免疫學的測定試劑的前帶現象的消除法的製作方法
2023-12-08 23:27:21
本發明涉及免疫層析試劑盒、其使用的試劑組合物或檢測方法，其中所述免疫層析試劑盒作為利用免疫學的抗原抗體反應，迅速、簡便且正確地檢測大量過剩存在被檢測物(抗原等)的檢查試樣中的被檢測物(抗原等)的體外診斷試劑盒或便攜用診斷裝置，重要性高。特別是涉及通過消除在檢測大量過剩存在被檢測物(抗原等)的檢查試樣(例如尿、血液之類的檢查試樣)中的被檢測物(抗原等)時發生的前帶現象，從而提高檢查效率及檢查精度的檢查方法及其使用的診斷試劑盒。
背景技術：
：近年來，在免疫層析法用條帶形式的免疫測定中，作為利用抗體具有的特異的反應性來檢測試樣液體中的被檢測物(抗原等)的簡便的體外診斷試劑盒或便攜用診斷裝置，通用性日益提高。然而，在通過抗體把被檢測物(抗原等)夾在中間進行檢測的免疫層析檢測法中，在檢查試樣中存在大量過剩的被檢測物(抗原等)的情況下，表面上看，會引起被檢測物少或完全不存在這樣的假陰性現象(也被稱為前帶現象或高劑量鉤狀效應)，不僅降低檢測時的S/N比，而且造成錯誤的檢查結果，這樣的問題點是眾所周知的，用於消除該前帶現象的研究一直在進行。為了克服該問題點，在利用親和層析的原理的免疫層析法中，開發了將被檢測物(抗原等)用其抗體和與微粒結合的抗體夾在中間進行檢測的夾心法；通過使被檢測物(抗原等)或同等物在色譜載體上固定化，使其與被檢測物(抗原等)互相競爭而抑制上述夾心法中特有的前帶現象，從而確保判定的客觀性這樣的方法，除此之外，開發了通過具備自由的抗體而消除前帶現象的技術。例如，在免疫學的定量裝置中，通過設定試樣添加部、在其下遊設定標記化反應體塗敷部、在其更下遊設定將目標物質(被檢測物)或與其同等的物質固定化的部位、在其更下遊設定將多個抗體以階梯狀固相化的部位，而在色譜載體上進行競爭反應，並且通過以階梯狀具備多個自由的抗體，從而抑制/消除了前帶現象。而且，提案有通過根據固相化抗體中的反應線的條數或其顯色圖形進行判定，可以客觀且用一步就迅速地測定的定量裝置(參照專利文獻1)。另外，在親合層析檢測法中，提案有下述方法：在展開載體上設置固定有與檢測對象物質特異性結合的物質的第一檢測區域及固定有檢測對象物質競爭物質的第二檢測區域，使含有由標記物質標記且與檢測對象物質特異性結合的物質和試樣的展開液體從這些檢測區域通過並展開，基於第一及第二檢測區域的信號而檢測物質，由此，不易產生假陰性，避免了前帶的出現(參照專利文獻2)。而且，作為用於消除前帶現象的另外的方法，提案有提供具有擴大的動態範圍的試驗條及使用它的檢測方法，由此，不必將樣本稀釋就可以進行前帶樣本的檢測。例如，在專利文獻3中，提案有下述方法：一種層析條，其具備第1末端及第2末端，所述層析條至少包含第1反應區域和第2反應區域，各反應區域含有特異性結合分析物的捕獲劑，且在第1末端含有吸收墊，通過該吸收墊，可進行樣本的側方流動，由此，基於第1反應區域的信號強度，或由第1反應區域、第2反應區域或它們的組合的信號強度而檢測測定捕獲劑能夠結合分析物的至少一部分的試驗條及分析物的存在(參照專利文獻3)。但是，在利用不溶性載體(金膠體粒子、著色乳膠粒子等)標記抗體的免疫層析法(也稱為「粒子免疫層析法」)的情況下，作為消除前帶現象的現有技術的方法，具有以下這樣的優點：通過階梯狀加入多個自由的抗體或設置第2或其以上的檢測區域，由此，對於檢測對象物質(抗原等)大量過剩存在的高濃度檢體試樣，根據反應線的條數或其顯色圖形可以進行定量判定，另一方面，存在低濃度檢體的顯色變弱、或自由的抗體改性、前帶現象對策效果經時性地削弱這樣的問題點。另外，作為消除前帶現象的現有技術的方法，主要是對於大量過剩存在的檢測對象物質，階梯狀加入多個自由的抗體，或除了標準的第1檢測區域之外，還設有第2或其以上的檢測區域，通過綜合判斷這些信號，能夠客觀地進行檢測對象物質的判定/測定。但是，由於檢測線有多條，檢測區域至少有兩個，因此存在判定基準不簡單，怎麼都比較複雜，無論是誰都容易出差錯這樣的問題點，渴望可以簡單地進行判定的方法。現有技術文獻專利文獻專利文獻1：日本特開平10-185921號公報專利文獻2：日本特開2004-85425號公報專利文獻3：日本特表2012-524277號公報技術實現要素：發明所要解決的課題本發明的目的涉及免疫層析試劑盒、其使用的試劑組合物或檢測方法，其中在利用免疫學的抗原抗體反應，通過抗體將大量過剩存在被檢測物(抗原等)的檢查試樣(也稱為「檢體」)中的被檢測物(抗原等，以下也稱為檢測對象物)夾在中間進行檢測的方法中，所述免疫層析試劑盒作為可以抑制/消除前帶現象而迅速、簡便且正確地進行檢測的體外診斷試劑盒或便攜用診斷裝置，其重要性高。另外，本發明的目的在於，提供一種免疫層析裝置，其中對於在免疫層析試劑中大量過剩存在抗原的檢體，通過使用改良的部件，從而抑制/消除在夾心法中引起的前帶現象。另外，更詳細而言，本發明的目的涉及通過抑制/消除在檢測大量過剩存在被檢測物(抗原等)的檢查試樣(例如尿、血液之類的生物體試樣)中的被檢測物(抗原等)時引起的前帶現象，從而提高檢查效率及檢查精度的檢查方法及其使用的診斷試劑盒。用於解決課題的技術方案眾所周知，對於在免疫層析試劑中大量過剩存在抗原的檢體，不與顯色載體結合的抗原會被塗敷在膜上的測試線抗體捕獲，引起測試線不顯色而被判斷為假陰性的現象(前帶現象)。本發明人等初次發現，通過至少在試樣添加部乾燥保持特定的非離子性表面活性劑，且使用流速(展開速度)快的膜作為層析介質使用的膜，可以抑制/消除該現象。本發明的檢測系統提供免疫測定用試劑、免疫測定方法及免疫層析試劑盒等，其中，通過使用含有HLB值為13至18的非離子性且親水性表面活性劑作為特定的非離子性表面活性劑的部件，且使層析介質中使用的膜的高流率(HighFlowRate：將水吸取4cm所花費的時間(sec/40mm))為75(sec/40mm)以下，由此消除了前帶現象，可以正確、容易且迅速地檢查大量過剩存在抗原的檢體。本發明提供下述(1)至(12)的使用免疫層析法的免疫層析裝置、免疫層析試劑盒及使用其的免疫層析檢測法。本發明的免疫層析裝置具有如下特徵。(1)本發明的第1特徵在於，一種用於檢測檢體中的檢測對象物的免疫層析裝置，其由試樣添加部、標記物質保持部、具有檢測部的層析介質及吸收部構成，其中，至少在試樣添加部保持有HLB值為13至18的非離子性且親水性表面活性劑，且作為層析介質中使用的膜，使用流速快的膜。作為使用本發明的免疫學的檢測法的檢測試劑盒(也稱為「免疫層析試劑盒」)具有如下特徵。(2)本發明的第2特徵在於，一種用於檢測檢體中的檢測對象物的免疫層析試劑盒，其由試樣添加部、標記物質保持部、具有檢測部的層析介質及吸收部構成，其中，至少在試樣添加部保持有HLB值為13至18的非離子性且親水性表面活性劑，且作為層析介質中使用的膜，使用流速快的膜。(3)本發明的第3特徵在於免疫層析試劑盒，其中，膜的流速以高流率(sec/40mm)表示且為75以下。(4)本發明的第4特徵在於免疫層析試劑盒，其中，在試樣添加部及標記物質保持部兩者中保持有HLB值為13至18的非離子性且親水性表面活性劑。(5)本發明的第5特徵在於免疫層析試劑盒，其中，對於非離子性且親水性表面活性劑的含量，每單位面積的免疫層析試劑盒的試樣添加部或試樣添加部及標記物質保持部兩者為0.1至5μg/mm2。(6)本發明的第6特徵在於免疫層析試劑盒，其中，在標記物質保持部乾燥保持有利用金納米粒子進行了修飾的標記物質。(7)本發明的第7特徵在於免疫層析試劑盒，其中，金納米粒子的平均粒徑為20至60nm。作為本發明的免疫層析檢測法，具有如下的特徵。(8)本發明的第8特徵在於，一種免疫層析檢測法，其包括：在試樣添加部添加檢體的工序、通過保持在標記物質保持部的利用金納米粒子進行了修飾的標記物質識別檢測對象物的工序、使標記物質和檢測對象物的複合體作為移動相展開的工序以及在檢測部檢測展開的移動相中的檢測對象物的工序，其中，至少在試樣添加部保持有HLB值為13至18的非離子性且親水性表面活性劑，且作為層析介質中使用的膜，使用流速快的膜。(9)本發明的第9特徵在於免疫層析檢測法，其中，金納米粒子的平均粒徑為20至60nm。(10)本發明的第10特徵在於免疫層析檢測法，其中，檢體是生物體試樣。(11)本發明的第11特徵在於免疫層析檢測法，其中，檢測對象物為肽類激素。(12)本發明的第12特徵在於免疫層析檢測法，其中，在試樣添加部及標記物質保持部兩者中保持有HLB值為13至18的非離子性且親水性表面活性劑。本發明通過具有以上的特徵，可以實現上述的課題。發明效果在本發明中，在利用免疫學的抗原抗體反應，通過抗體將大量過剩存在被檢測物(抗原等)的檢查試樣(也稱為「檢體」)中的被檢測物(抗原等)夾在中間進行檢測的方法中，通過至少在試樣添加部(也稱為「樣本墊」)保持HLB值為13至18的非離子性且親水性表面活性劑，且作為層析介質中使用的膜，使用流速(展開速度)快的膜，由此，可以明顯消除前帶現象(儘管抗原存在，但測試線不顯色，判斷為假陰性的現象)。因此，本發明可以提供在利用免疫學的抗原抗體反應，通過抗體將大量過剩存在被檢測物(抗原等)的檢查試樣(也稱為「檢體」)中的被檢測物(抗原等)夾在中間進行檢測的方法中，能夠迅速、簡便且正確地進行檢測的免疫層析裝置以及作為體外診斷試劑盒或便攜用診斷裝置重要性高的免疫層析試劑盒，進而提供其檢測方法。即，在本發明中，通過保持在試樣添加部(也稱為「樣本墊」)或試樣添加部及標記物質保持部(也稱為「結合墊」)兩者中的HLB值為13至18的非離子性且親水性表面活性劑的作用，可以使被檢測物(抗原等)和標記物質快速結合。另外，通過使用流速(展開速度)快的膜作為層析介質中使用的膜，並且通過使用修飾抗體並用作標記物質的金膠體的粒徑為20至60nm這種比較小的金膠體，雖然它們共同作用的結果、作用機制尚不明確，但被檢測物(抗原等)和標記物質的複合體的形成極其迅速，且該複合體在層析介質中的移動展開非常順暢且迅速，沒有任何障礙，而且能夠與測試線抗體快速結合併顯色。作為其結果，可以提供不引起前帶現象、正確且能夠展開速度快地迅速、簡便及高靈敏度地進行結果判定的檢查試劑。例如，在檢測用作檢體的尿中的LH或hCG等時，不會增加結合抗體量，且沒有改變被檢測物(抗原等)在低濃度下的顯色強度，靈敏度不會降低，並且，顯著地抑制/消除了前帶現象，因此判定基準易了解，能夠正確地進行檢查結果的判定。附圖說明圖1是表示本發明的免疫層析裝置的圖。圖2是將本發明的[表5]的數據以坐標圖形式表示的圖。具體實施方式以下，詳細地說明本發明。本發明的實施方式是基於如下的免疫層析法或應用它的檢測法的實施方式，即，通過使各種檢體中的被檢測物質即檢測對象物(抗原)與附加了各種標記的特異性結合的結合物質(抗體)在層析介質上進行反應的抗原-抗體反應而形成複合體，使其在免疫層析介質上向吸收部的方向展開，並通過各種檢測方法對其進行確認。作為與該抗原進行最特異性反應而結合的抗體，可以任意使用與其特異性結合的例如單克隆抗體及多克隆抗體或其它公知的抗體。作為其標記，可以任意使用酶、顯色物質、螢光物質或放射性物質等，只要考慮操作簡單、檢測時間也短這樣的可顯出免疫層析法的特色的理由或抗體、抗原的種類確定即可。另外，檢測方法的特徵在於，為了表現操作簡單、用較短時間就可以判定這樣的免疫層析法的特色，具有用肉眼判定就可以正確地進行判定這樣的性能，在要求時間、精度等的情況下，也可以附帶分光光度檢測、放射線檢測等各種檢測方法進行檢測。依次說明本發明的免疫層析法可使用的免疫層析裝置、免疫層析試劑盒、用於實施免疫測定法或免疫層析檢測方法的最佳方式。所謂本發明的免疫層析裝置，是在免疫測定時使用的裝置，作為其一種方式，包括免疫層析試劑盒。在該免疫層析裝置中，至少使試樣添加部(2)含有保持有HLB值為13至18的非離子性且親水性表面活性劑。但是，除此之外，也可以在標記物質保持部(3)以及層析介質即膜(4)中的一個以上的部位含有保持上述表面活性劑。在使試樣添加部含有該非離子性且親水性表面活性劑的情況下，具備依次移動到標記物質保持部(3)、層析介質(4)、檢測部(以下，也稱為判定部)(5)及吸收部(6)並進行展開的性質。作為本發明的免疫層析裝置，在試樣添加部(2)或在試樣添加部(2)及標記物質保持部(3)兩者中乾燥保持含有HLB值為13至18的非離子性且親水性表面活性劑。作為本發明中可使用的特定的非離子性表面活性劑，為HLB值為13至18的非離子性且親水性表面活性劑，更優選HLB值為14至17的非離子性且親水性表面活性劑。作為可使用的非離子性表面活性劑，可列舉市售的TritonX100(商品名)、Brij35(商品名)、Tween20(商品名)、NP40(商品名)等商品。作為特別適合的非離子性表面活性劑，可列舉Brij35(商品名)、Tween20(商品名)等。HLB值小於13時，由於可溶化作用不充分，靈敏度變差。另一方面，HLB值超過18時，雖然可溶化作用充分，但親水性過大，靈敏度降低。如果還考慮表面活性劑的浸透、可溶化的特性等，則發現HLB值為13至18左右的非離子性表面活性劑最適於本發明的免疫層析裝置。本發明的非離子性表面活性劑的行為與層析介質的膜的高流率特性、進而也與金納米粒子的特性相互協同作用，可以表現出在其它陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑中未看到的特有的性質及性能。使本發明的試樣添加部(也稱為「樣本墊」)或試樣添加部及標記物質保持部(也稱為「結合墊」)兩者保持的、HLB值為13至18的非離子性且親水性表面活性劑的含量為0.10至5.0μg/mm2，優選為0.15至3.0μg/mm2，特別優選為0.20至1.0μg/mm2。為小於0.10μg/mm2的含量時，流動變差，而超過5.0μg/mm2時，在裝置製造時的裁斷或包裝的收納時，有時產生樣本墊的剝離，或檢測線的顯色產生不勻，成為無用的。只要在0.10至5.0μg/mm2的範圍使用，則可以和層析介質的膜的高流率特性相互協同發揮作用，進一步抑制前帶現象。作為本發明的層析介質中使用的膜，使用流速(展開速度)快的膜。可使用高流率(HighFlowRate：將水吸取4cm所花費的時間(sec/40mm))(HFR)為75(sec/40mm)以下的膜，優選為60(sec/40mm)以下的膜，特別優選45(sec/40mm)以下的膜。在高流率(HFR)(HighFlowRate：將水吸取4cm所花費的時間(sec/40mm))超過75(sec/40mm)的展開速度慢的膜中，被檢測物(抗原等)和標記物質的複合體與被檢測物(抗原等)相比，不能在膜中快速移動，因此在大量過剩存在被檢測物(抗原等)的檢體的檢查中，不能抑制前帶現象。如果考慮檢測需要的測定時間或精度等，可以任意設計HFR直至20(sec/40mm)左右。優選為30(sec/40mm)以上，特別優選為36(sec/40mm)以上。作為該膜載體的特性，推薦能夠通過毛細管現象等吸收試樣檢體並使其移動的材料。該移動現象需要從構成膜載體的原料具有的性質、及表現膜的毛細管現象的多孔質這樣的構造面仔細研究。在進行該膜載體的構造設計時，需要從原料和構造兩方面仔細研究。不管怎樣，只要是流速(展開速度)快的膜就沒有特別限定。選定高流率(HFR)為75(sec/40mm)以下的載體材料，尤其是在實現抑制/消除前帶現象這種目標中適合。例如，可以是由硝化纖維素、醋酸纖維素、纖維素等天然原料、尼龍、聚醚碸、聚乙烯醇、聚酯、聚烯烴等合成聚合物、玻璃纖維、碳纖維等無機纖維等材料製造的材料，也可以是由混合纖維構成的材料。該膜載體的使用狀態例如可以從纖維、織布、無紡布、布、膜、紙、通氣海綿、薄板、泡沫體、墊等任意形式中來選定，但可以考慮HFR的性能進行設計。該膜載體的尺寸沒有特別限定，可以利用適用於這類製品的一般的尺寸，若例示，寬度3至10mm、長度2至6cm、厚度100至150μm的尺寸為標準尺寸。由於膜為多孔性，因此也可以是通過將不透水性的聚酯、聚乙烯等薄膜貼在一起進行裱貼或事先在不透水性的聚酯、聚乙烯等塑料薄膜上層疊硝化纖維素膜而形成的膜。該不透水性薄膜的厚度沒有特別限定，100μm左右在處置上較理想。在本發明的免疫層析裝置中，作為標記物質使用的金納米粒子，優選平均粒徑為10至60nm、更優選為20至60nm左右的紅色金納米粒子和/或藍色金納米粒子。當然，還可使用鉑、銀、銠、鈀、鍺等貴金屬粒子、鈦、鋅、鐵等平均粒徑為10至60nm、優選為20至60nm左右的金屬納米粒子。可列舉這樣的金屬納米粒子處於分散狀態的例如抗體、抗原形成的致敏金屬膠體、致敏金膠體、致敏鉑-金膠體、致敏金-銀膠體、鐵膠體等，但由於金膠體獲得及處置容易，因此尤其推薦。平均粒徑可以基於慣用的測定法來確定，即求得用動態光散射法粒度分布儀測定膠體的粒度分布後的平均粒徑。作為本發明的檢查試樣(檢體)，沒有特別限定，例如主要有生物體試樣，具體而言，不僅可以列舉血液、血清、血漿、尿液、唾液、汗液、脊髓液、淚液、羊水、乳頭分泌液、鼻涕、痰、鼻吸液、咽拭子、洗肺胞液、來自皮膚的浸出液、直腸拭子、糞便及自組織或細胞提取的提取物等，還可以列舉食品提取液、清潔水、廢水、培養液等之類的試樣等。在這些檢體中大量過剩含有被檢測物(抗原等)的情況下，特別有用，不會引起前帶現象，可以簡單且正確地進檢查。作為本發明的檢測對象物，沒有特別限定，只要是存在或可以製造與之特異性結合的例如像抗原-抗體反應那樣特異性結合的物質即可。檢測對象物既可以是完全抗原這樣的本身具有抗原性的檢測對象物，也可以是半抗原(不完全抗原)這樣的即使本身沒有抗原性，通過形成為化學上的改性物而達到持有抗原性的檢測對象物。和這些檢測對象物特異性結合的物質只要是存在或可以製造即可，可以設定為單克隆抗體或多克隆抗體。如果例示本發明的檢測對象物，則可列舉：肽類激素(生長激素(GH)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、促黑素細胞激素(MSH)、催乳素、甲狀腺刺激激素(TSH)、黃體化激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、垂體激素、鈣代謝調節激素、胰島素、消化道激素、血管活性激素、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、雌酮等卵泡激素、孕酮等天然或合成促黃體激素、睪酮等雄性激素、皮質醇等腎上腺皮質激素、二碘甲狀腺氨酸等甲狀腺激素等激素、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特異性抗原(PSA)、鹼性磷酸酶、轉氨酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶原、α-甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)等的癌特異性物質、免疫球蛋白G(IgG)等血清蛋白成分、類風溼因子、血清素、尿激酶、鐵蛋白、P物質、糞便隱血、梅毒抗體、流感病毒、腺病毒、輪狀病毒、支原體、HBs抗原、HBs抗體、衣原體抗原、A組β鏈球菌抗原、膽固醇、膽汁酸、強心類固醇、皂角苷配基等其它類固醇類、腎上腺素、多巴胺、生物活性生物鹼、含氨基精神治療藥、TRH等低分子肽類、前列腺素類、維生素類、青黴素等抗菌素類、其它生物體內成分、生物體內投與藥物及其代謝產物等。作為優選的檢測對象物，尤其列舉黃體化激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、雌酮等卵泡激素、孕酮等天然或合成促黃體激素等，作為含有本發明的檢測對象物的試樣(檢體)，例如使用尿、血液等。本發明的免疫層析用的標記物質溶液等優選含有緩衝劑或表面活性劑，特別優選含有非離子性表面活性劑。作為含有的緩衝劑，沒有特別限制，只要是具有以下作用(緩衝作用)的緩衝劑即可，即，即使由於試樣的添加或試樣的蒸發或稀釋而帶來的濃度的變化、以及來自外部的一些異物的混入，也不會產生致命的影響。在本發明中，作為緩衝劑，例如列舉醋酸緩衝液(醋酸+醋酸鈉)、磷酸緩衝液(磷酸+磷酸鈉)、檸檬酸緩衝液(檸檬酸+檸檬酸鈉)、硼酸緩衝液、Tris-鹽酸緩衝液(三(羥甲基)氨基甲烷+鹽酸)、TE緩衝液(Tris+乙二胺四乙酸)、TAE緩衝液(Tris+醋酸+乙二胺四乙酸)、TBE緩衝液(Tris+硼酸+乙二胺四乙酸)或HEPES緩衝液(2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙烷磺酸)等。優選的是HEPES緩衝液、磷酸緩衝液、醋酸緩衝液、Tris-鹽酸緩衝液等，更優選的是磷酸緩衝液、HEPES緩衝液。另外，在不會帶來不利影響的範圍內，還可以配合使用其它緩衝劑。作為在本發明中使用的緩衝劑的濃度，優選10至500mM的範圍，更優選10至300mM的範圍，進一步優選30至100mM的範圍。濃度比10mM低時，緩衝作用不充分，抑制蛋白質成分的析出或抑制標記粒子的凝聚也不充分。超過500mM時，為必要以上的濃度，不經濟，造成浪費。另外，作為緩衝液，最理想的是製造pH範圍7.1至9.8的緩衝液。有效且沒有任何妨礙的是，還可以在本發明的免疫層析裝置的各部位，特別是層析介質的膜上，添加保持能夠抑制基於生物學上的親和性的副反應、或抑制非特異性反應的公知的添加劑，例如用於促進抗原抗體反應或抑制非特異性反應的蛋白質(例如，牛血清白蛋白、明膠等)、高分子化合物(例如，聚乙二醇、甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、葡聚糖等)、離子性表面活性劑或聚陰離子(例如硫酸葡聚糖、肝素、聚苯乙烯磺酸、硫酸軟骨素等)或抗菌劑等的1種或2種以上而使用。另外，有效且沒有任何妨礙的是，還可以在構成固定相的層析介質上的移動相的移動路徑上，保持這些用於促進抗原抗體反應或抑制非特異性反應的蛋白質、高分子化合物、離子性表面活性劑或聚陰離子、或抗菌劑等的1種或2種以上。作為在本發明的免疫層析裝置的樣本墊(SP)或樣本墊(SP)及結合墊(CP)中所含有的上述添加劑的含量，塗敷或含浸0.01至20質量％的濃度範圍(優選為0.1至10質量％的濃度範圍、更優選為0.5至5質量％的濃度範圍)的水溶液後，進行乾燥，使每單位面積的含量為0.10至10.0μg/mm2，優選為0.15至5.0μg/mm2，特別優選為0.20至1.0μg/mm2。為小於0.10μg/mm2的含量時，不能抑制非特異性反應且不能進行正確的判定。另一方面，超過10.0μg/mm2時，為必要以上的濃度，不經濟，造成浪費。只要在每單位面積的含量為0.10至10.0μg/mm2的範圍使用，則能夠與層析介質的膜的高流率特性相互協同作用，從而進一步抑制前帶現象。在使本發明的免疫層析用標記物質溶液保持在固相中時，作為標記物質溶液中含有的保護穩定化物質或溶解促進物質，可以使用糖類，即，單糖、二糖、三糖、低聚糖或多糖。作為單糖，可列舉葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖等，作為二糖，可列舉海藻糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖，作為三糖或低聚糖，可列舉棉子糖等，作為多糖，列舉葡萄糖酸、葡聚糖等，可以沒有問題地使用一種或混合2種以上使用。另外，在免疫層析裝置的區域部內設置本發明的標記物質保持部時，優選通過以下方式擔持或保持或形成：在試樣添加部的端部和判定部之間的區域內，塗敷、吸附或含浸含有標記物質保護穩定化試劑的組合物後，利用各種乾燥方法(通氣乾燥、真空乾燥、自然乾燥、冷凍乾燥等)使其乾燥，所述組合物是通過用分子量1000至30000的具有1個以上的巰基的亞烷基二醇和/或其衍生物(保護試劑)對標記物質進行保護處理，並根據需要進一步混合精氨酸及酪蛋白(穩定化試劑)而得到的。作為設置含有本發明的免疫層析用標記物質溶液或其它試劑組合物的部位的方法，例如可以通過在向免疫層析裝置中的玻璃纖維墊(標記物質保持部件)塗敷或含浸免疫層析用標記物質溶液後，利用各種乾燥方法使其乾燥的方法，由此形成為使其向玻璃纖維墊中擔持或保持的形態。在實施本發明的免疫層析檢測法時，成為將檢體直接滴在試樣添加部或將試樣添加部浸漬在檢體中的形態。但是，在檢體例如像痰一樣為固體形狀的情況下，也可以使用檢體稀釋液。該檢體稀釋液另外也可以作為展開液使用，通常，使用水作為溶劑，在其中添加緩衝液、鹽及非離子性表面活性劑，再添加用於促進上述抗原抗體反應或抑制非特異反應的蛋白質、高分子化合物(PVP等)、離子性表面活性劑或聚陰離子、或者抗菌劑、螯合劑等的1種或2種以上。添加的順序沒有特別特定，即使同時添加也無妨礙。在作為展開液使用的情況下，也可以向樣本墊(試樣添加部)上供給、滴下事先將檢測試樣和展開液混合而成的液體並使其展開，也可以首先向樣本墊上供給、滴下試樣後，向樣本墊上供給、滴下展開液並使其展開。在作為試樣稀釋液使用的情況下，在通過試樣稀釋液將試樣調整或稀釋為適於測定的濃度後，通過供給、滴下在樣本墊上即可使用。以下，對免疫層析裝置及規格進行說明。免疫層析裝置或免疫層析試劑盒(1)由試樣添加部(2)(也稱為「樣本墊」)、標記物質保持部(3)(也稱為「結合墊」)、層析介質(4)、判定部(5)、根據需要還有控制部(8)、吸收部(6)(也稱為「展開速度控制部」)及背板(7)構成。這些各部位的構造、規格及形態如以下。1)參考圖1時，試樣添加部(2)(「樣本墊」)由試樣迅速被吸收但保持力弱，試樣迅速移動到反應部這樣的性質的多孔質片材構成。作為多孔質片材，可列舉纖維素濾紙、玻璃纖維濾紙、聚氨酯、聚醋酸酯、醋酸纖維素、人造纖維、尼龍、棉布等。作為本發明的多孔質片材，優選使用玻璃纖維濾紙、人造纖維。在本發明中，為了抑制/消除前帶現象，可以設定為以下形態：通過至少在樣本墊(2)中事先含浸含有HLB13至18的非離子性且親水性表面活性劑及根據需要的緩衝液的免疫層析用試劑組合物後，使其乾燥等方法而進行擔持。作為在本發明的免疫層析試劑盒的樣本墊中保持的非離子性表面活性劑，可使用HLB(HydrophileLipophileBalance＝親水基的重量％×0.2＝0至20)為13至18的非離子性表面活性劑。例如，可以列舉聚氧化烯烷基醚、聚氧乙烯烷基醚(例如，註冊商標「Brij」系列)、聚氧乙烯/聚氧丙烯烷基醚(例如，ナカライテスク社制，商品名：NP40)、聚氧乙烯芳基醚、聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯(例如，商品名「Tween」系列)、聚氧乙烯對叔辛基苯基醚(例如，商品名「Triton」系列)(例如聚氧乙烯(10)對叔辛基苯基醚(TritonX100(商品名)、HLB＝13.7))、聚氧乙烯對叔壬基苯基醚(例如，商品名「TritonN」系列)、聚氧化烯芳基醚、聚氧化烯多環苯基醚、聚氧乙烯烷基胺醚、氫化聚氧乙烯蓖麻油等HLB值為13至18的非離子性表面活性劑。另外，在不會帶來不利影響的範圍內，也可以將這些非離子性表面活性劑混合在一起使用。2)在標記物質保持部(3)擔持或保持有通過標記成分標記了試劑成分的標記試劑。作為標記成分，可以使用金膠體粒子、銀膠體粒子等金屬膠體粒子、將使各種單體(共)聚合而合成的合成高分子進行染色所得到的著色乳膠粒子、酶、螢光化合物、其它。作為試劑成分，為具有識別分析物的能力的粒子或分子，優選為單克隆抗體或多克隆抗體或其片段(第二試劑)。另外，在本發明中，為了抑制/消除前帶現象，優選設定為以下形態：通過不僅在樣本墊(2)中，而且在標記物質保持部(3)中也事先含浸含有HLB13至18的非離子性且親水性表面活性劑及根據需要的緩衝液的免疫層析用試劑組合物後，使其乾燥等方法而進行擔持。3)層析介質(4)是在膜載體上製作有判定部(也稱為檢測部)(5)的部分。作為膜載體，是可以通過毛細管現象吸收試樣檢體且使其移動的膜載體，只要是流速(展開速度)快的膜，就沒有特別限定。高流率HFR為75(sec/40mm)以下，優選HFR為20至60(sec/40mm)適於抑制/消除前帶現象。更優選為30至60(sec/40mm)，特別優選為36至60(sec/40mm)。例如，其選自由硝化纖維素、醋酸纖維素、尼龍、聚醚碸、聚乙烯醇、聚酯、玻璃纖維、聚烯烴、纖維素、由這些混合纖維形成的人工聚合物構成的組。由這些纖維、織布、無紡布、布、膜等任意一種構成。4)在判定部(5)，單克隆抗體或多克隆抗體或其片段(第一試劑)擔持固定在硝化纖維素的片材上。對於該判定部(5)所用的試劑成分(第一試劑)及標記試劑所用的試劑成分(第二試劑)，其一者或兩者可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，在保持特異性方面，考慮製造成本或抗體的穩定供應時，優選至少一者為多克隆抗體。另外，標記試劑所用的試劑成分(第二試劑)從測定靈敏度等方面來看，更優選特異性高的單克隆抗體。但是，從反應的正確性和有效性的觀點來看，最優選第一試劑及第二試劑兩者都使用單克隆抗體。單克隆抗體、多克隆抗體及其片段是公知的，可以獲得，且可以通過公知的方法進行調整。作為產生抗體的動物種類，為人、小鼠、大鼠、兔、山羊等。作為免疫球蛋白，可以為IgG、IgM、IgA、IgE、IgD的任一種。關於單克隆抗體，按照通常的方法，使利用抗原進行了免疫的小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞雜交，選擇產生目標抗體的雜交瘤，取得由該雜交瘤產生的單克隆抗體。例如，可以參照科勒和米爾斯坦的方法(Nature256(1975)495-497)。多克隆抗體是利用常規方法，通過從對產生動物(例如，人、小鼠、大鼠、兔、山羊、馬等)進行抗原免疫所得到的抗血清中分離目標抗體來獲得。5)吸收部(6)廣泛應用由具有迅速吸收過剩試樣的能力的材料即玻璃纖維、纖維素纖維等構成的濾紙，另外，如果使用還具有保持所吸收的液體不使其逆流的能力的材料，則更優選。特別優選的形態是如(日本特開2012-189346號公報)中公開的形態。6)背板(7)為基材。通過在單面塗敷粘接劑或貼上膠帶，而使單面具有粘接性，在該粘接面上以密接的方式設置有試樣添加部(2)、標記物質保持部(3)、具有檢測部(5)的層析介質(4)及吸收部(6)的一部分或全部。背板(7)作為基材沒有特別限定，只要通過粘接劑使其對於試樣液體成為非透過性、非透溼性的材料即可。以下，舉出各規格的實施例及實施方式說明本發明的有效性，但本發明不限定於這些實施例及實施方式。實施例以下，舉出實施例及比較例說明本發明的意義。其實施方式如下。[實施例1]1.在層析介質上製作判定部使用抗體塗敷機(BioDot社制)在由2.5×25cm的纖維素構成的膜上，塗敷用含有5質量％的異丙醇的磷酸緩衝液(pH7.5)稀釋後的濃度為1.8mg/ml的抗LH(黃體化激素)單克隆抗體並使其乾燥，在層析介質上製作判定部。2.標記試劑溶液的製作在金膠體懸濁液(田中貴金屬工業(株)制：40nm)0.9ml中加入0.1ml磷酸緩衝液(pH7.5)進行混和，再加入0.05ml用磷酸緩衝液(pH7.5)稀釋後的50μg/ml的抗LH單克隆抗體，在室溫靜置10分鐘。接著，加入0.1ml含有0.01質量％的PEG-SH(日本油脂株式會社制，商品名：SUNBRIGHTME-200SH，分子量20000)的Tris緩衝液(pH7.5)，充分攪拌後，以8000×g進行15分鐘離心分離。去除上清液後，加入1ml磷酸緩衝液(pH7.5)。使用超聲波破碎機，使膠體狀的標記試劑很好地分散後，以8000×g進行15分鐘離心分離。去除上清液，加入0.15ml前述磷酸緩衝液，在超聲波破碎機中使其很好地分散，製成標記試劑溶液。3.樣本墊(試樣添加部)的製作向3.0×25cm的人造纖維制墊均勻地塗敷作為非離子性表面活性劑的Tween20(シグマアルドリッチ社制，商品名：Tween(註冊商標)20、HLB(Hydrophile-LipophileBalance)值：16.7)的2質量％水溶液並使其達到表中記載的每單位面積的含量後，在真空乾燥機中進行乾燥，製成樣本墊。4.層析介質的製作在0.78ml的10％海藻糖水溶液中加入上述製作的標記試劑溶液0.22mL並進行混和，均勻添加到1.6×25cm的玻璃纖維制墊上後，在真空乾燥機中進行乾燥，製成標記試劑保持部件。接著，在由背板構成的基材上，粘貼上述製作了判定部的硝化纖維素膜、標記試劑保持部件、上述製作的樣本墊及用於吸收展開的試樣或標記試劑等的纖維素纖維的吸收墊。最後，用切割機切割成寬度為5mm，製作層析介質。5.測定使用通過上述3.製作的層析介質，進行被檢物質即LH的檢測試驗。作為陰性檢體，使用LH為0mIU/mL的男性尿液150μL作為陰性檢體試樣。另外，在表1至3中，作為陽性檢體試樣，使用150μL以40mIU/mL濃度包含LH的男性尿液的稀釋試樣，另外，在表4中，作為陽性檢體試樣，使用150μL以20×106mIU/mL的濃度包含LH的男性尿液的稀釋試樣進行試驗。在表5中，使用LH為0至2×107mIU/mL的濃度範圍的試樣，另外，使用HFR的值為45及75的膜進行試驗。陰性檢體試樣、陽性檢體試樣都在免疫層析用試驗片的樣本墊上添加150μL使其展開，15分後進行肉眼判定。關於流動：測定開始後，在試樣液在膜上展開時，用肉眼確認該液體的展開和標記試劑的紅色的展開。展開的液體和標記試劑以相同或大致相同的速度展開的情況設為「○」，標記試劑在展開的液體中稍慢地展開的情況設為「△」，標記試劑在展開的液體中慢慢展開的情況設為「×」。關於靈敏度：可以確認判定部的紅線的情況設為「○」，可以確認紅線，但顏色非常淡的情況設為「△」，不能確認紅線的情況設為「×」。肉眼判定基準：可以確認判定部的紅線的情況設為「+」，可以清楚地確認的情況設為「++」，可以更強烈地清楚地確認的情況設為「+++」，可以確認紅線，但顏色非常淡的情況設為「±」，不能確認紅線的情況設為「-」。將其試驗結果示於表中。另外，表1至4中使用的非離子性表面活性劑如下所述。[關於非離子性表面活性劑]MN811：日油社制，商品名：ノニオンMN811TritonX100：シグマアルドリッチ社制，商品名：TritonX100Brij35：ICIAmericasInc.的註冊商標，商品名：Brij35Tween20：ICIAmericasInc.的商品名：聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯NP40：ナカライテスク社制，商品名：ノニデットP40在通過上述3.製作的層析介質中，代替向樣本墊(SP)中添加的非離子性表面活性劑Tween20，使用HLB值不同的各種非離子性表面活性劑，進行被檢物質即LH的檢測試驗，並進行由HLB值的差異引起的非離子性表面活性劑的評價研究。向樣本墊(SP)中添加的非離子性表面活性劑的含量為0.2μg/mm2。作為陰性檢體，使用150μL以0mIU/mL的濃度含有LH的男性尿液的稀釋試樣，或者，作為陽性檢體，使用150μL以40mIU/mL的濃度含有LH的男性尿液的稀釋試樣進行試驗。將試驗結果示於表1。[表1]表1表面活性劑MN811TritonX100Brij35Tween20NP40HLB值9.313.715.316.717.7流動×○○○○靈敏度△×○○×含量(μg/mm2)0.20.20.20.20.2從表1的結果顯而易見的是，在使用HLB值為13至18的非離子性且親水性表面活性劑的情況下，LH和標記物質的複合體的從樣本墊朝向吸收部流動的速度以與展開的液體相同或大致相同的速度展開，為良好。另外，可知在使用HLB值為14至17的非離子性且親水性表面活性劑的情況下，檢測線的靈敏度也良好。在流動及靈敏度兩方面，優選Brij35、Tween20，特別是Tween20在保存穩定性方面也理想。在通過上述3.製作的層析介質中，除作為僅在樣本墊(SP)中添加的非離子性表面活性劑，使用Tween20及Brij35並改變其含量以外，以與前述相同的工序方式實施，進行被檢物質LH的檢測試驗，並進行由非離子性表面活性劑的含量差異引起的評價研究。在進行檢查設備的陰性、陽性檢體的評價時，作為陰性檢體，使用150μL以0mIU/mL的濃度含有LH的男性尿液的稀釋試樣，或者作為陽性檢體，使用150μL以40mIU/mL的濃度含有LH的男性尿液的稀釋試樣進行試驗。而且，按照相同的肉眼判定基準進行判定。將試驗結果示於表2。[表2]表2從表2的結果可知，如果僅在樣本墊(SP)中添加的非離子性表面活性劑的Tween20及Brij35的含量為0.20至0.60μg/mm2的範圍，則在流動及靈敏度的兩方面都良好。在含量過多的情況下，有時在裝置製造時或包裝收納時產生剝離等損傷，或有時因為乾燥狀態的不均勻，檢測線的顯色產生不勻。在通過上述3.製作的層析介質中，除在樣本墊(SP)及結合墊(CP)兩者添加非離子性表面活性劑Tween20以外，以與前述相同的工序方式實施。而且，改變Tween20的含量，進行被檢物質即LH的檢測試驗，並進行由含量差異引起的評價研究。在進行檢查設備的陰性、陽性檢體的評價時，作為陰性檢體，使用150μL以0mIU/mL的濃度含有LH的男性尿液的稀釋試樣，或者，作為陽性檢體，使用150μL以40mIU/mL的濃度含有LH的男性尿液的稀釋試樣進行試驗。將試驗結果示於表3。[表3]表3從表3的結果可知，非離子性表面活性劑Tween20可以僅在樣本墊(SP)中添加，但若在樣本墊(SP)及結合墊(CP)兩者中添加則更好。與僅在樣本墊(SP)中添加相比，可知，反而是在樣本墊(SP)及結合墊(CP)兩者中添加時，即使非離子性表面活性劑的總含量是少量，也能在流動及靈敏度兩方面良好地發揮作用。在通過上述1.製作的層析介質中，對於使用的膜的流速(HighFlowRate：將水吸取4cm所花費的時間sec/40mm)特性差異造成的前帶現象的抑制效果進行了評價研究。作為僅在樣本墊(SP)中添加的非離子性表面活性劑，使用Tween20及Brij35，其含量為0.2μg/mm2。作為陽性檢體，除使用150μL以20×106mIU/mL的濃度含有LH的男性尿液的稀釋試樣以外，以與前述相同的操作工序及方式實施。而且，按照相同的肉眼判定基準進行了判定。將其判定結果示於表4。[表4]表4從表4的結果顯而易見的是，膜的高流率為75(sec/40mm)以下時，可得到抑制前帶現象的效果。以下，針對被檢測物質的濃度範圍，對前帶現象的抑制效果進行評價研究，進一步通過使用HFR為45及75的膜，對被檢測物質濃度為0至2×107mIU/mL的濃度範圍的被檢測物質，測定顯色強度(吸光度)。在通過上述1.製作的層析介質中，對於使用的膜的流速(HFR：sec/40mm)特性，使用2種(HF45、HF75)膜。HF45是在僅於樣本墊(SP)中添加非離子性表面活性劑(Tween20、0.4μg/mm2)的情況和在樣本墊(SP)中添加了非離子性表面活性劑(Tween20、0.2μg/mm2)且在結合墊(CP)中也添加了非離子性表面活性劑(Tween20、0.2μg/mm2)的情況下進行測定。HF75是僅在樣本墊(SP)中添加非離子性表面活性劑(Tween20、0.4μg/mm2)進行測定。作為陽性檢體，使用150μL以3至2×107mIU/mL的濃度含有LH的男性尿液的稀釋試樣，且在上述的條件下進行，除此以外，以與前述相同的操作工序及樣式實施，對前帶現象的抑制效果進行評價研究。而且，按照相同的肉眼判定基準進行判定。其判定結果示於表5。顯色強度(吸光度)小於10時，不可能進行肉眼判定，在10以上才可以進行肉眼判定。[表5]從表5的結果可知，在本發明中，可在被檢物質量的極寬的濃度範圍內，非常顯著地發揮抑制/消除前帶現象的效果。圖2是將表5的數據圖表化的圖。觀察該圖表，則可進一步明了本發明起到的抑制/消除前帶現象的效果。更明白，在HF45時，直至被檢物質濃度為20至1×107mIU/mL的範圍，均可進行肉眼判定，在HF75時，直至被檢物質濃度為50至5×105mIU/mL的範圍，均可進行肉眼判定。從該結果可知，膜的流速(展開速度)快的HF45一方與流速(展開速度)慢的HF75相比，可進行肉眼判定的被檢物質濃度區域擴大為低濃度及高濃度兩個區域。即，在高濃度檢體中，極其顯著地發揮前帶現象的抑制/消除效果，另外，證實在低濃度檢體中，顯色也不會減弱，也發揮前帶現象的抑制/消除效果。這樣，本發明人等發現，如本發明的圖1中所看到的那樣的免疫層析試劑盒，至少在試樣添加部(樣本墊)乾燥保持有特定的非離子性表面活性劑，並且作為層析介質使用的膜，使用流速(展開速度)快的膜，由此能夠在極寬的被檢物質濃度範圍內抑制前帶現象，並且起到即使在低的被檢物質濃度下顯色也不減弱，可得到充分的顯色強度這樣的格外顯著的作用。從這些結果可以明確，在通過免疫層析法進行檢體中的檢測對象物的檢查時，至少在試樣添加部(樣本墊)保持HLB值為13至18的非離子性表面活性劑，更優選HLB值為15至17的非離子性表面活性劑，且作為層析介質使用的膜，使用高流率為75(sec/40mm)以下的膜的本發明中，通過加快檢體的流動，在檢測對象物(抗原)佔滿膜上的檢測抗體前，顯色抗體(檢測對象物(抗原)和標記物質的複合體)就可以到達，因此即使是在檢體中大量過剩存在檢測對象物(抗原)的情況，也起到可顯著地抑制前帶現象，並可以進行展開速度快的、S/N比高的正確的判定這樣的顯著效果。工業實用性本發明因具有如下優異的優點，即：能夠用於不需要尿、血液等之類的檢體提取液等，並且，即使在檢體中大量過剩存在檢測對象物(抗原等)時，也可抑制/消除前帶現象並可進行迅速且簡便的檢查、診斷這樣的免疫學的診斷方法及裝置，因此不僅醫院、診所，而且即使是沒有特別的技能的個人，也能夠以高靈敏度進行迅速的臨床檢查，具有與疾病的早期診斷或治療相關聯的利用可能性。另外，能夠處置從低濃度到高濃度這樣的寬泛範圍的檢體，另外，也不需要稀釋液等，再有，因不會引起前帶現象，所以判定基準也簡單明了，因此提供容易且正確的免疫學的診斷方法及裝置。因此，不僅提高了本發明的試劑盒的操作、檢查效率及檢查精度，而且檢查的效率方面、省力方面也改進，所以對檢查機構的產業領域、醫療領域的產業領域的發展非常有幫助。使用特定的方式詳細地說明了本發明，但本領域技術人員顯而易見的是，可在不脫離本發明的意圖和範圍內進行各種變更及變形。此外，本申請基於2014年6月4日所申請的日本專利申請(特願2014-116036)，其全文內容以引用方式併入本文。符號說明1…免疫層析裝置(1)2…試樣添加部(2)(樣本墊、SP)3…標記物質保持部(3)(結合墊、CP)4…層析介質的膜(4)5…檢測線(5)(檢測部、判定部)6…吸收部(6)(吸收墊)7…背板(7)(圖中省略。)8…控制線(8)當前第1頁1 2 3