包含免疫球蛋白－受體相互作用的抑制劑的藥物組合物的製作方法

2023-12-02 16:45:16 5

專利名稱：包含免疫球蛋白－受體相互作用的抑制劑的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物組合物，其含有能抑制免疫球蛋白與其受體之間相互作用的肽。
眾所周知，免疫球蛋白(Igs)與位於細胞表面的其相關受體的相互作用可誘導一系列不同的反應，其不同取決於受體所識別的Ig同種型。例如IgG結合在巨噬細胞表面相應的受體FcgR上，會引起胞吞作用，使抗原抗體複合物被溶酶體降解，並使細胞分泌有效的炎症介質，如前列腺素，白三烯，氧中間體和中性蛋白酶(Unkeless等，1981，實驗醫學雜誌，171期，597-611頁)。
同樣眾所周知的是，免疫球蛋白通過其穩定區(稱之為Fc)與其相關受體相互作用，而與抗原抗體特異性無關(Fridman等，1992，免疫學綜述，125期，49-76頁)。
目前尚不能得到可幹擾免疫球蛋白/受體相互作用的合成化合物。只有通過基因工程技術，作為重組產物得到的名為sFcR的可溶性天然受體能作為這種重要相互作用的抑制劑(Sautes等，1994，染色體雜誌，662期，197-207頁)。
因此，在必須控制Ig過量產生以及Ig/受體的識別對細胞周期具有負面影響的所有那些病例中，很顯然，對它們的重要治療方法之一是抑制免疫球蛋白與受體之間的相互作用。
如多發性骨髓瘤，因其對常規化療的耐受性而無法治療，但已有實驗數據顯示，基於施用Fc的可溶性受體進行的間接免疫治療可降低腫瘤細胞的生長和免疫球蛋白的分泌(Hoover等，臨床研究雜誌，95期，247-247頁)。
同樣，在愛滋病(AIDS)中，病人血清中存在抗體，其與相應細胞受體的相互作用可增加病毒的感染力(Homsy等，1989，科學，244期，1357-1360頁)，因此，基於施用能干擾與Ig相互作用之受體的分子的治療對於HIV病毒的感染性有顯著的治療意義。
某些炎症性疾病，如類風溼性關節炎，其病因就是免疫球蛋白與其相應細胞受體的相互作用(Fearon Wong，1983，免疫學年鑑，1期，243頁)。同前述病例一樣，基於施用能干擾Ig/受體識別之分子的治療具有明顯的治療效果。
甚至過敏反應也是由免疫球蛋白(此時是E族)與其相應細胞受體的相互作用引發的。
考慮到治療上的廣泛應用和病理學的嚴格性，迫切需要有能干擾免疫球蛋白與其相應受體間相互作用的合成化合物，這樣化合物中就不含任何生物來源的汙染，並且成本低。
現在業已發現式(I)的肽具有這些特點，(H2N-X1-Thr-X2-CO)n-R (I)其中互不相同的X1和X2是L或D型構象的酪氨酸和精氨酸殘基，其中蘇氨酸的羥基和精氨酸的胍基部分可以被肽化學中常規用於分別保護羥基和胍基部分的化合物所保護；n為2，3或4，以及R為能形成二聚體，三聚體和四聚體肽的基團。
這些化合物的製備已在本申請人1996年6月19日的歐洲專利申請號96201706.7中進行了描述。該申請目前尚未公開，其中描述了這些化合物作為免疫球蛋白配體的特性。
因此，本發明的第一個目的是提供一種藥物組合物，其中含有生物學有效量的式(I)肽(H2N-X1-Thr-X2-CO)n-R (I)其中互不相同的X1和X2是L或D型構象的酪氨酸和精氨酸殘基，其中蘇氨酸的羥基和精氨酸的胍基部分可以被肽化學中常規用於相應保護羥基和胍基部分的化合物所保護，n為2，3或4，R為能形成二聚體，三聚體和四聚體肽的基團，
並且其中還至少含有一種藥學可接受的惰性成分。
n較優選為4。
式(1)化合物中每個胺基酸均可為L或D型構象。
在本說明書及權利要求書中，術語「二聚體」、「三聚體」、和「四聚體」指分別含有2個，3個或4個H2N-X1-Thr-X2-CO-序列的肽，其中X1和X2具有上文所述含義。
適於形成二聚體(n＝2)的基團的典型實例為賴氨酸殘基。適於形成三聚體(n＝3)的基團的典型實例是化學式為Lys-Lys的賴氨酸-賴氨酸二肽。適於形成四聚體(n＝4)的基團的典型實例是化學式為Lys-Lys((Lys)的分支三肽和化學式為Gly-Lys-Lys((Lys)的分支四肽。
式(1)四聚體的一個典型實例具有下述化學式(H2N-X1-Thr-X2-CO)4-(Lys)2-Lys-Gly-OH(IA)其中X1和X2具有前述含義，且其中蘇氨酸和酪氨酸的羥基及精氨酸的胍基部分可以被肽化學中常規用於相應保護羥基和胍基部分的化合物所保護。
文獻報導過很多可用於保護羥基的基團(Grant G.A.《合成肽操作手冊》，Freeman，N.Y.，1992)。
所述保護基團的典型實例為叔丁基(tBu)(La Joie G.，Chvici A.，Adamson J.G.，合成，571-572頁(1990))和苯甲基(Yojima「四面體」，44卷，805-819頁，(1988))。
文獻中還報導了很多可用於保護精氨酸胍基部分的基團(GrantG.A.，「合成肽操作手冊」Freeman，N.Y.，1992)。
所述保護基團的典型實例是2，2，5，7，8-五甲基苯並二氫吡喃-6-磺醯基(Pmc)和4-甲氧基-2，3，6-三甲苯基(Mtr)(Ramage和Green《四面體通訊》28期，2287頁(1987)；Fujiino等，《化學製藥通告》29期，2825頁，1981)。
式(IA)化合物的特例為
(H2N-L-Arg(Pmc)-L-Thr(OtBu)-L-Tyr(OtBu)-CO)4-(Lys)2-Lys-Gly-OH(P-PAM)(H2N-L-Arg-L-Thr-L-Tyr-CO)4-(Lys)2-Lys-Gly-OH(L-PAM)(H2N-D-Arg-D-Thr-D-Tyr-CO)4-(Lys)2-Lys-Gly-OH(D-PAM)如下文所詳述，已分析了式(1)肽在抑制免疫球蛋白與受體的結合(Ig-FcR)方面及抑制由人IgG衍生的綿羊紅細胞(SRBC)與U937細胞間的花結形成方面的生物學活性，結果發現，式(I)化合物與Ig受體的相互作用類似於Ig，並且這種相互作用是劑量依賴性的。此外，還通過被動皮膚過敏試驗，在體內評估了式(I)化合物的生物學活性，這種實驗代表了研究抗過敏化合物的動物模型。
在小鼠急性毒性檢驗中，式(I)化合物無論經口服還是靜脈用藥均表現良好耐受性。
用本發明的藥物組合物治療能產生良好療效的典型病例是幹擾Ig與其受體間的相互作用是有用的或必須的那些病理狀態。這些病理狀況的典型實例是類風溼性關節炎及過敏反應。
較優選地，將本發明的藥物組合物製成合適的劑型，其中包含至少一種式(I)化合物的有效劑量和至少一種製藥可接受的惰性成分。
適當劑型的實例為片劑，膠囊，糖衣片劑，粒劑，口服溶液和糖漿，用於皮膚表面的油膏和藥貼；直腸栓劑和可用於注射的無菌溶液，氣霧膠及眼部用藥。
劑型中還可含有其他常規組分，如防腐劑、穩定劑、表面活性劑、緩衝液、調節滲透壓的鹽、乳化劑、增甜劑、著色劑、調味劑等等。
若有特殊治療要求，本發明的藥物組合物還可包含其他活性藥理成分，這種相伴使用有利於治療。
本發明的藥物組合物中式(I)肽的用量可以在一個較大範圍內變動，這取決於一些已知的因素，諸如待治療的疾病類型，病性嚴重程度，病人體重，劑型，所選用藥途徑，每日用藥次數及所選式(I)肽的效力。
通常，本發明藥物組合物中式(I)肽的含量應確保用藥水平為1-200mg/kg/天，優選2-50mg/kg/天。
本發明的藥物組合物劑型可按藥物化學家熟知的技術製備，這些技術包括混合、成粒、壓縮、溶解、滅菌等等。
就P-PAM，L-PAM和D-PAM肽而言，已對其抑制人IgG或IgA與相應受體Fcγ和Fcα間相互作用的能力進行了評估。
為此，已開發出了一種對人免疫球蛋白IgG和IgA與其位於U937人細胞系質膜上的受體間的結合進行抑制的試驗。
U937細胞系(Sundstrom，C.和Nilsson K.，國際癌症雜誌，17卷，565頁，1976)由ECACC(產品目錄號87010802)提供，它來自組織細胞淋巴組織瘤，是能表達組織細胞來源之細胞所示的很多單核細胞樣性質的少數幾種人細胞系之一。因此，它被廣泛用於研究Ig和Fc受體(FcR)間的相互作用(McCool D.等，免疫學雜誌，135期，1975-1980頁，1985；Raychaudhuri G.等，分子免疫學，22卷，1009-1019頁，1985；Burton D.R.等，分子免疫學，25卷，1175-1181頁，1988)。
這一細胞系組成型地表達IgG受體FcgRI和FcgRII(Looney R.等，免疫學雜誌，136卷，1641頁，1986)和IgA受體Fc((Monteiro R.C.等，實驗醫學雜誌，171卷，597-613頁，1990)。
進行試驗的第一步是製備U937細胞的質膜。該製備過程基本參照Hubbard A.L.等的程序(細胞生物學雜誌，96卷，217-229頁，1983)對受控細胞進行勻漿，不同的是此處勻漿所用為Dounce儀，且隨後純化質膜部分的過程在蔗糖密度梯度中完成。
按提供的條件培養細胞後，收穫細胞並離心(10分鐘，4℃，100×g)，用冷的D-PBS洗三次，再離心。所得細胞沉澱稱重(1.5g)並懸浮於4ml 0.25M的STM〔0.25M蔗糖於TM(5mM Tris-HCl pH8，0.5mM MgCl2)〕中。
懸浮液於4℃置10分鐘。
在Dounce儀中勻漿細胞〔用A勻漿棒(大號)勻漿40次，並用B勻漿棒(小號)勻40次〕，顯微鏡下檢查細胞是否破裂，並離心(4℃，10分鐘，280×g)去除完整細胞、核及細胞碎片。
回收上清，將沉澱重新懸浮於一半原始體積的STM中，用A勻漿棒在Dounce儀中勻10次。再次離心該懸浮液(4℃，10分鐘，280×g)。回收上清，與上一步所回收的上清液合併，再次離心(10分鐘，4℃，1500×g)。
將所得沉澱重新懸浮於0.25M STM中，並加入2M STM(TM中的2M蔗糖)，將溶液的密度調至1.18gr/cm3。使0.25M STM分層於所得溶液上層，再超速離心(1小時，4℃，78,000×g)。
從兩層蔗糖梯度相之間的界面回收細胞膜部分。
競爭試驗的第二步為人Ig的生物素化(IgG，Sigma目錄號I-4506，IgA，Sigma目錄號I-0663)。將150mM磷酸鈉緩衝液(PBS)中的2mg/ml免疫球蛋白溶液0.5ml與H2O/EtOH 1∶1中的6mg/ml生物素溶液(生物素醯氨己酸N-羥基琥珀醯亞胺酯，Sigma目錄號B-2663)0.5ml混合。將所得溶液在室溫攪拌15小時。然後經50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.5)透析去除過量的生物素。
通過生物素化的Ig與質膜製劑上的受體間的線性結合試驗確立了Ig/Fc結合抑制試驗的條件。
用於ELISA測定的微量板(Falcon目錄號3912)用得自U937細胞的細胞膜，按100μl/孔，以PBS中0.1-10μg/ml(指質膜製劑中總蛋白含量)的不同濃度進行處理，在4℃處理15小時。用PBS洗板5次，再每孔加180μl含3％牛血清白蛋白(BSA，Sigma目錄號A-9418的PBS溶液)以封閉非特異性位點。
室溫1小時30分鐘後，用PBS-T(含0.05％吐溫的PBS)洗板5次，每孔中加100μl於PBS-BSA 0.5％中含0.02-2μg/ml各種不同濃度的生物素化Ig的溶液。
37℃溫育1小時30分鐘後，將按1∶1000稀釋於PBS-BSA 0.5％中的過氧化物酶衍生的鏈黴抗生物素蛋白(Sigma，目錄號S-5512)溶液加入各孔，每孔加100μl。37℃溫育1小時後，用PBS-T洗板5次，每孔加入溶於磷酸鹽緩衝液pH5和0.012％過氧化氫中的2，2』-連氮基-雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)(Sigma，目錄號A-9941)100μl。
約30分鐘後，在平板讀數儀(Merck，Mod.Mios)上檢測每孔在405mm處的吸收值，結果如表1所示。
表1人生物素化IgG或IgA與得自U937細胞系的質膜(PM)製劑間的線性結合
表1的數據顯示IgG和IgA與質膜製劑中相應受體的結合均為劑量依賴型。
利用濃度為10μg/ml的U937質膜固定於平板上，以及濃度為0.4μg/ml的生物素化Ig，已進行了Ig/Fc結合抑制試驗。
將IgG與濃度為1-500μg/ml的本發明各種肽(L-PAM，D-PAM和P-PAM)及兩種對照物即L型構象(稱為CON-L)和D型構象(稱為CON-D)的肽Arg-Thr-Tyr一起溫育(表2)，而IgA的結合抑制試驗條件與此類似，用的是L-PAM，P-PAM和CON-L肽(表3)。
表2IgG-FcR結合抑制實驗
B/BO為抑制百分率，是用加了競爭物得到的O.D.值除以未加競爭物得到的O.D.值計算所得。
表3IgA-FcR結合抑制實驗
B/BO意義同上。
表2及表3中的數據顯示，L-PAM、D-PAM和P-PAM均以劑量依賴的方式產生與IgG同樣水平的相互作用。這種抑制作用是特異的，因為對照組(BSA)及兩肽鏈CON-L和CON-D均不能抑制這種相互作用。
同樣，L-PAM和P-PAM肽特異性地抑制IgA-FcR間的相互作用，而BSA及CON-L均未能達到這樣的效果。
此外，還評估了本發明化合物對用人IgG衍生的SRBC與U937細胞間花結形成的抑制作用類型。
該試驗用人IgG衍生的綿羊紅細胞(SRBC)與U937細胞(如上所述製備而成)間的花結形成抑制實驗，對L-PAM和D-PAM進行研究。
花結形成試驗按Lund J.等(FASEB J.，9期115-119頁，1995)的程序進行，並做如下改動。
按生產商提供的方案，利用鞣酸化SRBC(鞣酸預處理的SRBC，Sigma目錄號R-8128)和人IgG(Sigma目錄號I-4506)製備衍生的SRBC。衍生作用最後將IgG-SRBC重新懸浮於DPBS(Sigma目錄號D-5527)中含0.1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma目錄號A-9418)的溶液中。
從密度為7.5×105個細胞/ml的培養物中取2.5×105個U937細胞，於80×g離心5分鐘，沉澱再懸浮於50μl DPBS-BSA 0.1％中，與50μl含2.5×107個SRBC-IgG的DPBS-BSA 0.1％一起溫育，其中U937與SRBC-IgG的比率為1∶100。
25℃30分鐘後計數花結，特別要計數有4個或4個以上的SRBC細胞結合於表面的U937細胞。結果發現，在這些情況下，平均有45％的經處理U937細胞形成花結。
用L-PAM，D-PAM，CON-L和CON-D肽以上述相同條件進行花結形成抑制試驗。另用IgG作為抑制陽性對照，未衍生化的SRBC作為陰性對照，進行進一步的對照試驗。
試驗結果見表4，從中可看出，本發明的L-PAM和D-PAM肽可抑制IgG衍生的SRBC與U937膜上相關受體間形成玫瑰花結，如同IgG一樣。這種抑制作用是特異的，因為SRBC對照和CON-L、CON-D肽均不能抑制這種相互作用。
表4SRBC-IgG和U937 FcR間的花結形成抑制
>(*)指使SRBC-IgG與U937 FcR間的花結形成減少50％所需的抑制劑量。
式(I)肽與IgE之間的相互作用先通過製備親和層析柱，並評價其從生物液中純化IgE的能力而進行測試。為此，將5mg肽(I)溶於5ml 0.1M的碳酸氫鈉緩衝液pH9.0中，並加入1.2g已活化的CH-Sepharose樹脂(Pharmacia，Uppsala，瑞典目錄號17-0490-01)，即已預先活化以直接偶聯肽和蛋白質的親和層折支持物。將懸浮液混合24小時，在不同的時間點對反應混合物取樣，並經RP-HPLC分析，以監控偶聯效率。24小時後，約90％的起始肽共價結合於樹脂上。再用50ml 1M Tris pH9.0洗滌該衍生化樹脂，並裝入100×6.6mm內徑大小的玻璃柱中。為純化E族免疫球蛋白，用25mM BIS-TRIS緩衝液pH6.5，以1ml/min的流速平衡親和柱，在280nm監控洗脫液。
將1ml含抗卵白蛋白的IgE的腹水上樣於親和柱中，洗脫未結合物後，改用0.1M醋酸洗脫。收集解析物，並進行聚丙烯醯胺凝膠電泳分析。電泳結果清楚地顯示該層析柱可保留腹水中的免疫球蛋白級分，卻不保留白蛋白，後者在空柱體積中被洗脫。
由L或D型構象胺基酸製得的式(I)化合物的純化能力均與所用親和層析支持物的類型無關。事實上，用其他支持物，如Protein-Pak支持物(Waters，美國)，Eupergit C30N(Sigma，美國)和Affi-gel(Bio Rad，美國)也獲得了相似的結果。
式(I)肽結合E族免疫球蛋白的能力還通過ELISA測定進一步證實。為此，將式(I)肽固定於ELISA測定微量板(Falcon目錄號3912)上，進行式(I)肽-IgE特異性生物素化抗原線性結合實驗。與牛血清白蛋白(BSA，Sigma目錄號A-9418)偶聯後，將式(I)肽鋪板，濃度為於0.1MNaHCO3pH8.5中50μg/ml，100μl/孔，4℃放置15小時。用PBS洗板5次，向每孔加入含3％奶粉溶液180μl封閉非特異性位點。室溫1小時30分鐘後，用PBS-T(PBS-0.05％吐溫)洗板5次，再向每孔加100μl腹水溶液，內含於PBS-0.5％奶粉中濃度為10μg/ml的卵白蛋白抗原特異性IgE。37℃溫育1小時30分鐘後，向每孔加入100μl於PBS-0.5％奶粉中1-30μg/ml各種不同濃度的生物素化卵白蛋白溶液。
37℃溫育1小時30分鐘後，加入稀釋於PBS/0.5％奶粉中的過氧化物酶衍生的鏈黴抗生物素蛋白(Sigma目錄號S-5512)溶液(100μl/孔)。
37℃溫育1小時後，用PBS-T洗板5次，向每孔加100ml於檸檬酸鹽磷酸鹽緩衝液pH5和0.012％過氧化氫中的2，2』-連氮基-雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)溶液(Sigma目錄號A-9941)。
大約30分鐘後，用平板讀數儀(Merck Mod.Mios)測定每孔的吸收值，結果見表5。所得數據表明PAM肽以特異的和劑量依賴性的方式結合IgE。
表5
此外，還評估了本發明肽在體內的抗過敏活性。
將含有卵白蛋白抗原特異性IgE並且免疫球蛋白總含量為4mg/ml的大鼠腹水按比例稀釋於PBS中，對CD種雄性大鼠進行皮內注射。
皮內注射量為50μl，注射部位為動物的去毛背部。
這樣能使腹水中的IgE結合局部肥大細胞的FcεR，使它們致敏。
24小時後，靜脈注射於1ml PBS中的1mg卵白蛋白及2％Evan’sBlue染料。
15分鐘後，觀察到大鼠背部皮膚出現著色區，其範圍和顏色深淺與和腹水一起注射的抗原特異性IgE量成正比。
藍染區是由於在皮內注射部位注射的抗原與IgE結合而產生的，導致脫顆粒並釋放介質，從而使局部血管通透性增加，染料從血管中漏出所致。
陰性對照是皮內注射50μl不含腹水的PBS，未出現藍染區。
抑制試驗中，將含IgE並適當稀釋後的腹水與L-PAM和D-PAM肽以總免疫球蛋白-肽摩爾比為1∶2，1∶20，1∶200，1∶2000，1∶20,000和1∶200,000(對應於26ng，260ng，2.6μg，26μg，260μg，2600μg的L-PAM和D-PAM肽)的比例一起溫育。
分別對兩種肽進行試驗。
在CD1大鼠中，皮內注射各種濃度的腹水-肽混合物50μl。
陽性對照是注射不含肽的腹水50μl。
24小時後，如上述注射抗原及Evan’s Blue染料。
15分鐘後可見大鼠背部藍染區的顏色深汪和面積大小與注射的肽量成比例，當肽濃度達到最高值時，完全沒有藍染區出現。
用L-PAM和D-PAM肽得到的結果如表II所示。這些結果說明兩種肽均能以劑量依賴的形式抑制IgE-受體間的相互作用，直至炎症反應完全消失。
表權利要求
1.一種藥物組合物，其中含有生物學有效量的式(I)肽(H2N-X1-Thr-X2-CO)n-R (I)其中互不相同的X1和X2是L或D型構象的酪氨酸和精氨酸殘基，其中蘇氨酸的羥基和精氨酸的胍基部分可以被肽化學中常規用於分別保護羥基和胍基部分的化合物所保護，n為2，3或4R為相應能形成二聚體，三聚體和四聚體肽的基團，並且其中至少含一種製藥可接受的惰性成分。
2.權利要求1的藥物組合物，其中R為4。
3.權利要求1或2的藥物組合物，其中式(I)化合物中的每個胺基酸可以是L或D型構象。
4.權利要求2或3的藥物組合物，其中R為具有式(Lys)2-Lys-Gly-OH的四肽。
5.權利要求1至4中任何一項的藥物組合物，其中X1為精氨酸。
6.權利要求1至5中任何一項的藥物組合物，其中X2為酪氨酸。
7.權利要求1至4以及6中任何一項的藥物組合物，其中X1為Arg(Pmc)。
8.權利要求1至5以及7中任何一項的藥物組合物，其中X2為Tyr(OtBu)。
9.權利要求1至8中任何一項的藥物組合物，其中式(I)化合物中的蘇氨酸羥基由叔丁基保護。
全文摘要
一種藥劑組合物,其中含有生物學有效量的式(Ⅰ)肽:(H
文檔編號A61P35/00GK1240357SQ97180694
公開日2000年1月5日 申請日期1997年12月11日 優先權日1996年12月16日
發明者G·法西納, S·迪法爾科 申請人:泰克諾根公司