一種製備鏈黴菌全蛋白的方法
2023-12-06 00:21:56 1
專利名稱：：一種製備鏈黴菌全蛋白的方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，更具體地，本發明涉及一種製備鏈黴菌全蛋白的方法。
背景技術：
：鏈黴菌是一類土壤微生物，呈絲狀生長，具有複雜的生化和形態學分化特徵，因能合成品種繁多的藥用抗生素而受到廣泛的關注。近來，包括天藍色鏈黴菌和阿維鏈黴菌在內的鏈黴菌全基因組測序工作的完成為系統研究這些工業菌株的基因組特性鋪平了道路。實現這個目標最合適的途徑就是通過雙向電泳技術分離和展現細胞粗提物並用質譜技術鑑定所分離到的蛋白。目前，已有包括天藍色鏈黴菌在內的一些鏈黴菌種的相關蛋白質組的分析報導，所用到的蛋白質提取方法主要包括非變性法和變性法兩種。非變性法通常包括透析除鹽和低壓凍幹濃縮兩個步驟；變性法是通過添加化學試劑使蛋白變性而沉澱以達到去除雜質和濃縮的目的，此類化學試劑包括丙酮、三氯乙酸(TCA)、去氧膽酸鈉(D0C)、PEG6000等。雖然有一定數量的文獻關注於雙向電泳樣品製備方法的改進，但所分離得到的蛋白質數量有限，尤其是一些低豐度蛋白。更重要的，已有的有關鏈黴菌蛋白質組學分析的報導中所用到的培養基多為合成培養基或商品化的可溶性複合培養基。工業級的複合培養基發酵過程中，因細胞富含多糖、核酸以及多種次級代謝物等幹擾雙向電泳過程的雜質，目前還沒有簡單有效的製備鏈黴菌全蛋白樣品用於雙向電泳的方法和技術，從而使相關的蛋白質組研究相對基因組研究工作比較滯後。選擇合適的樣品製備方法是決定蛋白質組研究成敗的關鍵步驟。細胞必須進行有效的破碎，同時還要去除雜質並儘量避免蛋白樣品的降解。因此，本領域迫切需要開發出簡單有效的製備鏈黴菌全蛋白樣品的方法，以滿足研究所需
發明內容本發明的目的在於提供一種製備鏈黴菌全蛋白的方法。在本發明的第一方面，提供一種製備鏈黴菌全蛋白樣品的方法，所述方法包括以下步驟(1)將鏈黴菌細胞液氮研磨成乾粉，將乾粉加入Tris-HC1緩衝液，獲得蛋白粗提液；(2)將步驟(l)獲得的蛋白粗提液加入三氯乙酸(TCA)/丙酮溶液中，低溫(優選約-2(TC)沉澱，收集蛋白沉澱；(3)將步驟(2)獲得的蛋白沉澱加入丙酮，超聲波洗滌蛋白沉澱，收集經洗滌的蛋白沉澱，千燥；(4)溶解步驟(3)獲得的經乾燥的蛋白沉澱，獲得鏈黴菌全蛋白樣品。在另一優選例中，在步驟(1)中，所述的蛋白粗提液中還加入蛋白酶抑制劑，所述的蛋白酶抑制劑含有乙二胺四乙酸(EDTA)，苯甲基磺醯氟(PMSF)，抑氨肽酶B素(Bestatin)和胃蛋白酶抑制劑(Pepstatin)。在另一優選例中，在步驟(1)中，乾粉加入含有蛋白酶抑制劑的Tris-HCl緩衝液後，充分混勻，離心，上清即為蛋白粗提液。更優選的，離心的條件是4±2°C，30000士10000g離心40±10分鐘。更優選的，取上清時，排除懸浮於液體表面的脂類物質。在另一優選例中，在步驟(2)中，所述的三氯乙酸/丙酮溶液中三氯乙酸的濃度是10-20wt%。在另一優選例中，在步驟(2)中，所述的三氯乙酸/丙酮溶液中還含有10-50mM(優選20-40mM;最優選約20mM)的二硫蘇糖醇(DTT)。在另一優選例中，在步驟(2)中，以體積計，三氯乙酸/丙酮溶液的加入量是蛋白粗提液的2-5倍。在另一優選例中，在步驟(3)中，超聲波洗滌的條件為30土10W，30±10s，脈衝，處理1-5次。在另一優選例中，超聲波洗滌時，超聲波的振幅為50±20%;優選的是50±10%;更優選的是50±5%。在另一優選例中，在步驟(4)中，將步驟(3)獲得的經乾燥的蛋白沉澱溶解於泡脹液(或稱再水化液)中，離心，上清即為鏈黴菌全蛋白樣品；其中，所述的泡脹液含有5-10M(優選6-8M)尿素，20-40g/L(也即2-4%(w/v))3-(3-膽胺丙基)二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPS)，10-50mM二硫蘇糖醇(優選為20-40mM;最優選約20mM)，10-20g/L(也即1-2%(w/v))pH3-10的兩性電解質；並且，所述的泡脹液中基本上不含有硫脲。在另一優選例中，所述的泡脹液中還含有痕量的溴酚藍，如0.002°/。(體積)的溴酚藍。在另一優選例中，所述的泡脹液由尿素，CHAPS，DTT，pH3-IO的兩性電解質組成。在另一優選例中，在步驟(4)中，離心的條件是15±2°C，40000士10000g離心60±15分鐘。在另一優選例中，在步驟(1)之前，還包括將獲自鏈黴菌培養物的鏈黴菌細胞進行水洗滌；更優選的，將洗滌後的細胞於4±2°C，12000士3000g離心3-5min以除去多餘水分。在本發明的第二方面，提供一種蛋白酶抑制劑，所述的蛋白酶抑制劑含有乙二胺四乙酸(EDTA)，苯甲基磺醯氟(PMSF)，抑氨肽酶B素(Bestatin)和胃蛋白酶抑制劑(P印statin)。在另一優選例中，所述的蛋白酶抑制劑由乙二胺四乙酸，苯甲基磺醯氟，抑氨肽酶B素和胃蛋白酶抑制劑組成。在另一優選例中，所述的蛋白酶抑制劑中各組分的摩爾比例是乙二胺四乙酸苯甲基磺醯氟抑氨肽酶B素胃蛋白酶抑制劑=(4±2):(6±2):(0.02±0.01):(0.03±0.01)。在另一優選例中，所述的蛋白酶抑制劑用於防止鏈黴菌全蛋白中各蛋白被降解。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1顯示了阿維鏈黴菌全蛋白樣品雙向電泳圖譜；其中，MW為蛋白質分子量標準，單位是KDa。圖2顯示了糖多孢鏈黴菌全蛋白樣品雙向電泳圖譜。圖3顯示了改變細胞破碎方法後製備的阿維鏈黴菌全蛋白樣品的雙向電泳圖譜。圖4顯示了經洗滌千燥的蛋白沉澱用泡脹液溶解後，離心條件採用為15°C，18000g，30min，最終獲得的阿維鏈黴菌全蛋白樣品的雙向電泳圖譜。圖5顯示了在製備過程中採用含7M尿素、2M硫脲、2。/。(w/v)CHAPS、lX(v/v)兩性電解質(pH3-IO)和20mMDTT以及痕量溴酚藍的泡脹液溶解蛋白沉澱，最終獲得的阿維鏈黴菌全蛋白樣品的雙向電泳圖譜。具體實施方式本發明人經過長期的研究，開發出一種效果優異的製備鏈黴菌全蛋白的方法，利用所述的方法，鏈黴菌蛋白樣品分離效果非常理想，可儘可能完整地得到細胞所表達的全蛋白，在製備過程中不發生明顯的蛋白降解現象。在此基礎上完成了本發明。製備鏈黴菌全蛋白的方法本發明所述的製備鏈黴菌全蛋白樣品的方法，包括以下步驟(1)將鏈黴菌細胞液氮研磨成乾粉，將乾粉加入Tris-HC1緩衝液，獲得蛋白粗提液；(2)將步驟(l)獲得的蛋白粗提液加入TCA/丙酮溶液中，低溫沉澱，收集蛋白沉澱；(3)將步驟(2)獲得的蛋白沉澱加入丙酮，超聲波洗滌沉澱，收集經洗滌的蛋白沉澱，乾燥；(4)溶解步驟(3)獲得的經乾燥的蛋白沉澱，獲得鏈黴菌全蛋白樣品。細胞被有效地破碎是製備鏈黴菌全蛋白的關鍵步驟，也是獲得完整的全蛋白的前提。在本發明的方法中，將鏈黴菌細胞液利用液氮研磨形成乾粉，然後加入到緩衝液中，獲得蛋白粗提液。本發明人發現，液氮研磨具有特別優異的破碎鏈黴菌細胞的效果，採用該方法在徹底破碎細胞的同時，對細胞內的蛋白造成最小的損傷。而其它細胞破碎方法如超聲波破碎、珠磨法破碎、壓力杯法破碎等效果均不夠理想，不是容量過小，就是易於損壞設備，且蛋白得率沒有優勢，甚至可導致蛋白的降解或損傷，不宜採用。用液氮研磨法破碎細胞的方法通常是先將細胞用液氮凍結，然後進行研磨，研磨過程中還可不斷加入液氮，直至呈乾粉狀。作為本發明的優選方式，為了防止在細胞破碎後以及後續的過程中蛋白被蛋白酶所降解，在所述的蛋白粗提液中還可加入蛋白酶抑制劑。可選擇本領域常用的多種蛋白酶抑制劑。作為本發明的更優選的方式，所述的蛋白酶抑制劑含有乙二胺四乙酸(EDTA)，苯甲基磺醯氟(PMSF)，抑氨肽酶B素(Bestatin)和胃蛋白酶抑制劑(P印statin)。更優選的，所述的蛋白酶抑制劑的在蛋白粗提液中的終濃度是EDTA4土2mM;PMSF6士2mM;Bestatin20±10線P印statin30士10uM。作為本發明的優選方式，在步驟(1)中，乾粉加入含有蛋白酶抑制劑的Tris-HC1緩衝液後，充分混勻，離心，取上清作為蛋白粗提液。優選地，離心的條件是4士2。C，30000土10000g離心40土10分鐘。更優選地，取上清時，排除懸浮於液體表面的脂類物質以儘量避免雜質的影響。本發明可採用常規的Tris-HCl緩衝液；作為本發明的優選方式，所述的Tris-HC1緩衝液的濃度是40土10mM，pH值是7.4±0.4。作為本發明的優選方式，在步驟(2)中，所述的TCA/丙酮溶液中TCA的濃度是10-20wt%。更優選的，所述的TCA/丙酮溶液中還含有10-50mM(優選20-40mM)的二硫蘇糖醇(DTT)，所述的DTT用以還原二硫鍵。更優選地，所述的TCA/丙酮溶液於低溫(優選的是-5--50°C，如約-2(TC)預冷半小時以上後使用。作為本發明的優選方式，在步驟(2)中，以體積計，TCA/丙酮溶液的加入量是細胞粗提液的2-5倍，如約3倍。在將蛋白粗提液加入TCA/丙酮溶液中後，在低溫下進行沉澱，所述的低溫優選的是-5--5(TC，如約-2(TC。優選的，可將溶液置於-2(TC沉澱2-16小時，收集蛋白沉澱。作為本發明的優選方式，在步驟(2)中，採用離心方法收集蛋白沉澱，所得上清雜質含量少。作為本發明的優選方式，所述步驟(2)中，蛋白粗提液加TCA/丙酮溶液後於低溫(優選的是-5--50°C，如約-2(TC)放置2小時以上或過夜；優選為2-3小時，可保證操作的連續性，避免蛋白長時間暴露於酸性溶液中。沉澱後於4土2°C，18000-40000g離心45士15min。在製備全蛋白的過程中，雜質的去除也是關鍵之一。本發明人發現，在步驟(3)中，採用超聲波洗滌來去除雜質具有良好的去除雜質的效果，可將TCA等徹底地洗去，最終獲得質量穩定的全蛋白；而採用其它方法洗滌，最終獲得的全蛋白質量不穩定，等電聚焦時電壓不穩定，重複性不好。作為本發明的優選方式，在歩驟(3)中，超聲波洗滌的條件為30土10W，30士10s，處理l-5次；更優選的條件是；30士5W，30土5s，低溫(如冰浴)處理2-3次。作為本發明的優選方式，在超聲波洗滌後，採用離心方法收集蛋白沉澱。優選的離心條件為4土2。C，40000士10000g，離心45土15min。作為本發明的優選方式，在超聲波洗滌並沉澱後，可將蛋白沉澱進行自然乾燥，形成乾粉。乾燥優選的是低溫乾燥，溫度優選在-20-4X:下進行。在步驟(4)中，可採用本領域常用的溶解蛋白的溶劑(或緩衝液)來溶解前述經乾燥的蛋白沉澱。更優選的，在充分溶解蛋白沉澱以後，可通過離心(優選高速離心)等方法去除未溶解的雜質，從而提高蛋白的純度。作為本發明的優選方式，在步驟(4)中，用泡脹液來溶解蛋白沉澱，溶解於泡脹液的蛋白樣品可直接用於電泳(如雙向電泳)。更優選地，所述的泡脹液含有5-10M尿素，2-4%CHAPS，10-50mMDTT，1-2%(體積)pH3-10的兩性電解質。優選地，將蛋白溶解於泡脹液後，還通過離心的方法去除一些未溶解的雜質。作為本發明的優選方式，離心的條件是15±2°C，40000土10000g離心60土15分鐘，該條件下離心在徹底地除去雜質的同時，可儘量地保持上清中蛋白的完整性。作為本發明的優選方式，所述的泡脹液中基本上不含有硫脲。所述的基上不含有是指硫脲在泡脹液中的濃度低於O.5M;優選低於0.2M;更優選低於0.1M;最優選低於0.05M或更低。在常規用於蛋白溶解時，硫脲的加入通常會起到增溶作用，能加強蛋白的溶解，但本發明中，硫脲的加入同時會增加雜質的溶入，造成蛋白樣品在雙向電泳時產生一定的橫向拖尾與圖譜的扭曲變形，故硫脲不適用於複合培養基鏈黴菌蛋白的提取。作為本發明的優選方式，所述的泡脹液中還含有痕量(約0.001-0.005%(體積))的溴酚藍，如0.002%(體積)的溴酚藍。作為本發明的優選方式，所述步驟(4)中，為了使儘可能多的蛋白溶解於泡脹液中，蛋白沉澱在加入泡脹液後於室溫下不斷攪拌半個小時以上，注意避免泡沫產生。本發明所採用的鏈黴素細胞可直接分離自鏈黴菌培養基，作為本發明的優選方式，在步驟(1)之前，還包括將獲自鏈黴菌培養物的鏈黴菌細胞進行水洗滌；更優選的，將洗滌後的細胞於4土2。C，12000士3000g高速離心3-5分鐘以除去多餘的水分。本發明中，鏈黴菌的培養可採用本領域常用的方法，也可採用工業級的複合i肯養基培養o本發明的方法釆用三氯乙酸和丙酮提取蛋白，有效的去除細胞中的多糖、脂類、核酸和多種次級代謝物等雜質。本發明可將蛋白沉澱直接溶於泡脹液，高速離心可明顯去除不溶性雜質，得到的樣品可直接用於固相IPG膠條，而優選的蛋白酶抑制劑複合物則能夠有效的防止樣品製備過程中蛋白的降解。本發明的製備鏈黴菌全蛋白樣品的方法快速、簡單易行，可獲得較高質量的重複性較好的雙向電泳圖譜，便於後續的生物質譜分析鑑定蛋白，具有較大的實際應用價值。蛋白酶抑制劑本發明還提供一種特別適用於防止鏈黴菌全蛋白中各蛋白被降解的蛋白酶抑制劑，所述的蛋白酶抑制劑含有乙二胺四乙酸，苯甲基磺醯氟，抑氨肽酶B素和胃蛋白酶抑制劑。作為本發明的優選方式，所述的蛋白酶抑制劑中各組分的摩爾比如下乙二胺四乙酸苯甲基磺醯氟抑氨肽酶B素胃蛋白酶抑制劑=(4±2):(6±2):(0.02±0.01):(0.03±0.01)。其中，PMSF可抑制絲氨酸蛋白酶例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，也可抑制半胱氨酸蛋白酶和乙醯膽鹼酯酶；Bestatin對氨肽酶B和亮氨酸氨肽酶有強的抑制作用，並能抑制精氨酸/3-萘醯胺和亮氨酸/3-萘醯胺的水解；P印statin可抑制胃蛋白酶等酸性蛋白酶的降解作用；EDTA作為螯合劑不可逆地使金屬離子蛋白酶失活。這四種試劑的結合使用加入可非常好地保護鏈黴菌全蛋白免受蛋白酶的降解。本發明的主要優點在於(1)本發明的製備鏈黴菌全蛋白的方法簡單易行，利用所述的方法，鏈黴菌蛋白樣品分離效果較好，可儘可能完整地得到細胞所表達的全蛋白，在製備過程中不發生明顯的蛋白降解現象。(2)利用本發明製備的鏈黴菌全蛋白，可獲得高質量且重複性好的雙向電泳圖譜，便於後續的生物質譜分析，具有極大的實際應用價值。(3)首次揭示能有效抑制鏈黴菌全蛋白提取過程中蛋白降解的複合蛋白酶抑制劑。該抑制劑比目前商品化的細菌蛋白酶抑制劑抑制作用高5-6倍。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sarabrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。實施例1製備阿維鏈黴菌全蛋白雙向電泳樣品液並進行雙向電泳分析1.全蛋白的製備本實施例中，製備阿維鏈黴菌(又稱除蟲鏈黴菌，中國農業微生物菌種保藏中心保藏號41509)全蛋白，採用的製備方法如下1)過濾收集用複合培養基(發酵培養基玉米澱粉13%;豆餅粉3%;酵母粉1%)發酵48h得到的阿維鏈黴菌培養物30ml，快速離心洗滌，每次離心條件為4°C，3000g，lmin。洗滌後的細胞沉澱再於4°C，12000g離心3min,細胞沉澱迅速投入液氮凍結。2)將步驟l)中得到的細胞沉澱挖出稱重，然後迅速置於研缽中研磨，研磨過程不斷加入液氮。直至研磨成乾粉。3)按與溼細胞重的質量體積比1:2取40raMTris-HCl緩衝液(pH7.4)，分別加入EDTA、PMSF(購自Sigma)、Bestatin(購自Ameresco)、Pepstatin(購自Ameresco)的儲備液，使終濃度分別為4mM、6mM、20yM和30uM。將步驟2)中得到的乾粉加入此緩衝液中混勻製成勻漿液，然後於4'C，30000g離心30niin。上清液為細胞蛋白粗提液。4)將步驟3)中的細胞蛋白粗提液吸出，吸出時注意避開漂浮於液體上層的脂類物質。加入三倍體積的濃度為10%的TCA/丙酮溶液(含20mMDTT)，於-20。C放置3h。5)取出步驟3)得到的懸浮液，於4。C，40000g離心30min。棄上清得到含有部分細胞雜質在內的蛋白質沉澱物。6)取-2(TC預冷半個小時以上的丙酮，加入步驟5)得到的沉澱物中重懸，用超聲波處理洗滌，超聲波條件為30W，振幅50%，30s脈衝處理三次操作始終在冰浴中進行，然後離心。離心條件為4°C，40000g，30min。如此洗滌兩次，充分洗去TCA等殘留物。洗滌後的沉澱物於4°C自然乾燥得乾粉。7)取出步驟6)所得到的乾粉，稱重，按每150mg乾粉加500ml泡脹液的量加入泡脹液，泡脹液含8M尿素、2%(w/v)CHAPS、ly。(w/v)兩性電解質(Ampholyte,購自Amersham)pH3-10和20mMDTT以及0.002%(體積)的溴酚藍。在室溫下不斷攪拌使蛋白充分溶解於泡脹液，注意溫度不超過3(TC，小心攪袢避免泡沬產生。如此間歇攪拌半個小時以上，於15。C，40000g離心lh，得到的上清為較純淨的蛋白提取液。2.雙向電泳通過上述過程提取的蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度，結果表明上述得到的阿維鏈黴菌全蛋白提取液中蛋白濃度為3-6mg/ml。按照如下方法進行雙向電泳利用EttanIPGphor等電聚焦系統(AmershamBiosciences)進行等電聚焦。在進行第一向等電聚焦電泳時，溫度20°C，電泳條件為OV8h，30V8h，500Vlh，隨後1000Vlh，最後8000V電泳6h，總伏時數達到49740Vhr。然後將聚焦後的固相pH梯度膠條在15mL平衡緩衝液I(50mmol/LTris-HC1緩衝液，pH8.8;6mol/L尿素；30%甘油;2%SDS;1%二硫蘇糖醇)中平衡15min，然後在lOmL平衡緩衝液II(50mmol/LTris-HCl緩衝液，pH8.8;6mol/L尿素；30%甘油，2%SDS;2.5/%碘乙醯胺)中平衡15min。將平衡後的膠條轉移到第二向凝膠上。第二向電泳利用EUanMLTsixsystem(AmershamBiosciences)在13.5%SDS-聚丙烯醯胺凝膠上進行(平均每塊凝膠25raA恆流電泳，溴酚藍指示劑跑出凝膠時電泳結束)。凝膠用考馬斯亮藍R-250染色後，甲醇/醋酸系統脫色。結果如圖l所示，結果表明該阿維鏈黴菌蛋白樣品分離效果較好，沒有發生明顯的蛋白降解。實施例2製備糖多孢鏈黴菌全蛋白雙向電泳樣品液並進行雙向電泳分析1.全蛋白的製備本實施例中，製備糖多孢鏈黴菌(又稱糖多孢紅黴菌，菌株編號NRRL2338)全蛋白，採用的製備方法如下1)過濾收集用複合培養基(發酵培養基澱粉5%,糊精2%，玉米漿1.5%，黃豆餅粉1.6%，豆油3%)發酵48h得到的糖多孢鏈黴菌培養物30ml，快速離心洗滌，每次離心條件為4°C，3000g，lmin。洗滌後的細胞沉澱再於4°C，12000g離心3min，細胞沉澱迅速投入液氮凍結。2)將步驟l)中得到的細胞沉澱挖出稱重，然後迅速置於研缽中研磨，研磨過程不斷加入液氮。直至研磨成乾粉。3)按與溼細胞重的質量體積比1:2取40raMTris-HCl緩衝液(pH7.4)，分別加入EDTA、PMSF、Bestatin、P印statin的儲備液，使終濃度分別為4mM、6mM、20uM禾B30uM。將步驟2)中得到的乾粉加入此緩衝液中混勻製成勻漿液，然後於4'C，30000g離心30min。得到細胞粗提液。4)將步驟3)中的細胞粗提液吸出，吸出時注意避開漂浮於液體上層的脂類物質。加入三倍體積的濃度為10y。的TCA/丙酮溶液(含20mMDTT)，於-20。C放置3h。5)取出步驟3)得到的懸浮液，於4。C，40000g離心30min。棄上清得到含有部分細胞雜質在內的蛋白質沉澱物。6)取-2(TC預冷半個小時以上的丙酮，加入步驟5)得到的沉澱物中重懸，用超聲波處理洗滌，超聲波條件為30W，振幅50%，30s處理三次，操作始終在冰浴中進行，然後離心。離心條件為4°C，40000g，30min。如此洗滌兩次，充分洗去TCA等殘留物。洗漆後的沉澱物於4'C自然乾燥得乾粉。7)取出步驟6)所得到的乾粉，稱重，按每150mg乾粉加500ml泡脹液的量加入泡脹液，泡脹液含8M尿素、2%(w/v)CHAPS、l%(w/v)兩性電解質pH3-10和20mMDTT以及0.002%(體積)的溴酚藍。在室溫下不斷攪拌使蛋白充分溶解於泡脹液，注意溫度不超過3(TC，小心攪拌避免泡沬產生。如此間歇攪拌半個小時以上，於15。C，40000g離心lh，得到的上清為較純淨的蛋白提取液。2.雙向電泳通過上述過程提取的蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度，結果表明上述得到的阿維鏈黴菌全蛋白提取液中蛋白濃度為3-6rag/ml。按照如下方法進行雙向電泳利用EttanIPGphor等電聚焦系統(AmershamBiosciences)進行等電聚焦。在進行第一向等電聚焦電泳時，溫度20°C,電泳條件為0V8h，30V8h，500Vlh，隨後1000Vlh，最後8000V電泳6h，總伏時數達到49740Vhr。然後將聚焦後的固相pH梯度膠條在15mL平衡緩衝液I(50mmol/LTris-HC1緩衝液，pH8.8;6mol/L尿素；30%甘油；2%SDS;1%二硫蘇糖醇)中平衡15min，然後在lOmL平衡緩衝液II(50mmol/LTris-HC1緩衝液，PH8.8;6mol/L尿素；30%甘油，2%SDS;2.5/%碘乙醯胺)中平衡15min。將平衡後的膠條轉移到第二向凝膠上。第二向電泳利用EttanDALTsixsystem(AmersharaBiosciences)在13.5%SDS-聚丙烯醯胺凝膠上進行(平均每塊凝膠25mA恆流電泳，溴芬蘭指示劑跑出凝膠時電泳結束)。凝膠用考馬斯亮藍R-250染色後，甲醇/醋酸系統脫色。結果如圖2所示，結果表明該阿維鏈黴菌蛋白樣品分離效果較好，沒有發生明顯的蛋白降解。圖2中MW為蛋白質分子量標準，單位是KDa。實施例3製備阿維鏈黴菌全蛋白雙向電泳樣品液並進行雙向電泳分析1.全蛋白的製備此實施例中，製備阿維鏈黴菌全蛋白，與實施例l和2所採用的細胞破碎方法不同，其他步驟類似，具體方法如下1)過濾收集用複合培養基(發酵培養基玉米澱粉13%;豆餅粉3%;酵母粉1。/。)發酵48h得到的阿維鏈黴菌培養物30ml，快速離心洗滌，每次離心條件為4°C，3000g，lmin。洗滌後的細胞沉澱再於4°C，12000g離心3min，細胞沉澱迅速投入液氮凍結。2)將步驟l)中得到的細胞沉澱挖出稱重，按與溼細胞重的質量體積比2:l加入40mMTris-HCl緩衝液(pH7.4)，分別加入EDTA、PMSF、Bestatin、Pepstatin的儲備液，使終濃度分別為4mM、6mM、20uM和30uM。冰浴中融溶製成細胞懸浮液，超聲波處理，超聲波條件為IOOW，振幅50%，脈衝，間歇處理5min，然後於4t:，40000g離心30min。得到細胞粗提液。3)將步驟2)中的細胞粗提液吸出，吸出時注意避開漂浮於液體上層的脂類物質。加入三倍體積的濃度為10y。的TCA/丙酮溶液(含20mMDTT)，於-20°C放置3h。4)取出步驟3)得到的懸浮液，於4"C，40000g離心30min。棄上清得到含有部分細胞雜質在內的蛋白質沉澱物。5)取-2(TC預冷半個小時以上的丙酮，加入步驟4)得到的沉澱物中重懸，用超聲波處理洗滌，超聲波條件為30W，振幅50%，30s處理三次，操作始終在冰浴中進行，然後離心。離心條件為4'C，40000g，30min。如此洗滌兩次，充分洗去TCA等殘留物。洗滌後的沉澱物於4°C自然乾燥得乾粉。6)取出步驟5)所得到的乾粉，稱重，按每150mg乾粉加500ml泡脹液的量加入泡脹液，泡脹液含8M尿素、2%(w/v)CHAPS、ly。(w/v)兩性電解質pH3-10和50mMDTT以及O.002%(體積)的溴酚藍。在室溫下不斷攪拌使蛋白充分溶解於泡脹液，注意溫度不超過3(TC，小心攪拌避免泡沫產生。如此間歇攪拌半個小時以上，於15。C，40000g離心lh，得到的上清為蛋白提取液。2.雙向電泳通過上述過程提取的蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度，結果表明上述得到的阿維鏈黴菌全蛋白提取液中蛋白濃度為l-3mg/ml。按照如下方法進行雙向電泳利用EttanIPGphor等電聚焦系統(AmershamBiosciences)進行等電聚焦。在進行第一向等電聚焦電泳時，溫度20。C，電泳條件為0V8h，30V8h，500Vlh，隨後1000Vlh，最後8000V電泳6h，總伏時數達到49740Vhr。然後將聚焦後的固相pH梯度膠條在15mL平衡緩衝液I(50mmol/LTris-HC1緩衝液，pH8.8;6mol/L尿素；30%甘油；2%SDS;1%二硫蘇糖醇)中平衡15min，然後在lOmL平衡緩衝液II(50mmol/LTris-HCl緩衝液，pH8.8;6mol/L尿素;30%甘油，2%SDS;2.5/%碘乙醯胺)中平衡15min。將平衡後的膠條轉移到第二向凝膠上。第二向電泳利用EttanDALTsixsystem(AmershamBiosciences)在13.5%SDS-聚丙烯醯胺凝膠上進行(平均每塊凝膠25raA恆流電泳，溴芬蘭指示劑跑出凝膠時電泳結束)。凝膠用考馬斯亮藍R-250染色後，甲醇/醋酸系統脫色。結果如圖3所示，結果表明該阿維鏈黴菌蛋白樣品分離效果差，有很明顯的橫向或縱向拖尾現象，說明在細胞破碎過程中細胞內的一些蛋白遭到降解或損傷。圖3中MW為蛋白質分子量標準，單位是KDa。實施例4製備阿維鏈黴菌全蛋白雙向電泳樣品液並進行雙向電泳分析1.全蛋白的製備本實施例中，製備阿維鏈黴菌全蛋白樣品，本實施例與實施例l、2所採用的方法類似，區別在於蛋白沉澱用泡脹液溶解後離心條件不同，離心條件為15。C,18000g，30min。步驟如下1)過濾收集用複合培養基(發酵培養基澱粉5%，糊精2%，玉米漿1.5%，黃豆餅粉1.6%，豆油3%)發酵48h得到的糖多孢鏈黴菌培養物30ml，快速離心洗滌，每次離心條件為4°C，3000g，lmin。洗滌後的細胞沉澱再於4。C，12000g離心3min，細胞沉澱迅速投入液氮凍結。2)將步驟l)中得到的細胞沉澱挖出稱重，然後迅速置於研缽中研磨，研磨過程不斷加入液氮。直至研磨成乾粉。3)按與溼細胞重的質量體積比1:2取40mMTris-HC1緩衝液(pH7.4)，分別加入EDTA、PMSF、Bestatin、Pepstatin的儲備液，使終濃度分別為4mM、6mM、20yM禾n30nM。將步驟2)中得到的乾粉加入此緩衝液中混勻製成勻漿液，然後於4t:，30，000g離心30min。得到細胞粗提液。4)將步驟3)中的細胞粗提液吸出，吸出時注意避開漂浮於液體上層的脂類物質。加入三倍體積的濃度為10y。的TCA/丙酮溶液(含20mMDTT)，於-20。C放置3h。5)取出步驟3)得到的懸浮液，於4。C，40，000g離心30rain。棄上清得到含有部分細胞雜質在內的蛋白質沉澱物。6)取-20'C預冷半個小時以上的丙酮，加入步驟5)得到的沉澱物中重懸，用超聲波處理洗滌，超聲波條件為30W，振幅50%，30s處理三次，操作始終在冰浴中進行。如此洗滌兩次，充分洗去TCA等殘留物。每次離心條件均為4。C，40000g，30min。洗滌後的沉澱物於4°C自然乾燥得乾粉。7)取出步驟6)所得到的乾粉，稱重，按每150rag乾粉加500ml泡脹液的量加入泡脹液，泡脹液含8M尿素、2%(w/v)CHAPS、l呢(w/v)兩性電解質pH3-10和20mMDTT以及0.002%(體積)的溴酚藍。在室溫下不斷攪拌使蛋白充分溶解於泡脹液，注意溫度不超過3(TC，小心攪拌避免泡沬產生。如此間歇攪拌半個小時以上，於15。C，18000g離心30min。取上清上樣。2.雙向電泳通過上述過程提取的蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度，結果表明上述得到的阿維鏈黴菌全蛋白提取液中蛋白濃度為3-6mg/ml。按照如下方法進行雙向電泳利用EUanIPGphor等電聚焦系統(AmershamBiosciences)進行等電聚焦。在進行第一向等電聚焦電泳時，溫度20°C，電泳條件為0V8h，30V8h，500Vlh，隨後1000Vlh，最後8000V電泳6h，總伏時數達到60000Vhr以上。然後將聚焦後的固相pH梯度膠條在15mL平衡緩衝液I(50mmol/LTris-HC1緩衝液，pH8,8;6mol/L尿素；30%甘油;2%SDS;1%二硫蘇糖醇)中平衡15min，然後在10mL平衡緩衝液II(50mmol/LTris-HCl緩衝液，pH8.8;6mol/L尿素；30%甘油，2%SDS;2.5/%碘乙醯胺)中平衡15min。將平衡後的膠條轉移到第二向凝膠上。第二向電泳利用EttanDALTsixsystem(AmershamBiosciences)在13.5%SDS-聚丙烯醯胺凝膠上進行(平均每塊凝膠25mA恆流電泳，溴芬蘭指示劑跑出凝膠時電泳結束)。凝膠用考馬斯亮藍R-250染色後，甲醇/醋酸系統脫色。結果如圖4所示，結果表明該阿維鏈黴菌蛋白樣品含有一些不溶性雜質，幹擾等電聚焦，使樣品較難走至陽極端。圖4中MW為蛋白質分子量標準，單位是KDa。實施例5製備阿維鏈黴菌全蛋白雙向電泳樣品液並進行雙向電泳分析1.全蛋白的製備此實施例與實施例l、2所採用的方法類似，區別在於溶解蛋白沉澱所用泡脹液不同；本實施例澱所用泡脹液配方為7M尿素、2M硫脲、2%(w/v)CHAPS、l%(w/v)兩性電解質pH3-10和50mMDTT。具體步驟如下1)過濾收集用複合培養基(種子培養基澱粉3%，糊精2%，玉米漿2%，黃豆餅粉1.5%，豆油0.4%;發酵培養基澱粉5%，糊精2%，玉米漿1.5%，黃豆餅粉1.6%，豆油3%)發酵48h得到的糖多孢鏈黴菌培養物30ml，快速離心洗滌，每次離心條件為4°C，3000g，lmin。洗滌後的細胞沉澱再於4'C，12，000g離心3min，細胞沉澱迅速投入液氮凍結。2)將步驟l)中得到的細胞沉澱挖出稱重，然後迅速置於研缽中研磨，研磨過程不斷加入液氮。直至研磨成乾粉。3)按與溼細胞重的質量體積比1:2取40mMTris-HC1緩衝液(pH7.4)，分別加入EDTA、PMSF、Bestatin、P印statin的儲備液，使終濃度分別為4mM、6mM、20uM和30yM。將步驟2)中得到的乾粉加入此緩衝液中混勻製成勻漿液，然後於4。C，30000g離心30min。得到細胞粗提液。4)將步驟3)中的細胞粗提液吸出，吸出時注意避開漂浮於液體上層的脂類物質。加入三倍體積的濃度為10。/。的TCA/丙酮溶液(含20mMDTT)，於-20°C放置3h。5)取出步驟3)得到的懸浮液，於4'C，40000g離心30min。棄上清得到含有部分細胞雜質在內的蛋白質沉澱物。6)取-2(TC預冷半個小時以上的丙酮，加入步驟5)得到的沉澱物中重懸，用超聲波處理洗滌，超聲波條件為30W，振幅50%，30s處理三次，操作始終在冰浴中進行。如此洗滌兩次，充分洗去TCA等殘留物。每次離心條件均為4°C，40，OOOg，30min。洗滌後的沉澱物於4°C自然乾燥得乾粉。7)取出步驟6)所得到的乾粉，稱重，按每150mg乾粉加500ml泡脹液的量加入泡脹液，泡脹液含7M尿素、2M硫脲、2%(w/v)CHAPS、1。/。(w/v)兩性電解質pH3-10和50mMDTT以及0.002%(體積)的溴酚藍。在室溫下不斷攪拌使蛋白充分溶解於泡脹液，注意溫度不超過3(TC，小心攪拌避免泡沬產生。如此間歇攪拌半個小時以上，於15t:，40000g離心30min。取上清上樣。2.雙向電泳通過上述過程提取的蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度，結果表明上述得到的阿維鏈黴菌全蛋白提取液中蛋白濃度為3-6mg/ml。按照如下方法進行雙向電泳利用EttanIPGphor等電聚焦系統(AmershamBiosciences)進行等電聚焦。在進行第一向等電聚焦電泳時，溫度20°C，電泳條件為0V8h，30V8h，500Vlh，隨後1000Vlh，最後8000V電泳6h，總伏時數達到60000Vhr以上。然後將聚焦後的固相pH梯度膠條在15mL平衡緩衝液I(50mmol/LTris-HC1緩衝液，pH8.8;6mol/L尿素；30%甘油；2%SDS;1%二硫蘇糖醇)中平衡15min，然後在10mL平衡緩衝液II(50匪ol/LTris-HCl緩衝液，pH8.8;6mol/L尿素;30%甘油，2%SDS;2.5/%碘乙醯胺)中平衡15min。將平衡後的膠條轉移到第二向凝膠上。第二向電泳利用EttanDALTsixsystem(AmershamBiosciences)在13.5%SDS-聚丙烯醯胺凝膠上進行(平均每塊凝膠25mA恆流電泳，溴芬蘭指示劑跑出凝膠時電泳結束)。凝膠用考馬斯亮藍R-250染色後，甲醇/醋酸系統脫色。結果如圖5所示，結果表明該阿維鏈黴菌蛋白樣品含少量雜質，造成蛋白圖譜變形，一定程度影響解析度。圖5中MW為蛋白質分子量標準，單位是KD。實施例6製備阿維鏈黴菌全蛋白雙向電泳樣品液並進行雙向電泳分析此實施例與實施例l、2所採用的方法類似，區別在於洗滌蛋白沉澱時未用超聲波。實驗結果表明未用超聲波洗滌的蛋白樣品，質量有不穩定現象，等電聚焦時電壓不穩定，重複性不夠理想。實施例7蛋白酶抑制劑的選擇以鏈黴菌靜止期細胞勻漿液為蛋白酶液，0.6%的酪蛋白為底物，加入不同濃度配比的蛋白酶抑制劑，以蛋白酶活抑制百分數為指標，進行正交試驗。結果發現，各組分在反應體系中的終濃度如下時具有最優的效果EDTA4mM，PMSF6mM，Bestatin20線P印statin30pM。以商品化細菌蛋白酶抑制劑CompleteMini(購自Roche,Germany)作為對照，抑制作用對比如下表1所示表1tableseeoriginaldocumentpage20可見，採用本發明的蛋白酶抑制劑，抑制效力比採用常規商品化蛋白酶抑制劑高5-6倍。進一步的試驗發現，在EDTA終濃度為2-6mM;PMSF終濃度為4-8mM;Bestatin終濃度為10-30uM;Pepstatin終濃度為20-40uM的反應系統內，蛋白酶抑制劑的效果均比較理想，抑制效力均顯著優於商品化蛋白酶抑制劑。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。權利要求1.一種製備鏈黴菌全蛋白樣品的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟(1)將鏈黴菌細胞液氮研磨成乾粉，將乾粉加入Tris-HCl緩衝液，獲得蛋白粗提液；(2)將步驟(1)獲得的蛋白粗提液加入三氯乙酸/丙酮溶液中，低溫沉澱，收集蛋白沉澱；(3)將步驟(2)獲得的蛋白沉澱加入丙酮，超聲波洗滌蛋白沉澱，收集經洗滌的蛋白沉澱，乾燥；(4)溶解步驟(3)獲得的經乾燥的蛋白沉澱，獲得鏈黴菌全蛋白樣品。2.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在步驟(1)中，所述的蛋白粗提液中還加入蛋白酶抑制劑，所述的蛋白酶抑制劑含有乙二胺四乙酸，苯甲基磺醯氟，抑氨肽酶B素和胃蛋白酶抑制劑。3.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在步驟(2)中，所述的三氯乙酸/丙酮溶液中三氯乙酸的濃度是10-20wt%。4.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在步驟(2)中，所述的三氯乙酸/丙酮溶液中還含有10-50mM的二硫蘇糖醇。5.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在步驟(2)中，以體積計，三氯乙酸/丙酮溶液的加入量是蛋白粗提液的2-5倍。6.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在步驟(3)中，超聲波洗滌的條件為30士10W，30土10s，脈衝，處理1-5次。7.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在步驟(4)中，將步驟(3)獲得的經乾燥的蛋白沉澱溶解於泡脹液中，離心，上清即為鏈黴菌全蛋白樣品；其中，所述的泡脹液含有5-10M尿素，20-40g/L3-(3-膽胺丙基)二甲氨基-l-丙磺酸，10-50mM二硫蘇糖醇，10-20g/LpH3-10的兩性電解質；並且，所述的泡脹液中基本上不含有硫脲。8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，在步驟(4)中，離心的條件是15±2°C，40000士10000g離心60±15分鐘。9.一種蛋白酶抑制劑，其特徵在於，所述的蛋白酶抑制劑含有乙二胺四乙酸，苯甲基磺醯氟，抑氨肽酶B素和胃蛋白酶抑制劑。10.如權利要求9所述的蛋白酶抑制劑，其特徵在於，所述的蛋白酶抑制劑中各組分的摩爾比例是乙二胺四乙酸苯甲基磺醯氟抑氨肽酶B素胃蛋白酶抑制劑二(4±2):(6±2):(0.02±0.01):(0.03±0.01)。全文摘要本發明屬於生物
技術領域：
，公開了一種製備鏈黴菌全蛋白的方法。本發明的分離製備鏈黴菌全蛋白的方法簡單易行，利用所述的方法，鏈黴菌蛋白樣品分離效果良好，可儘可能完整地得到細胞所表達的全蛋白，在製備過程中不發生明顯的蛋白降解現象。利用本發明製備的鏈黴菌全蛋白，可獲得高質量且重複性好的雙向電泳圖譜，便於後續的生物質譜分析，具有極大的實際應用價值。文檔編號C07K14/195GK101157721SQ200710047439公開日2008年4月9日申請日期2007年10月26日優先權日2007年10月26日發明者炬儲,莊英萍,張嗣良,王永紅,鵬銀申請人:華東理工大學