在葉片中的相對表達量。B圖為250mM NaCl,10%PEG6000、100 μ mo I.L4ABA和4°C脅迫處理下MsNAC3在根中的相對表達量。
[0030]圖4為MsNAC3基因亞細胞定位照片。其中，A:含MsNAC3_GFP融合基因的轉基因菸草在白光下的圖片含MsNAC3-GFP融合基因的轉基因菸草在紫外光下的圖片；C:對照組只含GFP綠色螢光蛋白基因的轉基因菸草在白光下的圖片；D:對照組只含GFP綠色螢光蛋白基因的轉基因菸草在紫外光下的圖片。
[0031]圖5為逆境脅迫下轉MsNAC3基因菸草生長情況，250mM NaCl處理20d後，轉基因菸草長勢良好，而野生型菸草葉片幾乎全部失綠，變為淡黃色。
[0032]圖6為逆境脅迫下轉MsNAC3基因菸草生長情況，10%PEG處理20d後，轉基因菸草長勢良好，而野生型菸草葉片幾乎全部變為水潰狀。
[0033]圖7為逆境脅迫下轉MsNAC3基因菸草生長情況，4°C處理6d後再進行恢復培養IOd後，轉基因菸草植株葉片要明顯大於野生型，根系也比野生型發達。
【具體實施方式】
[0034]以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。
[0035]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段；若未特別指明，實施例中所用試劑均為市售。
[0036]實施例1紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC3的獲得
[0037]1、基因克隆
[0038]本發明根據紫花苜蓿MsNACl (JN099384)序列設計同源引物:
[0039]上遊引物:5'— ATGGAAAGAACTCACTTCAATATC — 3' (SEQ ID N0.1)
[0040]下遊引物:5'— GAAAAGGTTTTGGGCAAGTAC — 3' (SEQ ID N0.2)
[0041]實驗前4h將苜蓿幼 苗放在4°C進行冷脅迫處理。取幼嫩紫花苜蓿葉片，提取總RNA,總RNA的提取用的是TaKaRa RNAiso Plus，然後以紫花苜蓿總RNA為模板，以Oligod(T)為引物進行反轉錄反應,反應體系如下:
【權利要求】
1.一種紫花苜蓿逆境響應基因，其為MSNAC3，具有: 1)SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列；或 2)SEQ ID N0.11所示核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸；或 3)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述基因的表達載體。
3.如權利要求2所述的表達載體，其為pBIGFP-MsNAC3。
4.權利要求3所述的表達載體的構建方法，其特徵在於，以紫花苜蓿葉的總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，進行PCR反應，上遊引物序列如SEQ ID N0.7所示，下遊引物序列如SEQ ID N0.8 所示； 將RT-PCR擴增產物回收後連接在pMD18-T載體上，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α菌株，選取陽性克隆進行測序，用XbaI和KpnI進行雙酶切，回收目的片段，連接到含有eGFP植物表達載體pBIGFP的XbaI和KpnI位點中， 構建得到pBIGFP_MsNAC3。
5.含有權利要求2或3所述載體的宿主細胞。
6.權利要求1所述的基因在製備轉基因植物中的應用。
7.權利要求1所述的基因在提高植物抗逆性方面的應用。
8.一種獲得權利要求1所述紫花苜蓿逆境響應基因MsNAC3的方法，其特徵在於，包括以下步驟: (O以紫花苜蓿總RNA為模板，反轉錄合成cDNA第一鏈； (2)以步驟(1)的cDNA為模板進行PCR，回收產物，測序正確的為紫花苜蓿逆境響應基因 MsNAC3。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，步驟(1)將紫花苜蓿幼苗放於4°C進行冷脅迫處理之後，取提取紫花苜蓿總RNA，以總RNA為模板，反轉合成cDNA第一鏈。
10.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，步驟(2)的PCR方法中，所用弓丨物序列中上遊引物序列如SEQ ID N0.1所示,下遊序列如SEQ ID N0.2所示。
【文檔編號】C12N5/10GK103740731SQ201310718228
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月23日 優先權日:2013年12月23日
【發明者】申玉華, 徐振軍, 黃文婕, 唐立紅, 林景衛, 李望豐 申請人:申玉華, 徐振軍, 黃文婕, 唐立紅, 林景衛, 李望豐