豬環狀病毒重組痘病毒疫苗的製作方法

2023-11-11 05:14:37 4

專利名稱：豬環狀病毒重組痘病毒疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及載體(例如重組載體，如重組病毒；例如痘病毒，如修飾的痘病毒)和製備及使用該載體的方法。在一些實施方案中，本發明涉及重組禽痘病毒例如金絲雀痘病毒，如ALVAC。此外本發明涉及一種載體，如表達豬環狀病毒(circovirus)2(PCV2)的基因產物如抗原、ORF、和/或其目的表位的痘病毒；並涉及免疫組合物或疫苗。此外本發明還涉及這種載體，如誘導針對PCV2基因產物和/或PCV2的免疫應答的痘病毒；並涉及有利的組合物，它們是免疫的、免疫原性和/或賦予抵抗PCV2感染的保護性免疫的組合物或疫苗組合物。此外本發明還涉及這類載體和組合物的應用與製備和使用它們的方法，以及它們的中間體和所述中間體。並且，本發明涉及它們的產物，例如來自涉及本發明重組體或痘病毒的應用和方法的產物，如表達的抗體。
背景技術：
斷奶後多系統萎縮症候群(PMWS)是近來在仔豬中發現的一種疾病。PMWS的臨床症狀為體重逐漸降低和其它症狀如呼吸急促、呼吸困難和黃疸。病理上可觀察到淋巴細胞和肉芽腫性浸潤液、淋巴結病，和更罕見的淋巴細胞和肉芽腫性肝炎及腎炎(Clark，1997；Harding，1997)。
在不同歐洲國家以及北美都描述了該疾病。目前該疾病還不能得到預防和治療。
有幾條證據指出豬環狀病毒是PMWS的病原體(Ellis等，1998)。已從患有PMWS的豬身上獲得了環狀病毒，而且已經證明患有該疾病的豬有豬環狀病毒的抗體。
環狀病毒是在某些動物和植物種屬中發現的單鏈環狀DNA病毒。豬環狀病毒最初作為汙染因子從豬腎傳代細胞系分離。該細胞培養分離株曾被命名為PK-15(Meehan等，1997)。最近，比較了獲自患有PMSW的豬的豬環狀病毒與PK-15。這類病毒與PK-15在核苷酸和蛋白序列水平上有實質性不同，曾被命名為PCV2(Meehan等，1998；Hamel等，1998)。
在PCV2基因組中鑑定了多達13個開放讀碼框(ORF)(法國專利申請9803707中的COL1-COL13)。這些ORF中的四個與PK-15基因組的類似ORF基本同源。含有nt 398-1342(GenBank登錄號AF055392)的ORF1(Meehan等，1998；相應於法國專利申請98 03707中的COL4)，可能編碼預期分子量為37.7kD的蛋白。含有nt 1381-1768且與1-314連接(GenBank登錄號AF055392)的ORF2(Meehan等，1998；相應於法國專利申請98 03707中的COL13)，可能編碼預期分子量為27.8kD的蛋白。含有nt 1018-704(GenBank登錄號AF055392)的ORF3(Meehan等，1998；相應於法國專利申請98 03707中的COL7)，可能編碼預期分子量為11.9kD的蛋白。含有nt 912-733(GenBank登錄號AF055392)的ORF4(Meehan等，1998；相應於法國專利申請98 03707中的COL10)可能編碼預期分子量為6.5kD的蛋白。
PCV2的ORF1與PK-15分離株的ORF1(Meehan等，1998)高度同源(86％的一致性)。已部分表徵了PK-15的ORF1蛋白((Meehan等，1997；Mankertz等，1998a)。已知它是病毒複製所必需的，並且可能參與病毒DNA的複製。
各個ORF2的蛋白序列一致性比ORF1要低，但，每個ORF2共有一個高度保守的鹼性N末端區，與禽環狀病毒雞白血病病毒(CAV)(Meehan等，1998)的主要結構蛋白的N末端區相似。近來，Mankertz等(1998b)提出PK-15分離株的ORF2(在Mankertz等，1998b中命名為ORF1)編碼衣殼蛋白。
在PK-15分離株和PCV2各自的ORF3和ORF4中觀察到了更大差別。在每種情況下，與PK-15分離株基因組中存在的相應ORF相比，PCV2ORF4和ORF3的C末端區有缺失。在ORF3和ORF4的N末端區都觀察到了最高的蛋白序列一致性(Meehan等，1998)。
還沒有發表對PCV2基因組的轉錄分析。從PK-15分離株獲得的近期數據表明ORF2轉錄物被剪接(在Mankertz等，1998b)。
痘苗病毒已成功用於免疫預防天花，在1980年的世界根除天花運動中達到極點。隨著天花的根除，痘病毒用於表達外源基因(Panicali和Paoletti，1982；Paoletti等，1984)的基因修飾載體的的新作用變得很重要。編碼異源性抗原的基因已在痘苗中表達，常常導致抵抗相應病原體攻擊的保護性免疫(綜述Tartaglia等，1990)。命名為MVA的高度減毒疫苗株也已被作為基於痘病毒的疫苗載體。美國專利號5185146中描述了MVA的應用。
另外兩個疫苗載體系統涉及天然宿主限制的痘病毒禽痘病毒的應用。家禽痘病毒(FPV；Taylor等，1998a，b)和金絲雀痘病毒(CPV；Taylor等，1991 1992)都已被改造用來表達外源基因產物。家禽痘病毒(FPV)是痘病毒家族禽痘病毒屬的原型病毒。該病毒引發經濟上重要的家禽患疾病，該疾病自從1920年以來通過減毒活疫苗的使用得到了很好控制。禽痘病毒的複製僅限於禽類(Matthews，1982)，文獻中沒有關於禽痘病毒在任何非禽類(包括人類)中引起繁殖性感染的報導。這種宿主局限性提供了一道固有的安全屏障，防止該病毒傳播到其它物種，並使得在脊椎動物和人類應用中使用基於禽痘病毒的疫苗的建議很吸引人。
已利用FPV作為載體表達來自禽病原體的抗原。在FPV重組體中表達了強致病性禽流感病毒的血凝素蛋白(Taylor等，1988c)。重組體接種小雞和火雞後，誘導了抵抗同源或異源的強致病性流感病毒攻擊的保護性免疫應答(Taylor等，1988c)。也已建立了表達新城疫病毒表面糖蛋白的FPV重組體(Taylor等，1990；等，1990)。
通過基因修飾野生型病毒株製備了其它減毒的痘病毒載體。已經證明，通過缺失痘苗病毒哥本哈根株(Tartaglia等，1992)的特異性毒力基因和宿主範圍基因而衍生的NYVAC載體可作為重組載體，引發針對所表達外源抗原的保護性免疫應答。
另一個改造的痘病毒載體為ALVAC，來自金絲雀痘病毒。ALVAC在非禽類宿主中沒有繁殖性複製，據信該特徵改進了其安全譜(Taylor等，1991 1992)。ALVAC和NYVAC都是BSL-1載體。
發展亞單位PCV2疫苗的一種方法是使用活病毒載體來表達相關的PCV2 ORF。可用本領域熟知的兩個步驟和美國專利號4769330、4722848、46003112、5110587、5174993、5494807和5505941(這些專利的公開併入本文作為參考)所描述的產生痘病毒(如痘苗病毒和禽痘病毒)的合成重組體的類似方法構建重組痘病毒。因此提供PCV2重組痘病毒及其組合物和產物，特別是基於ALVAC的PCV2重組體及其組合物和產物，尤其是含有PCV2的ORF1和/或2的重組體及其組合物和產物，將是本領域技術現狀期望的進展。
發明目的和概述因此本發明一個目的是提供治療和預防PCV2感染的組合物和方法。另一個目的是提供治療和預防PMWS的工具。
本發明一方面涉及用於在接種了該組合物的宿主動物中誘導抗原性、免疫原性或免疫應答的抗原性、免疫性、免疫原性組合物或疫苗組合物或治療性組合物。該組合物有利地包括載體或稀釋物和重組病毒(如重組痘病毒)。重組病毒或痘病毒含有並表達外源核酸分子，其編碼ORF、抗原、免疫原或來自PCV2的目的表位、或引發針對PCV2或PCV2引起的疾病(如PMWS)的免疫應答的蛋白。例如，重組病毒可為修飾的重組病毒或痘病毒；例如具有滅活的病毒編碼遺傳功能(如非必需的病毒編碼遺傳功能)的病毒或痘病毒，所以重組病毒毒性降低而安全性提高。此外，本發明提供了在組合物中使用的病毒及製備和使用組合物和病毒的方法。
在根據本發明的組合物中使用的病毒有利地為痘病毒、特別是痘苗病毒或禽痘病毒(如家禽痘病毒和金絲雀痘病毒)，更有利地為ALVAC。修飾的重組病毒可包括例如在病毒基因組的非必需區編碼抗原性蛋白(如來自PCV2的ORF如PCV2 ORF1和/或2)的異源DNA序列。
另一方面，本發明涉及免疫原性組合物，其含有的修飾重組病毒具有滅活的非必需的病毒編碼的遺傳功能，所以重組病毒毒性降低而安全性提高。修飾的重組病毒包括例如在病毒基因組非必需區內編碼抗原性蛋白(如來自PCV2的ORF尤其是ORF1和/或2)的異源DNA序列，其中該組合物給予宿主後能夠誘導抗原特異的免疫應答。
再一方面，本發明涉及修飾的重組病毒，該病毒具有滅活的非必需的病毒編碼的遺傳功能，所以該病毒的毒性降低，並且其中修飾的重組病毒還在如該病毒基因組非必需區內含有異源DNA。該DNA可編碼PCV2基因如任一個或所有的PCV2 ORF1、ORF2、ORF3或ORF4(Meehan等，1998)、或其目的表位。通過缺失編碼毒力因子的開放讀碼框或通過利用天然宿主限制性病毒可滅活遺傳功能。根據本發明使用的病毒有利地為痘病毒(如痘苗病毒)或禽痘病毒(如家禽痘病毒或金絲雀痘病毒)。
有利地，從痘病毒或病毒基因組缺失的開放讀碼框選自J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、C7L-K1L和14L(Goebel等報導的術語學，1990)及其組合。在這一方面，該開放讀碼框含有一個胸腺嘧啶激酶基因、一個出血性區域、一個A型包涵體區、一個血凝素基因、一個宿主範圍基因區或一個大的亞單位、核糖核苷酸還原酶；或它們的組合。
一個適當修飾的痘苗病毒哥本哈根株被鑑定為NYVAC(Tartaglia等，1992)，或一種痘苗病毒，其中缺失了J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、C7L-K1L和14L或一個胸腺嘧啶激酶基因、一個出血性區域、一個A型包涵體區、一個血凝素基因、一個宿主範圍基因區和一個大的亞單位、核糖核苷酸還原酶(關於NYVAC和來自NYVAC的在實施本發明時也有用的具有額外缺失或滅活的載體，也見美國專利號5364773、5494807和5762938)。
優選地，痘病毒載體為ALVAC或金絲雀痘病毒，金絲雀痘病毒為減毒的，例如通過在雞胚成纖維細胞(Rentschler疫苗株)上連續傳200代以上，它們的主種子經過瓊脂糖連續四次噬斑純化，其中一個克隆通過5次額外傳代來擴增。(關於ALVAC和TROVAC(在實施本發明時有用的減毒家禽痘病毒)見美國專利號5756103和5766599；關於在實施本發明時也有用的載體，例如表達提高了的載體、其功能缺失的載體和對於豬宿主有用的載體(例如，對豬宿主有用的載體可包括痘病毒，包括痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒和豬痘病毒)，和關於本文使用的術語和教導如「免疫原性組合物」、「免疫組合物」、「疫苗」和「目的表位」，以及劑量、給藥途徑、程序、佐劑和對重組病毒的使用及其表達產物，見美國專利號6004777、599091、5770212、6033904、5869312、5382425和WO95/30018。
本發明再一方面還涉及發明的重組痘病毒的表達產物及其用途，例如形成用於治療、預防、診斷或測試的抗原性、免疫的或疫苗的組合物；和來自重組痘病毒，在構建DNA探針和PCR引物時有用的DNA。
這些和其它實施方案由下面的詳細描述公開或變得顯而易見並包含於其中。
附圖簡述通過查閱所附圖表將更好地理解本發明，在此併入本文作為參考，其中
●


圖1(SEQ ID NO1)顯示了ALVAC DNA含有C6開放讀碼框的3.7千鹼基對片段的核苷酸序列。
●圖2顯示了pJP102供體質粒圖。
●圖3(SEQ ID NO8)顯示了pJP102供體質粒從KpnI(653位)到SacI(3166位)限制酶位點的2.5千鹼基對片段的核苷酸序列。
●圖4顯示了pJP105供體質粒圖。
●圖5顯示了pJP107供體質粒圖。
●圖6(SEQ ID NO11)顯示了pJP107供體質粒從KpnI(653位)到SacI(4255位)限制酶位點的3.6千鹼基對片段的核苷酸序列。
發明詳述一方面，本發明涉及重組病毒，例如重組痘病毒，其中含有來自PCV2的一段DNA序列，例如在痘病毒基因組的非必需區。痘病毒有利地為禽痘病毒，例如家禽痘病毒，尤其是減毒家禽痘病毒，或金絲雀痘病毒，尤其是減毒金絲雀痘病毒如ALVAC。
根據本發明，重組痘病毒表達外源PCV2基因的基因產物。PCV2的特定ORF插入到痘病毒載體，產生的重組痘病毒用來感染動物。在動物中PCV2基因產物的表達導致動物對PCV2的免疫應答。因此，本發明的重組痘病毒可能用於免疫組合物或疫苗，來提供誘導可能(但不需要)是保護性免疫應答的方法。
重組痘病毒PCV2或其表達產物即本發明的組合物如免疫的、抗原性組合物或疫苗組合物或治療性組合物的給藥方式可以是經腸胃外的途徑(皮內、肌肉或皮下)。這種免疫方式可引起系統性免疫應答、或體液或細胞介導的應答。
更通常地，本發明的痘病毒PCV重組體、抗原性、免疫組合物或疫苗痘病毒組合物或治療性組合物，可按照藥學或獸醫領域的技術人員所熟知的標準技術來製備。這些組合物可由醫學或獸醫領域的技術人員在考慮了如年齡、性別、體重、種族和特定患者的情況以及給藥途徑這些因素之後，按其熟知的劑量和技術給藥。這些組合物可單獨給藥，或可以與組合物，例如「與」其它免疫的、抗原性或疫苗或治療性組合物共同施用或順序施用，由此提供本發明的多價或「雞尾酒」或聯合組合物和使用它們的方法。同樣，可在考慮了如年齡、性別、體重、種族和特定患者的情況以及給藥途徑這些因素之後來確定給藥的成分、方式和劑量。在這一方面，請參考併入本文作為參考的關於狂犬病毒組合物和聯合組合物及其使用的美國專利號5843456。
本發明組合物的實施例包括用於各入口的液體製品，如口的、鼻的、肛門的、陰道的、經口的、胃內的等，給藥方式如懸液、糖漿或酏劑；和用於腸胃外的、皮下、皮內、肌內或血管內(如可注射的給藥)的製品如無菌懸液或乳劑。在這些組合物中，重組痘病毒或抗原可能與合適的載體、稀釋物或賦形劑如無菌水、生理鹽水、葡萄糖等形成混合物。這些組合物也可被凍幹。這些組合物根據給藥途徑和預期的製品可含有輔助物質如保溼劑或乳化劑、pH緩衝劑、佐劑、膠凝劑或粘性促進添加劑、防腐劑、香精、色素等。可參考標準原文如「REMINGTON』SPHARMACEUTICAL SCICNCE」第17版，1985(在此併入本文作為參考)，來製備適當的製品，以避免不適當的實驗。合適的劑量也可根據下面的實施例。
這些組合物可含有選自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合體和順丁烯二酸酐與鏈烯衍生物的共聚體的至少一種佐劑化合物。
優選的佐劑化合物為交聯的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合體，尤其與糖或多元醇的多聚鏈烯基醚交聯。這些化合物稱為術語carbomer(Phameuropa第8卷第二期，1996年6月)。本領域技術人員也可參考美國專利號2909462(在此併入本文作為參考)，該專利描述了與多羥基化合物交聯的這類丙烯酸聚合體，該多羥基化合物含有至少3個羥基優選不超過8個羥基、其中至少3個羥基的氫原子被具有至少2個碳原子的非飽和脂肪酸基團所取代。優選基團是那些含有2-4個碳原子的，如乙烯基、丙烯基和其它乙烯基非飽和基團。這些非飽和基團可含有其它取代基，如甲基。以名稱Carbopol(BF Goodrich，俄亥俄州，美國)出售的產品特別好。它們與烯丙基蔗糖或烯丙基戊赤蘚糖醇交聯。其中可能提及Carbopol974P、934P和971P。
在順丁烯二酸酐和鏈烯衍生物的共聚體中，優選順丁烯二酸酐和乙烯線性或交聯的共聚體EMA(Monsanto)，例如與二乙烯醚交聯的共聚體。可參考併入本文的文獻J.Fields等，自然(Nature)，186778-780，1960.6.4。
從其結構來看，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合體和共聚體EMA優選由下面公式中的基本單位形成 其中- R1和R2相同或不同，代表H或CH3- x＝0或1，優選x＝1- y＝1或2，且x+y＝2對於共聚體EMA，x＝0，y＝2。對於carbomer，x＝y＝1。
這些聚合體溶解於水產生酸性溶液，其將被中和，優選中和至生理pH，以便製備將要摻入疫苗的佐劑溶液。聚合體的羧基部分為COO-形式。
優選地，根據本發明的佐劑溶液，尤其是carbomer溶液，用蒸餾水製備，優選有NaCl的蒸餾水時製備，獲得的溶液為酸性pH。該儲備液加入到預定量(用來獲得預定終濃度)或其實際比例的含有NaCl的水中、優選生理鹽水(NaCl 9g/l)來稀釋，幾步中都立刻同時或隨後中和(pH7.3-7.4)，優選用NaOH中和。將生理pH的該溶液與疫苗混合，特別可以凍幹、液體或冰凍的形式貯藏。
在最後的疫苗組合物中聚合體濃度為0.01％-2％w/v，更特別為0.06-1％w/v，優選0.1-0.6％w/v。根據本發明的免疫組合物可與至少一種減毒活疫苗、滅活疫苗、或亞單位疫苗、或表達至少一種其它豬病原體免疫原的重組疫苗(如痘病毒作為載體或DNA質粒)關聯。
本發明包括編碼並表達等同核苷酸序列的載體，也就是說，該序列在所考慮的基因或該基因編碼多肽的功能和菌株特異性(指1型和2型菌株)上都沒有改變。當然包括密碼子簡併性不同的序列。
實施例中使用的PCV-2序列來自Meehan等(毒株Imp 1010；ORF1核苷酸398-1342；ORF2核苷酸1381-314；以及分別相應於1998年9月25日的美國申請系列號09/161092和WO-A-9918214的COL4和COL13的序列)。其它PCV-2毒株及其序列已發表於WO-A-9918214，被稱為Imp999、Imp1011-48285和Imp1011-48121，和發表於A.L.Hamel等，J.Virol.1998年6月，第72卷，65262-5267(GenBank AF027217)和I.Morozov等J.Clinical Microb.1998年9月，第36卷，92535-2541，和GenBank AF086834、AF086835、AF086836，並可獲得等同ORF序列。這些序列或其ORF，或其編碼抗原或目的表位的區域也可用於實施本發明。
本發明也包括那些本文使用的和本文引用文獻使用的序列的等同序列；例如，能夠在高嚴格條件下與該核苷酸序列雜交的序列(見，如，Sambrook等，1989)。在這些等同序列中，也可提及保留了完整序列免疫原性的基因片段，如目的表位。
PCV 1型和2型的全基因組之間同源性大約為75％。對於ORF1，同源性大約為86％，對於ORF2，大約為66％。相反，2型內的基因組和ORF同源性通常高於95％。
同樣，在實施本發明時有用的等同序列，對於ORF1，是那些與Imp1010毒株ORF1的同源性等於或大於88％，有利地為90％或更高，優選92％或95％或更高的序列，對於ORF2，是那些與Imp1010毒株ORF2的同源性等於或大於80％，有利地為85％或更高，優選90％或95％或更高的序列。
根據Meehan 1998，ORF1和ORF2可能編碼預期分子量分別為37.7kD和27.8kD的蛋白質。ORF3和ORF4(根據Meehan等，1998，分別相應於WO-A9918214的ORF7和ORF10)可能編碼預期分子量分別為11.9kD和6.5kD的蛋白質。GenBank AF 055392中也有這些ORF的序列。也可將它們引入質粒並根據本發明單獨使用或聯合使用，如ORF1和/或ORF2。
在1998年9月25日的美國專利申請系列號09/161、092中發表的其它ORF1-3、5、6、8-9、11-12(WO-A-99182 14中的COL1-3和5、6、8-9、11-12)，或其編碼抗原或目的表位的區域，可用於本發明的實施，如單獨使用或互相聯合或與它們編碼的抗原或表位聯合使用。
本發明也包括等同序列的使用；例如，來自本文引用的各種毒株的ORF的序列。對於同源性，可測定那些來自含有ORF2和/或ORF1的PCV毒株的等同序列，其讀碼框與1010毒株的相應ORF具有上面限定的同源性。
根據Meehan，對於ORF3，等同序列與Imp1010毒株ORF3的同源性有利地為例如等於或大於80％，如85％或更高，優選90％或95％或更高。根據Meehan(1998)，對於ORF4，有利地是等同序列與Imp1010毒株ORF4的同源性等於或高於86％，有利地為90％或更高，優選95％或更高。
使用標準軟體如MacVector，從基因組核苷酸序列例如在WO-A-9918214中發表的那些序列來測定ORF是常規技術。同樣，與1010毒株進行的基因組比對和與1010毒株ORF進行的比較，可使本領域技術人員很容易測定另一種毒株基因組的ORF(如在WO-A-9918214或本文引用的其它文獻中公開的其它毒株)。
使用軟體或進行序列比對不需要過度的實驗，提供了發現等同ORF或核酸分子的捷徑。
核苷酸序列同源性可利用Myers和Miller(「線性空間的最佳比對」，CABIO 4，11-17，1988，併入本文作為參考)和NCBI提供的「比對」程序來測定。或者，術語「同源性」或「一致性」例如關於核苷酸序列或胺基酸序列，可指兩個序列間同源性的量的測量。序列同源百分率可用(Nref-Ndif)*100/Nref來計算，其中Ndif是比對的兩序列中非相同序列的總數，其中Nref是其中一個序列的殘基數。因此，DNA序列AGTCAGTC與序列AATCAATC的序列相似性為75％(Nref＝8；Ndif＝2)。
或者，關於序列的「同源性」或「一致性」可指相同核苷酸或胺基酸位數除以兩序列中較短序列的核苷酸或胺基酸數，其中兩序列的比對可按照Wilbur和Lipman的算法(Vilbur和Lipman，1983 PNAS美國80726，併入本文作為參考)來確定，例如，使用20個核苷酸的窗口大小、4個核苷酸的字長、缺口罰分為4，並且計算機輔助分析及包括比對的序列數據的解釋，可以使用商業化程序方便地進行(如IntelligeneticsTMSuite，Intelligenetics Inc.加拿大)。當假定RNA序列與DNA序列相似、或有一定程度的序列一致性或同源性時，那麼認為DNA序列中的胸腺嘧啶(T)等於RNA序列中的尿嘧啶(U)。
本發明範圍內的RNA序列可由DNA序列衍生而來，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)等於RNA序列中的尿嘧啶(U)。此外，胺基酸序列相似性或一致性或同源性可使用BlastP程序(併入本文作為參考的Altschul等，Nucl.Acids Res.25，3389-3402)和NCBI提供的程序來測定。後面的參考文獻(每篇都併入本文作為參考)提供了兩個蛋白胺基酸的相對一致性或同源性，此外關於前述問題，這些文獻中的指導可用來測定同源性或一致性的百分率Needleman SB和Wunsch CD「適用於檢查兩個蛋白胺基酸相似性的普通方法」J.Mol.Biol.48444-453(1970)；Smith TF和WatermanMS，「生物序列比較，」應用數學進展(Advances in Applied Mathematics)2482-489(1981)；Smith TF，Waterman MS和Sadler JR，「核酸序列功能域的統計學特徵，」Nucleic Acids Res.，112205-2220(1983)；Feng DF和Dolittle RF，「作為修正進化系統樹前提條件的漸進的序列比對，」J.ofMolec.Evol.，25251-360(1987；)Higgins DG和Sharp PM，「在微型電子計上快速靈敏的多重序列比對，」CABIOS，5151-153(1989)；TompsonJD，Higgins DG和Gibson TJ，「Cluster W通過序列weighing、位置特異性gap penalties和weight matrix選擇提高進化多重序列比對的靈敏度，Nucleic Acids Res.，224673-480(1994)；和Devereux J、Haeberlie P和Smithies O，「用於VAX的一套理解性序列分析程序，」Nucleic AcidsRes.，12387-395(1984)。
本發明不僅可對成年豬給藥，也可對仔豬或懷孕的母豬給藥；在後一種情況下，可以對新生豬特別提供被動免疫(母體抗體)。優選地，在母豬繁殖前；和/或在交配前，和/或在懷孕期間接種。有利地是，至少在交配前接種一針，並且優選在懷孕期間接種一針，例如，大約在懷孕中期(大約懷孕6-8周)和/或懷孕末期(大約懷孕11-13周)。因此，有利的方案為在交配和/或配種前接種一針，並在懷孕期間加強一針。其後，可在每次交配前和/或懷孕中期和/或懷孕末期再次接種。優選在懷孕期間再次接種。公豬也可接種，例如在交配前。
小豬，例如接種母豬的小豬(如此處討論的那樣接種)，在出生後第一周接種，例如在出生後第一、和/或第二、和/或第三、和/或第四、和/或第五周接種。優選地，小豬在出生後第一周或第三周接種(如在餵奶期)。然後這些小豬在2-4周後加強是有利的。
此外本發明通過下面說明性而非限制性的實施例來描述。
實施例在優選實施方案中本發明涉及在痘病毒基因組的非必需區含有來自PCV2的DNA序列的重組痘病毒。重組痘病毒表達外源PCV2基因的基因產物。特別分離並表徵了編碼PCV2蛋白的ORF1和ORF2基因，並將其插入ALVAC重組體(金絲雀痘病毒載體)。使用的分子生物學技術是Sambrook等所描述的那些(1989)。
細胞系和病毒株。命名為Imp.1010-Stoon的PCV2毒株先前已有描述(Meehan等，1998)。它從來自加拿大的一頭病豬的腸繫膜淋巴結組織中分離。Meehan等(1998)描述了PCV2基因組的克隆。質粒pGem 7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI No.14含有作為EcoRI片段插入質粒pGem-7Z(Promega，Madison，WI)EcoRI位點的PCV2基因組。Imp.1010-StoonPCV2毒株的全核苷酸序列已由Meehan等(1998)測定，並可由GenBank登錄號AF055392獲得。
親本金絲雀痘病毒(Rentschler毒株)是用於金絲雀的疫苗株。疫苗株獲自野生分離株，並通過在雞胚成纖維細胞上連續傳200代以上而減毒。主毒種用瓊脂經連續四次噬斑純化，並且其中一個克隆再通過五次傳代，然後用該病毒庫作為體外重組試驗的親本病毒。噬斑純化的金絲雀痘病毒分離株被命名為ALVAC。ALVAC於1996年12月14日按照布達佩斯條約保藏在美國典型培養物保藏中心，ATCC登錄號為VR-2547。
重組痘病毒的產生包括幾步(1)構建一個插入質粒，含有痘病毒基因組中插入位點兩側的序列(「臂」)，和位於兩側臂之間的多克隆位點(MCS)(例如見實施例1)；(2)構建供體質粒，該質粒由已將外源基因表達盒插入其MCS的插入質粒組成(例如見實施例2-5)；(3)供體質粒的兩臂和親本痘病毒在細胞培養物中的體外重組，使外源基因表達盒插入痘病毒基因組的合適位點，和噬斑純化重組病毒(例如見實施例6)。
PCV2重組免疫原可能與PCV1免疫原聯合使用，用於免疫動物預防PMWS。在最末優選的方法中，可能單獨使用PCV1免疫原，而不與PCV2免疫原一起使用。實施例1-在C6位點構建金絲雀痘病毒插入質粒
圖1(SEQ ID NO1)為金絲雀痘病毒DNA的3.7kb片段的序列。序列分析表明存在一個從377位起始並在2254位終止的命名為C6L的ORF。下面描述了C6插入質粒的構建，通過缺失C6 ORF並用兩側為轉錄和翻譯終止信號的多克隆位點(MCS)取代。使用寡核苷酸引物C6A1(SEQ ID NO2)和C6B1(SEQ ID NO3)從金絲雀痘病毒基因組DNA擴增了380bp的PCR片段。使用寡核苷酸引物C6C1(SEQ ID NO4)和C6D1(SEQ ID NO5)從金絲雀痘病毒基因組DNA擴增了1155bp的PCR片段。將380bp和1155bp的片段融合在一起，融合方法為將二者一起加入作為模板，使用寡核苷酸引物C6A1(SEQ ID NO2)和C6D1(SEQ IDNO5)擴增了1613bp的PCR片段。該片段用SacI和KpnI消化，並連接到用SacI/KpnI消化的pBluescript SK+(Stratagen，La，Jolla，CA，美國)中。產生的質粒pC6L通過DNA序列分析證實。它由C6上遊370bp的金絲雀痘病毒DNA(「C6左臂」)、痘苗病毒早期終止信號、6個讀碼框中的翻譯終止子、含有SmaI、PstI、XhoI和EcoRI位點的MCS、痘苗病毒早期終止信號、6個讀碼框中的翻譯終止子和1155bp的下遊金絲雀痘病毒序列(「C6右臂」)組成。
質粒pJP099由pC6L衍生而來，將含有連接了外源基因的痘苗病毒H6啟動子(在Taylor等(1988c)、Guo等(1989)和Perkus等(1989)有描述)連接到pC6L的SmaI/EcoRI位點。質粒pJP099在H6啟動子3′端含有一個獨特的EcoRV位點和一個獨特的NruI位點，在外源基因的終止密碼和C6左臂之間有一個獨特的SalI位點。因此來自pJP099的～4.5kbEcoRV/SalI或NruI/SalI片段含有質粒序列、兩個C6臂和H6啟動子5′端到EcoRV和NruI位點的序列。引物序列引物 C6A1(SEQ ID NO2)ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT引物 C6B1(SEQ ID NO3)GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA引物 C6C1(SEQ ID NO4)CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCAAATGAGTATATATAATTGAAAAAGTAA引物 C6D1(SEQ ID NO5)GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG實施例2-構建PCV2 ORF2的ALVAC供體質粒用EcoRI消化質粒pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI No.14(含有在質粒pGem7Z中作為EcoRI片段的PCV2基因組)，分離1768bp的片段並連接。
為了將PCV2 ORF2插入合適的ALVAC插入載體使用引物JP760(SEQ ID NO6)和JP773(SEQ ID NO7)從1768bp連接的EcoRI片段(見上文)擴增PCV2 ORF2，產生PCRJ1304。引物JP760(SEQ IDNO6)含有從EcoRV開始的H6啟動子3′端和PCV2 ORF2的5′端。引物JP773(SEQ ID NO7)含有PCV2 ORF2的3′端，後跟一個SalI位點。然後用EcoRV/SalI消化PCR產物J1304，並作為～750bp的片段克隆到來自pJP099的～4.5kb的EcoRV/SalI片段(見上文實施例1)。產生的質粒通過序列分析證實並命名為pJP102(見圖2的pJP102圖和圖3的序列(SEQ ID NO8))。ORF2序列與GenBank提供的序列匹配，登錄號為AF055392。供體質粒pJP102(用NotI線性化)用於體外重組試驗(IVR)，產生ALVAC重組體vCP1614(見實施例6)。引物序列JP760(SEQ ID NO6)CAT-CAT-CAT-GAT-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-ACG-TAT-CCA-AGG-AGG-CGJP773(SEQ ID NO7)TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-GGG-TTT-AAG-TGG-GGG-GTC實施例3-構建PCV2 ORF2和ORF1的ALVAC供體質粒用引物JP774(SEQ ID NO9)和JP775(SEQ ID NO10)在質粒pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI No.14上通過PCR擴增PCV2 ORF1，產生PCR J1311。引物JP774(SEQ ID NO9)含有從NruI到H6啟動子的3′端和PCV2 ORF1的5′端。引物JP775(SEQ ID NO10)含有PCV2ORF1的3′端，後跟一個SalI位點。PCR產物J1311(～1kb)克隆到pCR2.1(Invitrogen，Carsbad，CA)。產生的質粒通過序列分析證實並命名為pJP104。ORF1序列與GenBank提供的序列匹配，登錄號為AF055392。將從pJP104分離的～970bp的NruI/SalI片段克隆到來自pJP099的～4.5kb的NruI/SalI片段(見實施例1)，產生的質粒用限制酶切分析並命名為pJP105(見圖4)。供體質粒pJP105(用NotI線性化)用於體外重組試驗(實施例6有描述)，產生表達PCV2 ORF1的ALVAC重組體。
用DNA聚合酶的Klenow片段削平來自pJP102的～838bp的BamHI/SalI片段，並克隆到Klenow削平的pJP105的EcoRI位點。通過限制酶切分析檢查插入片段的方向並選擇頭對頭的方向。該質粒用序列分析證實並命名為pJP107(見圖5的pJP107圖和圖6的序列(SEQ IDNO11))。供體質粒pJP107(用NotI線性化)用於體外重組5(IVR)試驗，產生ALVAC重組體vCP1615(見實施例6)。引物序列JP774(SEQ ID NO9)CAT-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GCC-CAG-CAA-GAA-GAA-TGGJP775(SEQ ID NO10)TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTC-ATA-TGG實施例4-構建PCV1 ORF2的ALVAC供體質粒質粒pPCV1(B.Meehan等，J.Gen.Virol.1997.78.221-227)含有在質粒pGem7Z中作為PstI片段的PCV1基因組，作為模板用來擴增PCV1ORF2。
為了將PCV1 ORF2插入合適的ALVAC插入載體使用引物JP787(SEQ ID NO12)和JP788(SEQ ID NO13)從質粒pCV1擴增PCV1ORF2(見上文)，產生PCRJ1315。引物JP787(SEQ ID NO12)含有從EcoRV到H6啟動子的3′端和ORF2，後跟一個SalI位點。然後用EcoRV/SalI消化PCR產物J1315並克隆到來自pJP099的～4.5kb的EcoRV/SalI片段(見上文實施例1)。產生的質粒通過序列分析證實並命名為pJP113。ORF2序列與GenBank提供的序列匹配，登錄號為U49186。供體質粒pJP113(用NotI線性化)用於體外重組試驗(IVR)，產生ALVAC重組體vCP1621(見實施例7)。引物序列JP787(SEQ ID NO12)CAT-CAT-CAT-GAT-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-ACG-TGG-CCA-AGG-AGG-CGJP788(SEQ ID NO13)TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-TTT-ATT-TAG-AGG-GTC-TTT-TAG-G實施例5-構建PCV1 ORF2和ORF1的ALVAC供體質粒用PstI消化質粒pPCV1(見施例4)，該質粒含有在質粒pGem-7Z中作為PstI片段的PCV1基因組。分離1759bp的片段並連接。
使用引物JP789(SEQ ID NO14)和JP790(SEQ ID NO15)從連接了PstI片段的1759bp的片段擴增PCV1 ORF1，產生PCR J1316。引物JP789(SEQ ID NO14)含有從NruI到H6啟動子的3』端和PCV1 ORF1的5』端。引物JP790(SEQ ID NO15)含有PCV1 ORF1的3』端，後跟一個SalI位點。PCR產物J1316(～1kb)克隆到pCR2.1(Invitrogen，Carsbad，CA)。產生的質粒通過序列分析證實並命名為pJP114。ORF1序列與GenBank提供的序列匹配，登錄號為U49186。從pJP114分離的～970bp的NruI/SalI片段克隆到來自pJP099的～4.5kb的NruI/SalI片段(見實施例1)，產生的質粒用限制酶切分析並命名為pJP115。供體質粒pJP105(用NotI線性化)用於體外重組試驗(實施例6有描述)，產生表達PCV1 ORF1的ALVAC重組體。
用DNA聚合酶的Klenow片段削平來自pJP113的～838bp的BamHI/SalI片段，並克隆到Klenow削平的pJP115的EcoRI位點。通過限制酶切分析檢查插入片段的方向，選擇頭對頭的方向。該質粒通過序列分析證實並命名為pJP117。供體質粒pJP117(用NotI線性化)用於體外重組(IVR)試驗，產生ALVAC重組體vCP1622(見實施例7)。引物序列JP789(SEQ ID NO14)CAT-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GCC-AAG-CAA-GAA-AAG-CGGJP790(SEQ ID NO15)TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTT-ATA-TGG實施例6-ALVACPCV2重組體的產生質粒pJP102(見實施例2和圖2)和pJp107(見實施例3和圖5)用NotI線性化，並使用先前描述的磷酸鈣沉澱法轉染ALVAC感染的原代CEF細胞(Panicali和Paoletti，1982；Piccini等，1987)。根據與放射性標記的特異性PCV2探針雜交選擇陽性噬斑，進行連續四輪噬斑純化，直到獲得純的噬斑。然後擴增每個IVR的代表性噬斑，產生的重組體命名為vCP1614和vCP1615。vCP1614病毒是ALVAC和供體質粒pJP102重組的結果，它含有插入到ALVAC C6位點的PCF2 ORF2。vCP1615病毒是ALVAC和供體質粒pJP107重組的結果，它含有以頭對頭方向插入到ALVAC C6位點的PCV2 ORF2和ORF1。
以相似的方式，用實施例3描述的質粒pJP105可產生表達PCV2ORF1的重組體ALVAC。
免疫螢光.為了確定感染了ALVAC重組體的Vero細胞是否表達PCV2蛋白，進行了免疫螢光分析(IF)。感染的Vero細胞(m.o.i.大約為10)在感染24小時後用PBS洗滌，並用95％冷丙酮室溫固定3分鐘。PCV2ORF1(PCV2 199 1D3GAPCV2 210 7G5GD)或ORF2(PCV2 1904C7CF、PCV2 190 2B1BCPCV2 190 3A8BC)特異的五種單克隆抗體(Mab)製品(雜交瘤上清)用作第一抗體。這些特異的單克隆抗體獲自Merial-Lyon。單克隆抗體也可按照此處引用文獻中的指導來獲得，例如併入本文作為參考的WO-A-99 18214，1998，法國申請號97/12382、98/00873、98/03707，申請日期為1997年10月3日、1998年3月20日和WO99/29717。IF反應按照Taylor等描述的進行(1990)。
使用三個ORF2特異性抗體的PCV2特異的免疫螢光可以在感染了vCP1614的細胞和感染了vCP1614的細胞中檢查到。使用兩個ORF1特異性抗體的PCV2特異的免疫螢光只能在感染了vCP1615的細胞中檢查到。這些結果表明，如預料的那樣，vCP1614隻表達ORF2，而vCP1615表達ORF1和ORF2。在親本ALVAC感染的Vero細胞和未感染的Vero細胞中都沒有檢查到螢光。實施例7-ALVAC-PCV1重組體的產生質粒pJP113(見實施例4)和pJP117(見實施例5)用NotI線性化，並使用先前描述的磷酸鈣沉澱法轉染ALVAC感染的原代CEF細胞(Panicali和Paoletti，1982；Piccini等，1987)。根據與放射性標記的特異性PCV1探針雜交選擇陽性噬斑，進行四輪連續噬斑純化，直到獲得純的噬斑。然後擴增每個IVR的代表性噬斑，產生的重組體命名為vCP1621和vCP1622。vCP1621病毒是ALVAC和供體質粒pJP113重組的結果，它含有插入到ALVAC C6位點的PCV1 ORF2。vCP1622病毒是ALVAC和供體質粒pJP117重組的結果，它含有以頭對頭方向插入到ALVAC C6位點的PCV1 ORF2和ORF1。
以相似的方式，用實施例5描述的質粒pJP115可產生只表達PCV1ORF1的重組體ALVAC。
免疫螢光.為了確定感染了ALVAC重組體的Vero細胞是否表達PCV1蛋白，進行了免疫螢光分析(IF)。感染的Vero細胞(m.o.i.大約為10)在感染24小時後用PBS洗滌，並用95％冷丙酮室溫固定3分鐘。特異的抗PCV1的豬多克隆血清(Allan G等.Vet.Microbiol.1999，66115-123)用作第一抗體。IF反應按照Taylor等描述的進行(1990)。
PCV1特異的免疫螢光可以在感染了vCP1621的細胞和感染了vCP1622的細胞中檢查到。這些結果表明，如預料的那樣，vCP1621和vCP1622表達PCV1特異的產物，用PCV2特異的豬多克隆血清在vCP1621感染的Vero細胞和vCP1622感染的Vero細胞中都沒有檢查到螢光。在親本ALVAC感染的Vero細胞和未感染的Vero細胞中都沒有檢查到螢光。實施例8-用CarbopolTM974P形成重組金絲雀痘病毒為了製備疫苗，重組金絲雀痘病毒vCP1614和vCP1615(實施例6)可與carbomer溶液混合。以同樣的方式，重組金絲雀痘病毒vCP1621和vCP1622(實施例7)可與carbomer溶液混合。用於根據本發明來免疫豬的carbomer成分為BF Goodrich公司製造的CarbopolTM974P(分子量為3,000,000)。首先用含有1g/l氯化鈉的蒸餾水製備1.5％CarbopolTM974P儲備液。然後用該儲備液製備4mg/ml CarbopolTM974P的生理鹽水溶液。在一個步驟或幾個連續步驟中，儲備液與所需體積的生理鹽水混合，每一步用1N(或更濃的)氫氧化鈉溶液調整pH值，使最終pH值為7.3-7.4。這種最終的CarbopolTM974P溶液可立即用於重新組成凍乾重組病毒或用於稀釋濃縮的重組病毒儲備液。例如，為了獲得每2ml劑量含有10e8pfu的最終病毒懸液，可將0.1ml 10e9pfu/ml儲備液加入到立即可用的1.9ml上述4mg/mlCarbopolTM974P溶液中稀釋。以相同的方式，也可製備立即可用的2mg/ml CarbopolTM974P溶液。實施例9-免疫豬及以後的攻擊9.1.免疫1日齡小豬將一組來自caesarian的小豬在第0天放入隔離器。在第2天用各種疫苗溶液通過肌肉途徑接種小豬。用無菌生理鹽水(NaCl 0.9％)稀釋重組病毒儲備液製備疫苗病毒懸液。病毒懸液的合適範圍可根據經驗確定，但通常範圍在106-1010，優選大約1010pfu/劑量。疫苗溶液也可通過將重組病毒懸液與CarbopolTM974P溶液混合來製備，如實施例8中所述。免疫小豬用任一種重組病毒vCP1614(實施例2)；重組病毒vCP1615(實施例3)；與Carbopol(4mg/ml溶液)混合的重組病毒VCP1614；或與Carbopol(4mg/ml溶液)混合的重組病毒vCP1615。
每個劑量病毒懸液含有108噬斑形成單位(pfu)。通過肌肉途徑注射每種病毒懸液1ml。肌肉注射是注射頸部肌肉。
在實驗第2天和第14天注射2針病毒懸液。在第21天用PCV-2強毒株培養物製備的病毒懸液經口鼻攻擊。攻擊後，監視小豬斷奶後多系統症候群的臨床體徵3周。記錄以下體徵直腸溫度攻擊後每天監視持續2周，然後在第3周測量2次直腸溫度。體重臨攻擊前稱量小豬體重，然後在攻擊後前3周每周稱一次體重。在實驗的第2、14、21、28、35和42天採集血樣，來監測病毒血症水平和抗-PCV-2特異性抗體滴度。
屍檢在第42天所有存活的小豬被處以人道安樂死並進行屍檢，觀察PWMS肉眼損害。從肝臟、淋巴結、脾、腎和胸腺製備組織樣品以觀察特異性組織學損害。9.2-免疫5-7周齡小豬無抗PCV-2特異性母體抗體的5-7周齡小豬通過肌肉途徑接種各種疫苗溶液。用無菌生理鹽水(NaCl 0.9％)稀釋重組病毒儲備液製備疫苗病毒懸液。疫苗溶液也可通過將重組病毒懸液與CarbopolTM974P溶液混合來製備，如實施例8中所述。免疫小豬用任一種重組病毒vCP1614(實施例2)；重組病毒vCP1615(實施例3)；與Carbopol(4mg/ml溶液)混合的重組病毒vCP1614；或與Carbopol(4mg/ml溶液)混合的重組病毒vCP1615。
病毒懸液每劑量含有108噬斑形成單位(pfu)。通過肌肉途徑注射每種病毒懸液1ml。肌肉注射是注射到頸部肌肉。
在實驗第0天和第21天注射2針病毒懸液。在第35天用PCV-2強毒株培養物製備的病毒懸液經口鼻攻擊。攻擊後，監視小豬斷奶後多系統症候群的臨床體徵8周。監測的臨床體徵與實施例9.1中描述的相同。只是總監視時間為8周而非3周。
屍檢在整個實驗過程中對攻擊後死亡的小豬及實驗結束時(第97天)所有存活的小豬進行屍檢。組織樣品與實施例9.1中描述的相同。9.3.免疫新生小豬將來自caesarian的一組3-4頭小豬在第0天放入隔離器中。在第2天用1ml PBS中含有108pfu的vCP1614、vCP1615或親本ALVAC載體通過肌肉途徑在頸部接種小豬。在第14天注射第二針疫苗或安慰劑。小豬對接種ALVAC重組體可以很好耐受，沒有接種副反應的證據。在第21天用PCV-2病毒懸液經口鼻途徑(每鼻孔1ml)對小豬進行攻擊。在第45天進行屍檢，並收集組織樣品分離病毒。屍檢結果●PMWS通常特徵為淋巴結病，較罕見的特徵為肝炎或腎炎。按下列方式記錄每頭小豬的淋巴結中的肉眼發現0＝無肉眼可見的淋巴結增大；1＝輕度淋巴結增大，限於支氣管淋巴結；2＝中度淋巴結增大，限於支氣管淋巴結；3＝重度淋巴結增大，涉及支氣管的、下頜下肩甲骨上的和腹股溝的淋巴結。組 分值vCP1614 0.50.00.01.0平均值0.38標準差0.48vCP1615 0.00.50.51.0平均值0.5標準差0.41對照 2.02.5
2.52.5平均值2.38標準差0.25PCV-2的支氣管淋巴結病為顯著的肉眼發現。用vCP1614和vCP1615免疫後，與對照組相比，可觀察到淋巴結損害顯著降低(p≤0.05)。
在具體的優選實施方案描述了本發明，所附權利要求限定的本發明應理解為不限於上述闡明的特殊細節，因為它們可能有許多明顯的變異並不脫離本發明範圍的精神。
參考文獻1.Clark，E.G.Proc.Amer.Assoc.Swine Pract.，第499-501頁(1997).2.Edbauer，C.R.Weinberg，J.Taylor，A.Rey-Senelonge，J.E.Bouquet，P.Desmettre和E.Paoletti，病毒學(Virology)179，901-904(1990).3.Ellis，J.，L.Hassard，E.Clark，J.Harding，G.Allan，P.Willson，J.Strakappe，K.Martin，F.McNeilly，Meehan，D.Todd，D.Haines，Can.Vet.J.39，44-51(1998).4.Goebel，S.J.，G.P.Johnson，M.E.Perkus，S.W.Davis，J.P.Winslow，E.Paoletti，病毒學179，247-266，517-563(1990)5.Guo，P.，S.Goebel，S.Davis，M.E.Perkus，B.Languet，P.Desmettre，G.Allen和E.Paoletti，J.Virol.63，4189-4198(1989).6.Hamel，A.L.，L.L.Lin G.P.S.Nayar，J.Virol.72，5262-5267(1998).7.Harding J.C.，Proc.Am.Assoc.Swine Pract.28，503(1997).8.Mankertz，A.，J.Mankertz，K.Wolf，H.-J.Buhk，Gen，Virol.79，381-384(1998a).9.Mankertz，J.，H.-J.Buhk，Mankertz，A，病毒基因(Virus Gene)16，267-276(1998b).10.Matthews，R.E.F.，Intervirology 17，42-44(1982).11.Meehan，B.M.，J.L.Creelan，M.S.McNulty，D.Todd，J.Gen.Virol.78，221-227(1997).12.Meehan，B.M.，F.McNeilly，D.Todd，S.Kennedy，V.A.Jewhurst，J.A.Ellis，L.E.Hassard，E.G.Clark，D.M.Haines，G.M.Allan，J.Gen，Virol.79，2171-2179(1998).13.Nayar，G.P.S.，A.Hamel和L.Lin.Can.Vet.J.38，385-386(1997).14.Panicali，D.和E.Paoletti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79，4927-4931(1982).15.Paoletti，E.，B.R.Lipinskaks，C.Samsonoff，S.Mercer，和D.Panicali，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，193-197(1984).16.Perkus，M.E.，K.Limbach，和E.Paoletti，J.Virol.63，3829-3826(1989).17.Piccini，A.，M.E.Perkus，和E.Paoletti，酶學方法(Methods inEnzymology)，第153卷，Wu，R.，Grossman，L.編，(學院出版社)第543-563頁(1987).18.Sambrook，J.，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，分子克隆實驗室手冊(Molecular clongingA laboratory manual)，第二版(冷泉出版社，NY)(1989).19.Tartaglia，J.，J.Winslow，S.Goebel，G.P.Johnson，J.Taylor，和E.Paoletti，J.Gen.Virol.71，1517-1524(1990).20.Tartaglia，J.，Perkus ME，Taylor J，Norton EK，Audonnet JC，Cox WI，Davis SW，van der Hoeven J，Meignier B，Riviere M，和E.Paoletti，病毒學188，217-32(1992).21.Taylor，J.，R.Weinberg，B.Languet，Ph.Desmettre E.Paoletti，疫苗(Vaccine)6，497-503(1988a).22.Taylor，J.和E.paoletti，疫苗6，466-468(1988b).23.Taylor，J.，R.Weinberg，Y.Kawaoka，R.Webster和E.Paoletti，疫苗6，504-508(1988c).24.Taylor，J.，C.Edbauer，A.Rey-Senelonge，J.F.Bouquet，E.Norton，S.Goebel，P.Desmettre和E.Paoletti，J.Virol.64，1441-1450(1990).25.Taylor，J.，C.Trimachi，R.Weinberg，B.Lauguet，F.Guillemin，P.Desmettre和E.Paoletti，疫苗9，190-193(1991).26.Taylor J，Weinberg R，Tartaglia J，Richardson C，Alkhatib G，Briedis D，Appel M，Norton E，Paoletti E.，病毒學187，321-328(1992).27.Todd，D.，F.D.Niagro，B.W.Ritchie，W.Curran，G.M.Allan，P.D.Lukert，K.S.Latimer，W.L.Steffens，M.S.McNulty，Arch.Virol.117，129-135(1991).
序列表(1)一般信息(i)申請人Bublot，MichelPerez.Jennifer MCharreyre，Catherine E(ii)發明名稱豬環病毒2重組痘病毒(iii)序列數目13(iv)聯繫地址(A)收件人Frommer Lawrence Haug LLP(B)街道745 Fifth Avenue(C)城市NY(E)國家美國(F)郵政編碼10151(v)計算機可讀形式(A)介質類型磁碟(B)計算機IBM兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatnetIn Release#1.0 Version#1.25(viii)代理人/代理機構數據(A)姓名Kowalski，Thomas J.
(B)登記號32147(C)文檔號454313-2511.1(ix)通訊信息(A)電話212-588-0800(B)傳真212-588-0500(2)SEQ.ID.NO.1的信息(i)序列特徵(A)長度3701個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)SEQ.ID.NO.1的序列描述AAGCTTCTAT CAAAAGTCTT AATGAGTTAG GTGTAGATAG TATAGATATT ACTACAAAGG60TATTCATATT TCCTATCAAT TCTAAAGTAG ATGATATTAA TAACTCAAAG ATGATGATAG120TAGATAATAG ATACGCTCAT ATAATGACTG CAAATTTGGA CGGTTCACAT TTTAATCATC180ACGCGTTCAT AAGTTTCAAC TGCATAGATC AAAATCTCAC TAAAAAGATA GCCGATGTAT240TTGAGAGAGA TTGGACATCT AACTACGCTA AAGAAATTAC AGTTATAAAT AATACATAAT300GGATTTTGTT ATCATCAGTT ATATTTAACA TAAGTACAAT AAAAAGTATT AAATAAAAAT360ACTTACTTAC GAAAAAATGT CATTATTACA AAAACTATAT TTTACAGAAC AATCTATAGT420AGAGTCCTTT AAGAGTTATA ATTTAAAAGA TAACCATAAT GTAATATTTA CCACATCAGA480TGATGATACT GTTGTAGTAA TAAATGAAGA TAATGTACTG TTATCTACAA GATTATTATC540ATTTGATAAA ATTCTGTTTT TTAACTCCTT TAATAACGGT TTATCAAAAT ACGAAACTAT600TAGTGATACA ATATTAGATA TAGATACTCA TAATTATTAT ATACCTAGTT CTTCTTCTTT660GTTAGATATT CTAAAAAAAA GAGCGTGTGA TTTAGAATTA GAAGATCTAA ATTATGCGTT720AATAGGAGAC AATAGTAACT TATATTATAA AGATATGACT TACATGAATA ATTGGTTATT780TACTAAAGGA TTATTAGATT ACAAGTTTGT ATTATTGCGC GATGTAGATA AATGTTACAA840ACAGTATAAT AAAAAGAATA CTATAATAGA TATAATACAT CGCGATAACA GACAGTATAA900CATATGGGTT AAAAATGTTA TAGAATACTG TTCTCCTGGC TATATATTAT GGTTACATGA960TCTAAAAGCC GCTGCTGAAG ATGATTGGTT AAGATACGAT AACCGTATAA ACGAATTATC1020TGCGGATAAA TTATACACTT TCGAGTTCAT AGTTATATTA GAAAATAATA TAAAACATTT1080ACGAGTAGGT ACAATAATTG TACATCCAAA CAAGATAATA GCTAATGGTA CATCTAATAA1140TATACTTACT GATTTTCTAT CTTACGTAGA AGAACTAATA TATCATCATA ATTCATCTAT1200AATATTGGCC GGATATTTTT TAGAATTCTT TGAGACCACT ATTTTATCAG AATTTATTTC1260TTCATCTTCT GAATGGGTAA TGAATAGTAA CTGTTTAGTA CACCTGAAAA CAGGGTATGA1320AGCTATACTC TTTGATGCTA GTTTATTTTT CCAACTCTCT ACTAAAAGCA ATTATGTAAA1380ATATTGGACA AAGAAAACTT TGCAGTATAA GAACTTTTTT AAAGACGGTA AACAGTTAGC1440AAAATATATA ATTAAGAAAG ATAGTCAGGT GATAGATAGA GTATGTTATT TACACGCAGC1500TGTATATAAT CACGTAACTT ACTTAATGGA TACGTTTAAA ATTCCTGGTT TTGATTTTAA1560ATTCTCCGGA ATGATAGATA TACTACTGTT TGGAATATTG CATAAGGATA ATGAGAATAT1620ATTTTATCCG AAACGTGTTT CTGTAACTAA TATAATATCA GAATCTATCT ATGCAGATTT1680TTACTTTATA TCAGATGTTA ATAAATTCAG TAAAAAGATA GAATATAAAA CTATGTTTCC1740TATACTCGCA GAAAACTACT ATCCAAAAGG AAGGCCCTAT TTTACACATA CATCTAACGA1800AGATCTTCTG TCTATCTGTT TATGCGAAGT AACAGTTTGT AAAGATATAA AAAATCCATT1860ATTATATTCT AAAAAGGATA TATCAGCAAA ACGATTCATA GGTTTATTTA CATCTGTCGA1920TATAAATACG GCTGTTGAGT TAAGAGGATA TAAAATAAGA GTAATAGGAT GTTTAGAATG1980GCCTGAAAAG ATAAAAATAT TTAATTCTAA TCCTACATAC ATTAGATTAT TACTAACAGA2040AAGACGTTTA GATATTCTAC ATTCCTATCT GCTTAAATTT AATATAACAG AGGATATAGC2100TACCAGAGAT GGAGTCAGAA ATAATTTACC TATAATTTCT TTTATCGTCA GTTATTGTAG2160ATCGTATACT TATAAATTAC TAAATTGCCA TATGTACAAT TCGTGTAAGA TAACAAAGTG2220TAAATATAAT CAGGTAATAT ATAATCCTAT ATAGGAGTAT ATATAATTGA AAAAGTAAAA2280TATAAATCAT ATAATAATGA AACGAAATAT CAGTAATAGA CAGGAACTGG CAGATTCTTC2340TTCTAATGAA GTAAGTACTG CTAAATCTCC AAAATTAGAT AAAAATGATA CAGCAAATAC2400AGCTTCATTC AACGAATTAC CTTTTAATTT TTTCAGACAC ACCTTATTAC AAACTAACTA2460AGTCAGATGA TGAGAAAGTA AATATAAATT TAACTTATGG GTATAATATA ATAAAGATTC2520ATGATATTAA TAATTTACTT AACGATGTTA ATAGACTTAT TCCATCAACC CCTTCAAACC2580TTTCTGGATA TTATAAAATA CCAGTTAATG ATATTAAAAT AGATTGTTTA AGAGATGTAA2640ATAATTATTT GGAGGTAAAG GATATAAAAT TAGTCTATCT TTCACATGGA AATGAATTAC2700CTAATATTAA TAATTATGAT AGGAATTTTT TAGGATTTAC AGCTGTTATA TGTATCAACA2760ATACAGGCAG ATCTATGGTT ATGGTAAAAC ACTGTAACGG GAAGCAGCAT TCTATGGTAA2820CTGGCCTATG TTTAATAGCC AGATCATTTT ACTCTATAAA CATTTTACCA CAAATAATAG2880GATCCTCTAG ATATTTAATA TTATATCTAA CAACAACAAA AAAATTTAAC GATGTATGGC2940CAGAAGTATT TTCTACTAAT AAAGATAAAG ATAGTCTATC TTATCTACAA GATATGAAAG3000AAGATAATCA TTTAGTAGTA GCTACTAATA TGGAAAGAAA TGTATACAAA AACGTGGAAG3060CTTTTATATT AAATAGCATA TTACTAGAAG ATTTAAAATC TAGACTTAGT ATAACAAAAC3120AGTTAAATGC CAATATCGAT TCTATATTTC ATCATAACAG TAGTACATTA ATCAGTGATA3180TACTGAAACG ATCTACAGAC TCAACTATGC AAGGAATAAG CAATATGCCA ATTATGTCTA3240ATATTTTAAC TTTAGAACTA AAACGTTCTA CCAATACTAA AAATAGGATA CGTGATAGGC3300TGTTAAAAGC TGCAATAAAT AGTAAGGATG TAGAAGAAAT ACTTTGTTCT ATACCTTCGG3360AGGAAAGAAC TTTAGAACAA CTTAAGTTTA ATCAAACTTG TATTTATGAA CACTATAAAA3420AAATTATGGA AGATACAAGT AAAAGAATGG ATGTTGAATG TCGTAGTTTA GAACATAACT3480ATACGGCTAA CTTATATAAA GTGTACGGAC AAAACGAATA TATGATTACT TATATACTAG3540CTCTCATAAG TAGGATTAAT AATATTATAG AAACTTTAAA ATATAATCTG GTGGGGCTAG3600ACGAATCTAC AATACGTAAT ATAAATTATA TAATTTCACA AAGAACAAAA AAAAATCAAG3660TTTCTAATAC CTTATAGATA AACTATATTT TTTACCACTG A3701(2)SEQ.ID.NO.2的信息(i)序列特徵(A)長度42個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)SEQ.ID.NO.2的序列描述ATCATCGAGC TCGCGGCCGC CTATCAAAAG TCTTAATGAG TT42(2)SEQ.ID.NO.3的信息(i)序列特徵(A)長度73個鹼基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)SEQ.ID.NO.3的序列描述GAATTCCTCG AGCTGCAGCC CGGGTTTTTA TAGCTAATTA GTCATTTTTT CGTAAGTAAG60TATTTTTATT TAA73(2)SEQ.ID.NO.4的信息(i)序列特徵(A)長度72個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)SEQ.ID.NO.4的序列描述CCCGGGCTGC AGCTCGAGGA ATTCTTTTTA TTGATTAACT AGTCAAATGA GTATATATAA60TTGAAAAAGT AA72(2)SEQ.ID.NO.5的信息(i)序列特徵(A)長度45個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)SEQ.ID.NO.5的序列描述GATGATGGTA CCTTCATAAA TACAAGTTTG ATTAAACTTA AGTTG45(2)SEQ.ID.NO.6的信息(i)序列特徵(A)長度53個鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)SEQ.ID.NO.6的序列描述CATCATCATG ATATCCGTTA AGTTTGTATC GTAATGACGT ATCCAAGGAG GCG53(2)SEQ.ID.NO.7的信息(i)序列特徵(A)長度36個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)SEQ.ID.NO.7的序列描述TACTACTACG TCGACTTAGG GTTTAAGTGG GGGGTC36(2)SEQ.ID.NO.8的信息(i)序列特徵(A)長度2520個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)SEQ.ID.NO.8的序列描述GGTACCTTCA TAAATACAAG TTTGATTAAA CTTAAGTTGT TCTAAAGTTC TTTCCTCCGA60AGGTATAGAA CAAAGTATTT CTTCTACATC CTTACTATTT ATTGCAGCTT TTAACAGCCT120ATCACGTATC CTATTTTTAG TATTGGTAGA ACGTTTTAGT TCTAAAGTTA AAATATTAGA180CATAATTGGC ATATTGCTTA TTCCTTGCAT AGTTGAGTCT GTAGATCGTT TCAGTATATC240ACTGATTAAT GTACTACTGT TATGATGAAA TATAGAATCG ATATTGGCAT TTAACTGTTT300TGTTATACTA AGTCTAGATT TTAAATCTTC TAGTAATATG CTATTTAATA TAAAAGCTTC360CACGTTTTTG TATACATTTC TTTCCATATT AGTAGCTACT ACTAAATGAT TATCTTCTTT420CATATCTTGT AGATAAGATA GACTATCTTT ATCTTTATTA GTAGAAAATA CTTCTGGCCA480TACATCGTTA AATTTTTTTG TTGTTGTTAG ATATAATATT AAATATCTAG AGGATCCTAT540TATTTGTGGT AAAATGTTTA TAGAGTAAAA TGATCTGGCT ATTAAACATA GGCCAGTTAC600CATAGAATGC TGCTTCCCGT TACAGTGTTT TACCATAACC ATAGATCTGC CTGTATTGTT660GATACATATA ACAGCTGTAA ATCCTAAAAA ATTCCTATCA TAATTATTAA TATTAGGTAA720TTCATTTCCA TGTGAAAGAT AGACTAATTT TATATCCTTT ACCTCCAAAT AATTATTTAC780ATCTCTTAAA CAATCTATTT TAATATCATT AACTGGTATT TTATAATATC CAGAAAGGTT840TGAAGGGGTT GATGGAATAA GTCTATTAAC ATCGTTAAGT AAATTATTAA TATCATGAAT900CTTTATTATA TTATACCCAT AAGTTAAATT TATATTTACT TTCTCATCAT CTGACTTAGT960TAGTTTGTAA TAAGGTGTGT CTGAAAAAAT TAAAAGGTAA TTCGTTGAAT GAAGCTGTAT1020TTGCTGTATC ATTTTTATCT AATTTTGGAG ATTTAGCAGT ACTTACTTCA TTAGAAGAAG1080AATCTGCCAG TTCCTGTCTA TTACTGATAT TTCGTTTCAT TATTATATGA TTTATATTTT1140ACTTTTTCAA TTATATATAC TCATTTGACT AGTTAATCAA TAAAAAGAAT TCCTGCAGCC1200CTGCAGCTAA TTAATTAAGC TACAAATAGT TTCGTTTTCA CCTTGTCTAA TAACTAATTA1260ATTAAGGATC CCCCAGCTTC TTTATTCTAT ACTTAAAAAG TGAAAATAAA TACAAAGGTT1320CTTGAGGGTT GTGTTAAATT GAAAGCGAGA AATAATCATA AATTATTTCA TTATCGCGAT1380ATCCGTTAAG TTTGTATCGT AATGACGTAT CCAAGGAGGC GTTACCGCAG AAGAAGACAC1440CGCCCCCGCA GCCATCTTGG CCAGATCCTC CGCCGCCGCC CCTGGCTCGT CCACCCCCGC1500CACCGCTACC GTTGGAGAAG GAAAAATGGC ATCTTCAACA CCCGCCTCTC CCGCACCTTC1560GGATATACTG TCAAGCGTAC CACAGTCACA ACGCCCTCCT GGGCGGTGGA CATGATGAGA1620TTTAAAATTG ACGACTTTGT TCCCCCGGGA GGGGGGACCA ACAAAATCTC TATACCCTTT1680GAATACTACA GAATAAGAAA GGTTAAGGTT GAATTCTGGC CCTGCTCCCC CATCACCCAG1740GGTGATAGGG GAGTGGGCTC CACTGCTGTT ATTCTAGATG ATAACTTTGT AACAAAGGCC1800ACAGCCCTAA CCTATGACCC ATATGTAAAC TACTCCTCCC GCCATACAAT CCCCCAACCC1860TTCTCCTACC ACTCCCGTTA CTTCACACCC AAACCTGTTC TTGACTCCAC TATTGATTAC1920TTCCAACCAA ATAACAAAAG GAATCAGCTT TGGCTGAGAC TACAAACCTC TGGAAATGTG1980GACCACGTAG GCCTCGGCGC TGCGTTCGAA AACAGTAAAT ACGACCAGGA CTACAATATC2040CGTGTAACCA TGTATGTACA ATTCAGAGAA TTTAATCTTA AAGACCCCCC ACTTAAACCC2100TAAGTCGACC CCGGGTTTTT ATAGCTAATT AGTCATTTTT TCGTAAGTAA GTATTTTTAT2160TTAATACTTT TTATTGTACT TATGTTAAAT ATAACTGATG ATAACAAAAT CCATTATGTA2220TTATTTATAA CTGTAATTTC TTTAGCGTAG TTAGATGTCC AATCTCTCTC AAATACATCG2280GCTATCTTTT TAGTGAGATT TTGATCTATG CAGTTGAAAC TTATGAACGC GTGATGATTA2340AAATGTGAAC CGTCCAAATT TGCAGTCATT ATATGAGCGT ATCTATTATC TACTATCATC2400ATCTTTGAGT TATTAATATC ATCTACTTTA GAATTGATAG GAAATATGAA TACCTTTGTA2460GTAATATCTA TACTATCTAC ACCTAACTCA TTAAGACTTT TGATAGGCGG CCGCGAGCTC2520(2)SEQ.ID.NO.9的信息(i)序列特徵(A)長度57個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)SEQ.ID.NO.9的序列描述CATCATCATT CGCGATATCC GTTAAGTTTG TATCGTAATG CCCAGCAAGA AGAATGG57(2)SEQ.ID.NO.10的信息(i)序列特徵(A)長度36個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)SEQ.ID.NO.10的序列描述TACTACTACG TCGACTCAGT AATTTATTTC ATATGG36(2)SEQ.ID.NO.11的信息(i)序列特徵(A)長度3609個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)SEQ.ID.NO.11的序列描述GGTACCTTCA TAAATACAAG TTTGATTAAA CTTAAGTTGT TCTAAAGTTC TTTCCTCCGA60AGGTATAGAA CAAAGTATTT CTTCTACATC CTTACTATTT ATTGCAGCTT TTAACAGCCT120ATCACGTATC CTATTTTTAG TATTGGTAGA ACGTTTTAGT TCTAAAGTTA AAATATTAGA180CATAATTGGC ATATTGCTTA TTCCTTGCAT AGTTGAGTCT GTAGATCGTT TCAGTATATC240ACTGATTAAT GTACTACTGT TATGATGAAA TATAGAATCG ATATTGGCAT TTAACTGTTT300TGTTATACTA AGTCTAGATT TTAAATCTTC TAGTAATATG CTATTTAATA TAAAAGCTTC360CACGTTTTTG TATACATTTC TTTCCATATT AGTAGCTACT ACTAAATGAT TATCTTCTTT420CATATCTTGT AGATAAGATA GACTATCTTT ATCTTTATTA GTAGAAAATA CTTCTGGCCA480TACATCGTTA AATTTTTTTG TTGTTGTTAG ATATAATATT AAATATCTAG AGGATCCTAT540TATTTGTGGT AAAATGTTTA TAGAGTAAAA TGATCTGGCT ATTAAACATA GGCCAGTTAC600CATAGAATGC TGCTTCCCGT TACAGTGTTT TACCATAACC ATAGATCTGC CTGTATTGTT660GATACATATA ACAGCTGTAA ATCCTAAAAA ATTCCTATCA TAATTATTAA TATTAGGTAA720TTCATTTCCA TGTGAAAGAT AGACTAATTT TATATCCTTT ACCTCCAAAT AATTATTTAC780ATCTCTTAAA CAATCTATTT TAATATCATT AACTGGTATT TTATAATATC CAGAAAGGTT840TGAAGGGGTT GATGGAATAA GTCTATTAAC ATCGTTAAGT AAATTATTAA TATCATGAAT900CTTTATTATA TTATACCCAT AAGTTAAATT TATATTTACT TTCTCATCAT CTGACTTAGT960TAGTTTGTAA TAAGGTGTGT CTGAAAAAAT TAAAAGGTAA TTCGTTGAAT GAAGCTGTAT1020TTGCTGTATC ATTTTTATCT AATTTTGGAG ATTTAGCAGT ACTTACTTCA TTAGAAGAAG1080AATCTGCCAG TTCCTGTCTA TTACTGATAT TTCGTTTCAT TATTATATGA TTTATATTTT1140ACTTTTTCAA TTATATATAC TCATTTGACT AGTTAATCAA TAAAAAGAAT TTCGACTTAG1200GGTTTAAGTG GGGGGTCTTT AAGATTAAAT TCTCTGAATT GTACATACAT GGTTACACGG1260ATATTGTAGT CCTGGTCGTA TTTACTGTTT TCGAACGCAG CGCCGAGGCC TACGTGGTCC1320ACATTTCCAG AGGTTTGTAG TCTCAGCCAA AGCTGATTCC TTTTGTTATT TGGTTGGAAG1380TAATCAATAG TGGAGTCAAG AACAGGTTTG GGTGTGAAGT AACGGGAGTG GTAGGAGAAG1440GGTTGGGGGA TTGTATGGCG GGAGGAGTAG TTTACATATG GGTCATAGGT TAGGGCTGTG1500GCCTTTGTTA CAAAGTTATC ATCTAGAATA ACAGCAGTGG AGCCCACTCC CCTATCACCC1560TGGGTGATGG GGGAGCAGGG CCAGAATTCA ACCTTAACCT TTCTTATTCT GTAGTATTCA1620AAGGGTATAG AGATTTTGTT GGTCCCCCCT CCCGGGGGAA CAAAGTCGTC AATTTTAAAT1680CTCATCATGT CCACCGCCCA GGAGGGCGTT GTGACTGTGG TACGCTTGAC AGTATATCCG1740AAGGTGCGGG AGAGGCGGGT GTTGAAGATG CCATTTTTCC TTCTCCAACG GTAGCGGTGG1800CGGGGGTGGA CGAGCCAGGG GCGGCGGCGG AGGATCTGGC CAAGATGGCT GCGGGGGCGG1860TGTCTTCTTC TGCGGTAACG CCTCCTTGGA TACGTCATTA CGATACAAAC TTAACGGATA1920TCGCGATAAT GAAATAATTT ATGATTATTT CTCGCTTTCA ATTTAACACA ACCCTCAAGA1980ACCTTTGTAT TTATTTTCAC TTTTTAAGTA TAGAATAAAG AAGCTGGGGG ATCAATTCCT2040GCAGCCCTGC AGCTAATTAA TTAAGCTACA AATAGTTTCG TTTTCACCTT GTCTAATAAC2100TAATTAATTA AGGATCCCCC AGCTTCTTTA TTCTATACTT AAAAAGTGAA AATAAATACA2160AAGGTTCTTG AGGGTTGTGT TAAATTGAAA-GCGAGAAATA ATCATAAATT ATTTCATTAT2220CGCGATATCC GTTAAGTTTG TATCGTAATG CCCAGCAAGA AGAATGGAAG AAGCGGACCC2280CAACCACATA AAAGGTGGGT GTTCACGCTG AATAATCCTT CCGAAGACGA GCGCAAGAAA2340ATACGGGAGC TCCCAATCTC CCTATTTGAT TATTTTATTG TTGGCGAGGA GGGTAATGAG2400GAAGGACGAA CACCTCACCT CCAGGGGTTC GCTAATTTTG TGAAGAAGCA AACTTTTAAT2460AAAGTGAAGT GGTATTTGGG TGCCCGCTGC CACATCGAGA AAGCCAAAGG AACTGATCAG2520CAGAATAAAG AATATTGCAG TAAAGAAGGC AACTTACTTA TTGAATGTGG AGCTCCTCGA
此頁公開時缺失TGATGATTAA AATGTGAACC GTCCAAATTT GCAGTCATTA TATGAGCGTA TCTATTATCT3480ACTATCATCA TCTTTGAGTT ATTAATATCA TCTACTTTAG AATTGATAGG AAATATGAAT3540ACCTTTGTAG TAATATCTAT ACTATCTACA CCTAACTCAT TAAGACTTTT GATAGGCGGC3600CGCGAGCTC3609(2)SEQ.ID.NO.12的信息(i)序列特徵(A)長度53個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)SEQ.ID.NO.12的序列描述CATCATCATG ATATCCGTTA AGTTTGTATC GTAATGACGT GGCCAAGGAG GCG53(2)SEQ.ID.NO.13的信息(i)序列特徵(A)長度40個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)SEQ.ID.NO.13的序列描述TACTACTACG TCGACTTATT TATTTAGAGG GTCTTTTAGG40
權利要求
1.一種含有來自豬環狀病毒2的DNA的重組病毒。
2.根據權利要求1的重組病毒，其為痘病毒。
3.根據權利要求2的重組痘病毒，其為禽痘病毒。
4.根據權利要求3的重組禽痘病毒，其為ALVAC。
5.根據權利要求4的重組ALVAC病毒，其中來自豬環狀病毒2的DNA編碼並表達為豬環狀病毒的主要衣殼蛋白或目的表位。
6.根據權利要求4的重組ALVAC病毒，其中來自豬環狀病毒2的DNA含有豬環狀病毒2的開放讀碼框2(ORF2)。
7.根據權利要求4的重組ALVAC病毒，其中來自豬環狀病毒2的DNA含有豬環狀病毒2的開放讀碼框1(ORF1)。
8.根據權利要求4的重組ALVAC病毒，其中來自豬環狀病毒2的DNA含有豬環狀病毒2的開放讀碼框1和2(ORF1和2)。
9.根據權利要求4的重組ALVAC病毒，其為vCP1614和vCP1615。
10.一種用於在接種了該免疫組合物的宿主內誘導免疫應答的免疫組合物，該免疫組合物含有一種載體和根據權利要求1的重組病毒。
11.一種用於在接種了該免疫組合物的宿主內誘導免疫應答的免疫組合物，該免疫組合物含有載體和根據權利要求5的重組病毒。
12.一種用於在接種了該免疫組合物的宿主內誘導免疫應答的免疫組合物，該免疫組合物含有載體和根據權利要求6的重組病毒。
13.一種用於在接種了該免疫組合物的宿主內誘導免疫應答的免疫組合物，該免疫組合物含有載體和根據權利要求7的重組病毒。
14.一種用於在接種了該免疫組合物的宿主內誘導免疫應答的免疫組合物，該免疫組合物含有載體和根據權利要求8的重組病毒。
15.一種用於在接種了該免疫組合物的宿主內誘導免疫應答的免疫組合物，該免疫組合物含有載體和根據權利要求9的重組病毒。
16.一種用於在宿主內誘導免疫應答的方法，其包括給予宿主根據權利要求11的免疫組合物。
17.一種用於在宿主內誘導免疫應答的方法，其包括給予宿主根據權利要求12的免疫組合物。
18.一種用於在宿主內誘導免疫應答的方法，其包括給予宿主根據權利要求13的免疫組合物。
19.一種用於在宿主內誘導免疫應答的方法，其包括給予宿主根據權利要求14的免疫組合物。
20.一種用於在宿主內誘導免疫應答的方法，其包括給予宿主根據權利要求15的免疫組合物。
全文摘要
本發明描述了含有來自豬環狀病毒2的外源DNA的重組痘病毒,例如禽痘病毒。也描述了含有該重組痘病毒的免疫組合物,用於誘導施用了該免疫組合物的宿主動物體內的免疫應答。還描述了通過將本發明的免疫組合物給予需要治療或對豬環狀病毒2的感染敏感的動物,來治療或預防豬環狀病毒2引起的疾病的方法。
文檔編號C12N7/00GK1361824SQ00810560
公開日2002年7月31日 申請日期2000年6月9日 優先權日1999年6月10日
發明者M·巴布洛特, J·M·佩裡茲, C·E·查雷爾 申請人:梅瑞爾公司