一種雙功能層析材料及製備方法和應用的製作方法

2023-12-09 04:42:26 2

專利名稱：一種雙功能層析材料及製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域。
親和層析技術是一種根據生物分子的生物學特性和化學結構進行分離純化的技術，即將一種與被分離物質具有特異性吸附的配基通過直接或間接的方法與載體結合製成親和吸附劑，用於分離純化某種酶或蛋白質。疏水層析技術是根據生物分子表面疏水性不同進行分離純化的方法。
苯酚和環氧氯丙烷在特定條件下的反應產物與瓊脂糖(如Sepharose)交聯，即可製得一種具有疏水作用的層析材料(如Phenyl Sepharose，Pharmacia公司產品)。
苯扎嘧啶(Benzamidine)通過6-氨基正己酸與瓊脂糖交聯，即可製得一種親和層析材料(如Benzamidine SepharoseCL，Pharmacia公司產品)。
上述兩種層析材料為現有產品，但分別作為一種層析材料在對多組份生物物質的分離純化中其特異性和選擇性均具有局限。
本發明的目的在於針對上述缺陷，提出一種雙功能層析材料和製備方法，以及採用該層析材料去除尿胰蛋白酶抑制劑中人尿激肽釋放酶和純化激肽釋放酶的方法。
本發明的雙功能層析材料，滿足下列結構要求 這裡X＝C6H5_
Y＝_NHC6H5C(NH)NH2R代表一種基質材料，包括各種類型的瓊脂糖。
本發明的雙功能層析材料的製備方法如下1，環氧化合物的合成取苯酚和環氧氯丙烷在鹼性條件下回流，使其充分反應，去除水層，減壓蒸餾得到1，2-環氧-3-苯氧基丙烷；2，苯基-載體交聯複合物的製備任何不溶於水的基質材料均可作為載體材料，最好採用瓊脂糖膠(如瓊脂糖2B、瓊脂糖4B或瓊脂糖6B)，將載體與適量1，2-環氧-3-苯氧基丙烷在室溫條件下直接交聯製得苯基-載體複合物；3，苯基-載體-苯扎嘧啶交聯複合物的製備將苯基-載體複合物用溴化氰或其他激活劑活化，分別加入6-氨基正已酸和對氨基苯扎嘧啶鹽酸鹽，製得苯扎嘧啶雙功能層析材料。
採用本發明雙功能層析材料，根據在特定條件下對人尿激肽釋放酶的吸附作用，可成功去除尿胰蛋白酶抑制劑中人尿激肽釋放酶；並在一定的PH和離子強度條件下進行洗脫，純化出人尿激肽釋放酶。
實施實例I1.環氧化合物的合成取376克苯酚和748克環氧氯丙烷，置2000ml裝有回流冷凝管、滴液漏鬥的三頸圓底燒瓶中，加熱回流並滴加20％氫氧化鈉溶液600克，回流2小時，放冷。倒入分液漏鬥分去水層，有機層用200ml蒸餾水(加20％氫氧化鈉溶液1.0ml)分三次洗滌，除去水層，再加50ml乙醚振搖加速分層。有機層再用100ml蒸餾水分二次洗滌，去除水層，有機層再加入150克無水硫酸鈉吸收殘餘水份。將有機層倒入減壓蒸餾裝置中，在5mmHg條件下減壓蒸餾收集沸點在110℃左右的餾分液。製得1，2-環氧-3苯氧基丙烷。
反應方程式
2.苯基-載體交聯複合物的製備取約3000ml沉澱體積的瓊脂糖4B(Spharose 4B，Pharmacia公司產品)，用沙芯漏鬥抽濾，用0.5mol/L氯化鈉溶液洗滌，再用大量蒸餾水衝洗，除去其中的保護劑和防腐劑。加入2000ml的1mol/L的氫氧化鈉、240ml的1，2-環氧-3-苯氧苯丙烷和3克四氫硼鈉在室溫(30℃)下攪拌至少12小時。再加熱至50℃，加入3克的四氫硼鈉攪拌5小時。反應完畢後抽濾，加蒸餾水洗滌。置95％乙醇中浸泡12小時，過濾，保存在95％乙醇中。製得苯基—瓊脂糖4B複合物。
反應方程式
其中HO-R-OH代表載體瓊脂糖4B
3.苯基-載體-苯扎嘧啶交聯複合物的製備取1000ml沉澱體積的苯基-瓊脂糖4B交聯複合物。抽濾，用水洗滌三次，加600ml水和100克溴化氰置冰鹽浴(-10℃)中滴加2mol/L氫氧化鈉溶液，使pH值保持在11.0～11.5之間10分鐘後移至室溫旋轉10分鐘後倒入沙芯漏鬥中，立即用冷0.1mol/L碳酸氫鈉(pH9.5)緩衝溶液抽洗，在2～3分鐘內洗下5000～6000ml體積的緩衝溶液，終止活化。
加500ml蒸餾水和100克6-氨基正己酸，調節pH值至9.5攪拌24小時後，抽濾加水洗滌。再加入500ml蒸餾水和4克對氨基苯扎嘧啶鹽酸鹽調節pH至4.5，加入50克EDC混勻，置室溫下攪拌12小時以上。抽濾加水洗滌，置95％乙醇中保存備用。製得苯基-瓊脂糖4B-苯扎嘧啶複合物。
反應方程式 (3)M-O-R-OC(NH)NH(CH2)5COOH+H2N-C6H5-C(NH)NH2*HCL—→ 其中HO-R-OH代表載體瓊脂糖4BM代表C6H5-OCH2CH(OH)CH2-
實施實例II重複實施實例I，用瓊脂糖2B(Sepharose 2B，Pharmacia公司產品)代替瓊脂糖4B同樣操作，製得苯基-瓊脂糖2B-苯扎嘧啶複合物。
實施實例III重複實施實例I，用瓊脂糖6B(Sepharose 6B，Pharmacia公司產品)代替瓊脂糖4B同樣操作，製得苯基-瓊脂糖6B-苯扎嘧啶複合物。
實施實例IV1.柱層析分別取採用上述實施實例製備的雙功能層析材料各1000ml。事先用0.1mol/L的磷酸緩衝溶液(pH8.0)平衡柱床。另取尿胰蛋白酶抑制劑(比活力2500U/mg)製成濃度為100000U/ml的溶液(pH8.0)衝洗柱床，激肽釋放酶被吸附尿胰蛋白酶抑制劑則隨溶液流出，收集流出液。
2.激肽釋放酶測定(1)激肽釋放酶的測定方法採用發色底物S-2266測定法[入江章子等，臨床藥理(日本)29，419，(1981)]。
取0.2mol/L三羥甲基氨基甲烷緩衝溶液(pH8.0)500ul，37℃保溫5～10分鐘，另取檢品溶液(樣品溶液調節pH至8.0並稀釋至1倍)400ul，混合37℃保溫2～5分鐘後加底物溶液[25mgS-2266(日本第一化學製藥株式會社產品)加28.8ml的蒸餾水溶解]混合37℃保溫30分鐘，再加50％醋酸終止反應。另取含抑肽酶10000～50000IU/L的0.2mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩衝溶液(pH8.0)代替0.2mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩衝溶液(pH8.0)同樣操作，作為空白對照在波長405nm處測定吸收度(A)，按下式計算出激肽釋放酶的含量激肽釋放酶的含量(mU/ml)＝A×9.55(2)按上述方法測定尿胰蛋白酶抑制劑中經柱層析前後激肽釋放酶(Kalikrein)的含量，測定結果見表一表一
實施實例V1.激肽釋放酶的純化接實施實例IV，將吸附有激肽釋放酶的層析柱用0.1mol/L的碳酸鈉緩衝溶液(含0.5mol/L的氯化鈉)pH10.0洗脫，收集洗脫峰。用高效液相色譜分析，分析激肽釋放酶的純度。
2.高效液相色譜分析
色譜條件貝克曼高效液相色譜儀色譜柱Tskgel 3000SW，7.5*600mm(貝克曼公司產品)流動項0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液檢測波長280mm流速0.6ml/min進 樣 量10ul本方法為凝膠色譜法，是根據樣品分子量的大小和其空間構象來進行分離。在流動項的作用下樣品中不同分子量的成份依次分開，分子量大的先流出。通過檢測器即可檢測出樣品的組成和純度。
經檢測採用該雙功能層析純化的激肽釋放酶，高效液相色譜分析凝膠色譜純度均超過80％，說明採用該柱層材料可達到分離純化激肽釋放酶的效果。
權利要求
1.一種雙功能層析材料，其特徵在於滿足下列結構要求 這裡X＝C6H5_Y＝_NHC6H5C(NH)NH2R代表一種基質材料，包括各種類型的瓊脂糖。
2.一種雙功能層析材料的製備方法，其特徵在於1，環氧化合物的合成，取苯酚和環氧氯丙烷在鹼性條件下回流，使其充分反應，去除水層，減壓蒸餾得到1，2-環氧-3-苯氧基丙烷；2，苯基-載體交聯複合物的製備，取任何不溶於水的基質材料作為載體材料，如各類玉脂糖，將載體與適量1，2-環氧-3-苯氧基丙烷在室溫條件下直接交聯製得苯基-載體複合物；3，苯基-載體-苯扎嘧啶交聯複合物的製備，將苯基-載體複合物用溴化氰或其他激活劑活化，分別加入6-氨基正已酸和對氨基苯扎嘧啶鹽酸鹽，製得苯扎嘧啶雙功能層析材料。
3.一種雙功能層析材料的應用，其特徵在於用雙功能層析材料裝柱，加入尿胰蛋白酶抑制劑，調節PH至8.0，用磷酸緩衝液(PH8.0)衝洗柱床，激肽釋放酶被吸附，尿胰蛋白酸則隨液流出。
4.根據權利要求3所述的雙功能層析材料的應用，其特徵在於將吸附有激肽釋放酶的層柱析用0.1mol/L的磷酸鈉緩衝液(含0.5mol/L的氯化鈉)PH10.0洗脫，收集洗脫峰，即得純化的激肽釋放酶。
全文摘要
一種雙功能層析材料，其結構要求
文檔編號G01N33/50GK1142984SQ9511425
公開日1997年2月19日 申請日期1995年12月4日 優先權日1995年12月4日
發明者傅和亮, 謝永立, 何欄, 巫錦娣, 鄭少亮 申請人:廣州市博普生物技術有限公司, 廣東天普生物化學製藥有限公司