慢性炎症狀態的治療的製作方法

2023-12-08 08:18:31 4

專利名稱：慢性炎症狀態的治療的製作方法
技術領域：
本發明通常涉及慢性炎症狀態的治療，具體而言，涉及減輕或在其它方面改善這種狀態在患者中的影響的方法。在一具體的實施方案中，本發明涉及關節炎的治療，尤其是類風溼性關節炎的治療，所述類風溼性關節炎是以多種炎性介質的存在和動關節的破壞為特徵的慢性炎性疾病。
背景技術：
作為免疫系統的一部分，白介素-3(IL_3)是能提高身體對疾病的天然應答的細胞因子。IL-3刺激多能造血幹細胞(多能的(pluripotent))分化成髓系祖細胞以及刺激髓系中所有細胞(紅細胞、血小板、粒細胞、單核細胞和樹突細胞)的增殖。其由活化的T細胞分泌以在免疫應答中支持來自骨髓的T細胞的生長和分化。
IL-3通過與稱為白介素-3受體(IL-3R)的特異性細胞表面受體的結合而展示其活性。IL-3R 是由 70kDa 的 IL_3Ra (CD123)和 120_140kDa 的 IL-3R β (CD131)組成的異二聚體結構。IL-3Ra鏈(IL-3Ra)具有非常短的胞內結構域，而IL-3R0鏈(IL_3R0)具有非常大的胞質結構域。IL-3Ra以相對低的親和力結合IL-3。然而，在存在IL_3Ri3的情況下，IL-3R a對IL-3具有相對非常高的親和力。還不清楚在IL-3結合之後信號轉導是如何發生的，不過最近的研究提示信號轉導需要包含十二聚物的更高級的複合物的形成、IL-3R0鏈還為IL-5和GM-CSF的受體共享。已知表達IL-3受體的細胞包括造血祖細胞、肥大細胞、嗜鹼性粒細胞和血單核細胞以及各種造血譜系更成熟的細胞，包括單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、巨核細胞、紅細胞和CD5+B細胞亞群2。還顯示表達所述受體的非造血細胞包括一些內皮細胞、基質細胞、樹突細胞和萊迪希細胞2』3。IL-3在免疫系統和造血系統之間提供了可能至關重要的關聯4。這對於肥大細胞和嗜鹼性粒細胞的產生和功能，尤其在免疫應答期間，可能是至關重要的5。IL-3還可以促進巨噬細胞譜系群的生長和活化6_8，並且可以幫助生成樹突細胞9。如上文所指出的，IL-3信號轉導由通用受體β亞基(IL_3Ri3)和特異性配體結合a亞基(IL-3Ra)介導，儘管在小鼠中還有另外的β亞基'關於IL-3在慢性炎症狀態如類風溼性關節炎(RA)中的作用還知之甚少。在一項研究11中在RA患者的滑膜中無法檢測到IL-3mRNA，但在以後的研究12中卻發現了IL-3mRNA ;發現一些而不是所有的RA患者在循環中具有可檢測的IL-313，並且IL-3基因啟動子中的單核苷酸多態性和RA之間存在相關性14。然而，在大鼠關節炎模型的關節炎進展期間，IL-3水平下降15，並且最近已經報導，IL-3給藥能抑制鼠的炎性關節炎16。在引起本發明的工作中，發明人已經發現，通過阻斷或幹擾IL-3和IL-3R之間的配體/受體相互作用能夠抑制或減輕慢性炎症狀態如RA的影響。該發現是非常意外的，並且相對於近期報導16而言是預料不到的，該報導表明IL-3給藥有減小炎性應答的潛能並且間接阻止炎性關節炎中的軟骨和骨骼喪失。本說明書中提到的出版物的題錄詳情在說明書的末尾處弓I用。
本說明書對任何現有出版物(或從其得到的信息)或任何已知內容的引用不是，且不應被視為是對該現有出版物(或從其得到的信息)或形成本說明書所涉及的研究領域中的一般公知常識的一部分的已知內容的承認、應允或任何形式的暗示。在本說明書及隨後的權利要求書的全文中，除非上下文指示並非這樣，否則詞語「包含(comprise) 」及其變形如「包含(comprises) 」和「包含(comprising) 」,都應當被理解為暗示包含所陳述的整數或步驟，或整數或步驟組，但並不排除任何其它整數或步驟，或整數或步驟組。發明概述一方面，本發明提供了治療患者中慢性炎症狀態的方法，其包括給予患者阻斷或抑制所述患者中IL-3信號轉導事件的試劑。
另一方面，本發明提供了阻斷或抑制IL-3信號轉導事件的試劑在治療患者的慢性炎症狀態中的用途，或在製備用於治療患者的慢性炎症狀態的藥物中的用途。另一方面，本發明提供了用於治療患者中慢性炎症狀態的試劑，其中所述試劑阻斷或抑制患者中的IL-3信號轉導事件。在本發明的其它方面中，所述試劑可被配製成帶有一種或多種藥學上可接受的賦形劑和/或稀釋劑的藥物組合物，或者可以將所述試劑提供在試劑盒中，所述試劑盒任選地包含按照用於治療患者中慢性炎症狀態的方法使用所述試劑的說明書。慢性炎症狀態可以例如是關節炎，更具體而言是炎性關節炎如RA。優選地，所述試劑是阻斷或抑制患者中IL-3/IL-3R或IL-3/IL-3Ra相互作用的試劑。還優選的是，患者是人。


圖I顯示了接受抗IL_3mAb或PBS(對照)的小鼠中膠原蛋白誘導的關節炎(CIA)的進程(臨床評分)。結果表示為平均值土SEM。小鼠處理組n=10，小鼠對照組n=6。圖2顯示了 IL-3信號轉導對單核細胞(來源於PBMC的⑶14+)的細胞活力的影響。以每隻6cm IWAKI (低貼壁)TC盤大約I. 8x IO6細胞的密度接種單核細胞，並在 RPMI+10%FCS 以及單獨的 IL-3 (3ng/ml)、IL-3 (3ng/ml) +IL-3-R 抗體、或單獨的IL-3 (O. 3ng/ml)、或IL-3 (O. 3ng/ml)+IL-3-R抗體中培養7天。在每種情況下使用I μ g/ml的IL-3-R抗體。在第4天時，添加新的IL-3和IL-3-R抗體。在第7天時，取出細胞並進行計數。圖3顯示了 IL-3以劑量依賴的方式誘導嗜鹼性粒細胞活化標誌物⑶203c。從蕁麻疹患者(URT)和正常供體(NOR)分離PBMC，並用多克隆IgE、FMLP、FMLP和IL-3、或逐漸增加濃度的IL-3刺激PBMC。在用鑑定嗜鹼性粒細胞的混合型抗體和抗嗜鹼性粒細胞活化標誌物CD203c的抗體染色，然後通過流式細胞儀分析之後，計算CD203+ve嗜鹼性粒細胞的百分比。圖4顯示了抗IL-3R抗體封閉IL_3誘導的嗜鹼性粒細胞活化。從正常供體分離PBMC，並在存在或不存在中和抗IL-3R抗體(CSL360)的情況下，用逐漸增加濃度的IL-3刺激PBMC。在用鑑定嗜鹼性粒細胞的混合型抗體和抗嗜鹼性粒細胞活化標誌物CD203c的抗體染色，然後通過流式細胞儀分析之後，計算CD203+ve嗜鹼性粒細胞的百分比。
圖5顯示了抗⑶123單克隆抗體(CSL362)以時間依賴的方式消耗嗜鹼性粒細胞。從正常供體分離PBMC，並在沒有抗體或有消耗性抗CD123抗體(CSL362)的情況下孵育不同的時間(如圖所示)。在用鑑定嗜鹼性粒細胞的混合型抗體染色，並通過流式細胞儀分析之後，計算殘餘的嗜鹼性粒細胞的百分比。圖6顯示了抗⑶123mAb在24小時內可再現地消耗嗜鹼性粒細胞。從三名正常供體分離PBMC，並在沒有抗體或有消耗性抗CD123抗體的情況下孵育24小時。在用鑑定嗜鹼性粒細胞的混合型抗體染色，並通過流式細胞儀分析之後，計算殘餘的嗜鹼性粒細胞的百分比。圖7顯示了抗⑶123mAb在24小時內活化NK細胞。從三名正常供體分離PBMC，並在沒有抗體(實線)或有消耗性抗CD123抗體(CSL362，虛線)的情況下孵育24小時。通過⑶16的下調來確定NK細胞(⑶56+ve細胞)的活化。用鑑定NK細胞的抗⑶56抗體，和抗CD16抗體對PBMC進行染色。通過流式細胞儀確定與沒有抗體的對照相比的CD16染色的缺失。
圖8顯示了通過體內給予抗IL-3Ra抗體而對外周血中鼠嗜鹼性粒細胞的消耗。通過靜脈給予BALB/c小鼠抗IL-3Ra抗體(1C2)、抗CD200R3 (Bal03)、或同型對照抗體小鼠IgG2a(mIgG2a)或大鼠IgG2b (rIgG2b)。所有抗體均以每隻小鼠30 μ g進行注射，除了1C2，其以每隻小鼠18 μ g進行注射。在給予抗體後24小時分離外周血細胞，並對Fe ε Rl α和⑶49b表達進行染色以鑑定嗜鹼性粒細胞。(a)顯示了來自流式細胞儀分析的代表性染色圖。嗜鹼性粒細胞群用框框上。從流式細胞儀分析計算每隻小鼠的嗜鹼性粒細胞的百分t匕，並且(b)顯示了每組3隻小鼠的平均值(+SEM)。#*:p〈0. 001，#:p〈0. 01。發明的詳細描述—方面，本發明提供了治療患者中慢性炎症狀態的方法，其包括給予患者阻斷或抑制所述患者中IL-3信號轉導事件的試劑。優選地，所述試劑是阻斷或抑制患者中IL-3/IL-3R或IL_3/IL_3R α相互作用的試劑。可以按照本發明進行治療的慢性炎症狀態是本領域技術人員熟知的，並且包括具體的關節炎，更具體為炎性關節炎如成人和青少年RA。其它適應症包括但不限於慢性阻塞性肺病(COPD);炎性腸病(IBD)如克羅恩病和潰瘍性結腸炎；慢性炎症性脫髓鞘性多發性神經病(CIDP);動脈粥樣硬化；硬皮病；系統性紅斑狼瘡(SLE);舍格倫症候群(Sjogren’ssyndrome);痛風；骨關節炎；風溼性多肌痛；血清陰性脊柱關節病包括強直性脊柱炎；萊特爾氏病(Reiter’s disease)、銀屑病性關節炎、混合性結締組織病(MCTD);慢性萊姆關節炎；斯提耳病(Still’s disease);慢性蕁麻疹；類風溼性關節炎相關的葡萄膜炎和導致隨意肌和其它肌肉炎症的病症，包括皮肌炎、包涵體肌炎、多肌炎和淋巴管平滑肌瘤病。本文提及的「治療」以其最寬泛的含義來理解，包括治療性處理和預防性措施或防治性措施。需要治療的患者包括已遭受慢性炎症狀態的患者以及待預防這種狀態的患者。部分或完全從所述狀態康復的患者可能還需要治療。術語「治療」並不必然暗指治療患者直至完全康復。因此，治療包括減輕或改善特定慢性炎症狀態的症狀以及停止或至少延遲特定慢性炎症狀態的發作、發展或進程，減輕特定慢性炎症狀態的嚴重程度或消除特定慢性炎症狀態。
按照本發明給予的試劑優選通過阻斷或抑制IL-3/IL-3R或IL-3/IL-3Rci相互作用，來阻斷或抑制患者中IL-3信號轉導事件的活化。如本文所用的，提及「阻斷或抑制患者中的IL-3信號轉導事件」包括導致IL-3起始的信號轉導水平降低的任何幹預。這類幹預包括，舉例來說，使用特異性阻斷或抑制IL-3信號轉導事件活化的試劑(例如，靶向IL-3、IL-3Ra、IL-3Ri3的試劑)，以及使用選擇性靶向能夠進行IL-3信號轉導的細胞並且通過這種靶向能誘導細胞死亡的指定試劑(例如，靶向IL-3R且攜帶抗細胞部分的試劑)。在本發明的一個實施方案中，試劑可以是選擇性結合IL-3或IL-3R、IL_3Ra、或IL-3Ri3的抗原結合分子。本文所用的術語「抗原結合分子」指完整的免疫球蛋白，包括單克隆抗體，如嵌合、人源化或人單克隆抗體，或者指免疫球蛋白的抗原結合片段(包括例如，Fv, Fab、Fab』和F(ab』)2片段)和/或包含可變結構域的片段，所述片段是與完整免疫球蛋白競爭與免疫球蛋白的結合伴侶(如宿主細胞蛋白)的特異性結合的片段。無論結構如何，抗原結合片段都與完整免疫球蛋白所識別的相同抗原結合。抗原結合片段可以通過合成或通過酶促 或化學切割完整免疫球蛋白來產生，或者它們可以通過重組DNA技術而進行遺傳工程化改造。產生抗原結合分子及其片段的方法是本領域內公知的，且描述於例如Antibodies，ALaboratory Manual, Edited by E.Harlow and D.Lane (1988), Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, New York 中，通過引用將其併入本文。優選地，抗原結合分子是單克隆抗體。在本發明的本實施方案中，抗原結合分子可以包含修飾的Fe區，更具體地，包含經修飾以提供增強的效應器功能的Fe區，例如增強的與Fe受體的結合親和力、抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)、抗體依賴性細胞介導的吞噬作用(ADCP)和補體依賴性細胞毒作用(OTC)。對於IgG類抗體，這些效應器功能受Fe區與被稱為Fe Y受體(Fe y Rs)的受體家族的結合的控制，所述Fe Y受體在各種免疫細胞上表達。Fc/FcyR複合物的形成將這些細胞募集至結合的抗原的位點，通常導致信號轉導和隨後的免疫應答。為了增強效應器功能，尤其為了改變相對於「親本」 Fe區的ADCC和/或CDC活性而優化Fe Y R與抗體Fe區的結合親和力的方法是本領域技術人員公知的，且描述於例如國際專利公開號WO2009/070844中。這些方法可以包括修飾抗體的Fe區以增強其與相關Fe受體的相互作用並提高其促進ADCC和ADCP的潛能。還描述了在Fe區內的保守Asn297處進行將寡糖共價連接於IgGl抗體這樣的修飾之後ADCC活性的增強。本文所用的關於抗原結合分子(如抗體或抗體片段)與其結合伴侶(如抗原)的相互作用的術語「選擇性結合」，表示所述相互作用依賴於結合伴侶上特定結構如抗原決定簇或表位的存在，換句話來說，抗體或抗體片段優先結合或識別結合伴侶，即使當結合伴侶存在於其它分子或生物的混合物中時。不希望受任何具體理論的束縛，認為在本發明的本實施方案中，通過與IL-3、或IL-3R、IL-3RQ、或IL_3Ri3的選擇性結合，抗原結合分子諸如抗體或抗體片段阻斷或抑制配體/受體相互作用，並進而幹擾IL-3信號活化。在一實施方案中，抗原結合分子可以是與IL-3Ra (⑶123)選擇性結合的單克隆抗體。因此，抗原結合分子可以是抗⑶123而生成的單克隆抗體(MAb) 7G3，之前報導該抗體顯示出能夠抑制IL-3介導的白血病細胞系和原代細胞的增殖和活化(參見Lopez的美國專利第6，177,678號)。可選擇地，試劑可以是單克隆抗體CSL360，通過將小鼠單克隆抗體7G3的輕鏈可變區和重鏈可變區移植到人IgGl恆定區而獲得的嵌合抗體(參見國際專利公開號WO 2009/070844)。同7G3—樣，CSL360以高親和力結合CD123 (人IL-3R α )，與IL-3競爭受體的結合併阻斷IL-3的生物活性。憑藉CSL360的人IgGl Fe區，CSL360作為人治療劑還具有潛在功效的優勢，其能夠啟動人類體系中的效應器活性。而且，在人體中可能的是，其相對於小鼠7G3等同物將顯示出降低的肅清作用，並且可能具有較低的免疫原性。這種抗原結合分子的其它實例包括7G3或CSL360的人源化抗體變體、具有增強的效應器功能(諸如ADCC活性)的全人抗CD123抗體和抗CD123抗體，例如國際專利公開號W02009/070844的實施例4中所描述的。在本發明的另一實施方案中，試劑可以是能與IL-3R結合但是不導致IL-3信號活化或至少導致降低的IL-3信號活化的IL-3突變蛋白。通常，這些『IL-3突變蛋白』包括通過一個或多個連續或非連續胺基酸殘基的添加、缺失和/或取代而不同的天然或人工突變體。能與IL-3R結合但是表現出降低的IL-3信號活化的IL-3突變蛋白的實例是16/84C — A突變體17。IL-3突變蛋白還可以包括其中一個或多個殘基經修飾以例如增加其體內半衰期 的修飾多肽。這能夠通過連接其它元件如PEG基團來實現。多肽PEG化的方法是本領域內公知的。在本發明的另一實施方案中，試劑是能夠結合IL-3的可溶性受體。這類可溶性受體的實例包括IL-3Ra的胞外部分，或包含相融合的IL_3Ra胞外部分與IL_3Ri3胞外部分的融合蛋白。在另一實施方案中，試劑可以包含可靶向能夠進行IL-3信號轉導的細胞以誘導細胞死亡的抗細胞部分。在一些實施方案中，試劑可以包含與抗原結合分子綴合的抗細胞部分，所述抗原結合分子能與IL-3、或IL-3R、IL-3Ra、或IL_3Ri3選擇性結合。在其它實施方案中，試劑可以包含與IL-3突變蛋白綴合的抗細胞部分。合適的抗細胞部分的實例包括化療藥物、放射性同位素或細胞毒素。化療藥物包括激素如類固醇；抗代謝物如胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤或氨基蝶呤；蒽環類抗生素；絲裂黴素C ;長春花生物鹼；秋水仙胺；依託泊苷；光神黴素；刺孢黴素、CC-1065及其衍生物、或諸如苯丁酸氮芥或美法侖的烷化劑、凝結劑、細胞因子、生長因子、細菌內毒素或細菌內毒素的脂質A部分。放射性同位素包括a -放射體，諸如例如211砹、212鉍和213鉍；以及β -放射體，諸如例如131碘、90釔、177鑥、153釤和109鈀；以及俄歇放射體，諸如例如111銦。細胞毒素通常包括植物、真菌或細菌來源的毒素，諸如A鏈毒素、核糖體滅活蛋白、a-帚曲菌素、麴黴素、restirictocin、核糖核酸酶、白喉毒素或假單胞菌外毒素等，以及來源於海生生物如海綿的細胞毒素，例如 Kahalalide F、Ecteinascidin (Yondelis )或 Variolin B。以有效量給予試劑。「有效量」表示至少部分地達到期望的反應,或延遲或抑制或完全終止被治療的具體狀態的進程所需的量。所述量隨以下而不同待治療的個體的健康和身體狀況、待治療的個體的種族背景、需要保護的程度、組合物的配方、醫療形勢的評價和其它相關因素。預期的是，所述量將落入能夠通過常規試驗來確定的相對寬泛的範圍內。如果需要，試劑的給藥可以重複一次或數次。所給予的實際量將由被治療的狀態的性質和試劑被給予的速率兩者決定。優選地，患者是人，然而，本發明延伸至治療和/或預防其它哺乳動物患者，包括靈長類、家畜(例如，綿羊、豬、牛、馬、驢)、實驗室測試動物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠)、寵物(例如，狗、貓)以及捕獲的野生動物。根據本發明，優選通過腸胃外給藥途徑給予患者試劑。腸胃外給藥包括不通過消化道(即非腸)的任何給藥途徑，包括通過注射、輸注給藥等。通過注射給藥包括，舉例來說，進入靜脈(靜脈內)、動脈(動脈內)、肌肉(肌肉內)和皮膚以下(皮下)。還可以以貯庫製劑或緩釋製劑，例如通過皮下、皮內或肌肉內，以足以獲得期望的藥理效應的劑量給予試劑。另一方面，本發明提供了阻斷或抑制IL-3信號轉導事件的試劑在治療患者的慢性炎症狀態中的用途，或在製備用於治療患者的慢性炎症狀態的藥物中的用途。另一方面，本發明提供了用於治療患者中慢性炎症狀態的試劑，其中所述試劑阻斷或抑制患者中的IL-3信號轉導事件。在本發明的該方面中，上文所述的試劑可被配製成帶有一種或多種藥學上可接受 的賦形劑和/或稀釋劑的藥物組合物。適於腸胃外給藥的組合物適於包含活性成分的無菌水性製劑，其在接受者的血液內優選是等滲的。可以利用合適的分散劑或潤溼劑以及懸浮劑按照已知方法配製該水性制齊U。無菌可注射製劑還可以為處於非毒性的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如為聚乙二醇和乳酸溶液。可以利用的可接受介質和溶劑是水、林格氏合齊 、合適的碳水化合物(例如，蔗糖、麥芽糖、海藻糖、葡萄糖)和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的固定性油常用作溶劑或懸浮介質。為了該目的，可以使用任何溫和的固定油，包括合成的單甘油酯或二甘油酯。此外，發現諸如油酸的脂肪酸可用於製備注射劑。這類治療組合物製劑是本領域技術人員公知的。合適的藥學上可接受的載體和/或稀釋劑包括任何和所有常規溶劑、分散介質、填充劑、固體載體、水性溶液、塗層、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這類介質和試劑用於藥物活性物質的用途是本領域內公知的，並且舉例來說，其描述於Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18thEdition, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA.中。除非另有所指，任何常規介質或試劑均與活性組分相容，還考慮其在本發明藥物組合物中的用途。還可以將補充的活性組分併入組合物中。在本發明的另一方面中，提供了試劑盒，其包含(i)上文所述的試劑以及任選地
(ii)按照用於治療患者中慢性炎症狀態的方法使用所述試劑的說明書。進一步通過以下的非限制性實例來說明本發明。實施例I在膠原蛋白誘導的關節炎(CIA)模型中測試鼠IL-3的中和單克隆抗體(mAb)對疾病進程的影響，該模型是類風溼性關節炎最廣泛使用的鼠模型。在第O天和第21天，用在佐劑中的II型膠原蛋白經皮內免疫雄性DBA/1小鼠(8-12周齡，每組10隻小鼠)18。利用所建立的如下的評分系統評價小鼠四肢的紅腫並為每條腿分配臨床評分O -正常；I -輕微腫脹和/或紅斑；2 -大範圍腫脹和/或紅斑；3 -重度腫脹；4 -重度腫脹和/或僵直。根據所有四條腿總計的平均臨床評分表示關節炎的嚴重程度(每隻小鼠範圍為0-16)。
在第21、23、25、28 和 30 天時，用 250 μ g抗 IL_3mAb (Southern Biotech)/小鼠或PBS處理小鼠。如圖I所示，在抗IL-3處理的組中，疾病嚴重程度受到抑制。該實驗特別振奮人心，因為在該特定的實驗中，存在對非常嚴重的疾病的非常快速的誘導，在對照小鼠具有快速達到的平臺期。通常在大約一周後達到該平臺期。相對急性的鼠CIA的文獻數據表明，中和抗-IL_3Ab在疾病誘導之後被馬上需要，且如果在疾病發作後推遲給予是無效的19。這並不必然表示，IL-3不是炎症中的靶標。我們還不了解對驅動疾病如類風溼性關節炎(RA)負責的背景炎症/自身免疫事件，以及這些事件被多麼密切地映射在動物模型中。即使對於慢性狀態如RA，也有患「急性發作」疾病的患者。還有，抗IL-3療法可能在RA中仍是有利的，例如因為該疾病通常會復發，提供時機來抑制其惡化。還應當記住，常用的抗炎症糖皮質激素被廣泛認為通過在轉錄水平下調炎性介質基因表達來起作用——如果在引發刺激後添加，它們在替代炎症測定中在體外不起作用。實施例2
研究了 IL-3信號轉導作為促炎性細胞因子在CD14+單核細胞中的作用。從紅十字會捐贈者白細胞袋(Red Cross donor buffy pack)分離外周血單核細胞(PBMC)。然後通過陰性選擇(MACS分離)純化CD14+單核細胞，使得通過流式細胞術估計大約有80%的細胞為⑶14+。以每個6cm IWAKI (低貼壁)TC盤約I. 8x IO6細胞的密度接種單核細胞，並在RPMI+10%FCS 以及單獨的 IL-3(3ng/ml)、IL-3(3ng/ml)+IL-3-R抗體、單獨的 IL_3(0. 3ng/ml)、或IL-3(0. 3ng/ml)+IL-3-R抗體中培養7天。在每種情況下使用lug/ml的IL-3-R抗體。在第4天時，添加新的IL-3和IL-3-R抗體。在第7天時，取出細胞並計數，然後在RNA裂解緩衝液中裂解。結果表明，IL-3以劑量依賴的方式為單核細胞提供促存活刺激，並且該效應受到抗IL-3R抗體的抑制(圖2)。因此，阻斷或抑制CD14+單核細胞中的IL-3信號轉導阻止其在炎症位點的存活和積累，並且這樣提供了控制炎症的方法。實施例3蕁麻疹(Urticaria)，通常稱為蕁麻疹(hives)，是表現為復發的水皰的炎症狀態，所述水皰大小範圍從數釐米低至幾毫米。通常，水皰呈淡紅色具有蒼白色的中心，且伴有灼燒感或刺痛感。蕁麻疹可存在於任何年齡段，並且1%_5%的人群在其一生的某時間點會出現蕁麻疹。慢性蕁麻疹極大地影響生活質量，與重度特應性皮炎、牛皮鮮或痤瘡患者類似。大多數慢性蕁麻疹病例實際上是天生的；然而，然而正在變得越來越清楚的是，在很多病例(35%-50%)中，存在高親和力IgE受體(Fe ε Rl)或IgE自身的自體抗體，這表明慢性蕁麻疹可能是自身免疫病。肥大細胞和嗜鹼性粒細胞是蕁麻疹患者中表達Fe ε Rl並且響應自體抗體的主要細胞類型。當活化時，肥大細胞和嗜鹼性粒細胞釋放大量的組胺，組胺是驅動蕁麻疹水皰形成的主要效應器分子。肥大細胞和嗜鹼性粒細胞兩者都表達IL-3受體，並且當暴露於諸如IgE和C5a的觸發因素時，IL-3能夠引發這些細胞產生升高水平的效應器分子如組胺。分析了來自7個蕁麻疹患者樣品和4個正常供體樣品的PBMC。IL_3能夠活化離體的人嗜鹼性粒細胞(圖3)，並且中和抗IL-3Ra抗體(CSL360-參見國際專利公開號W02009/070844)能夠抑制IL-3誘導的人嗜鹼性粒細胞活化(圖4) JDCC優化的抗IL_3Ra抗體(CSL362-如國際專利公開號WO 2009/070844中所描述的人源化和親和力成熟的抗CD123mAbl68-26的無巖藻糖化變體)能夠以時間依賴的方式從PBMC消耗人嗜鹼性粒細胞(圖5)。在添加CSL362的24小時內，在三個獨立的供體中觀察到嗜鹼性粒細胞完全或近乎完全耗盡(圖6)。在添加CSL362的24小時內觀察到NK細胞活化，表明嗜鹼性粒細胞的耗儘是通過NK細胞介導的ADCC (圖7)。實施例4本實施例表明抗IL-3R抗體也能夠影響體內嗜鹼性粒細胞活化的數量和水平。用尾靜脈靜脈注射抗IL3Ra抗體1C2(參照實施例5)或對照小鼠IgG2a來處理雌性BALB/c小鼠(10-12周齡)。靶向⑶200R3的商購抗體Bal03顯示出特異性地消耗小鼠嗜鹼性粒細胞2°，並且平行測試其對照抗體大鼠IgG2b作為對照。所有抗體以200 μ I PBS中30 μ g進行注射，除了 1C2，其給予18 μ g。一天後，分離外周血和腹膜細胞，並製備單細胞懸浮液。細胞用抗Fe Y RII-III預孵育以防止非特異性結合。細胞用FITC偶聯的抗Fe ε RIa單克隆抗體和PE偶聯的抗⑶49b單克隆抗體染色以鑑定嗜鹼性粒細胞(Fe ε RI a +⑶49b+)。FITC-倉鼠IgG和PE-大鼠IgM分別用作Fe ε RI α和⑶49b抗體的同型對照。利用前向散射(FSC)對側向散射(SSC)控出碎片，並用7氨基放射菌素D(7-AAD)染色辨別死細胞。然 後用FACSCanto (BD Biosciences)分析染色的細胞，並利用Flowjo軟體分析數據。單次靜脈注射18 μ g抗IL3Ra抗體1C2誘導外周血中嗜鹼性粒細胞頻數顯著下降至同型對照(小鼠IgG2a)處理的小鼠水平的大約23%(圖8)。該消耗效力與30 μ g Bal03給藥的效力相當。與對嗜鹼性粒細胞的效應不同，在用抗IL3Ra或Bal03抗體處理的小鼠中沒有觀察到腹膜肥大細胞頻數的顯著下降(數據未顯示)。用Bal03抗體對肥大細胞的觀察結果與Obata及其同事的研究相一致2°。實施例5I)鼠IL3受體特異性單克隆抗體的產生從表現為與絲狀噬菌體M13表面的gill蛋白融合的Fab片段的人抗體序列文庫(Dyax Corp.)分離特異性識別鼠IL-3R a (mIL3Ra)的抗體序列。通過將噬菌體文庫與商購獲得的純化的重組融合蛋白孵育來分離抗mIL3Ra噬菌體展示的抗體片段，所述融合蛋白由相融合的mIL3Ra的胺基酸17-331和人IgGl (Fe片段)的殘基100-330以及由R&D systems Inc提供的短多肽連接物(序列IEGRID)組成。利用標準方法富集特異結合的噬菌體，並作為單克隆而分離。測試單克隆與原始靶標(mIL3Ra _ Fe融合)和mIL3Ra的胞外結構域的特異性結合，mIL3R α的胞外結構域表現為具有C末端六組氨酸標籤(msIL-3R-6His)的殘基1_331。選擇與這些靶標結合且不與對照蛋白結合的噬菌體克隆用於進一步分析。通過編碼抗體的多肽鏈的DNA測序鑑定獨特的克隆，並通過競爭性ELISA定量這些克隆對mIL-3R-6His的結合親和力。選擇具有可接受親和力的克隆用於再重組工程並表達為嵌合抗體(人可變區和鼠IgG2a/K恆定區)用於進一步的分析。2)用於瞬時表達的哺乳動物表達載體構建 利用標準分子生物學技術從噬菌粒載體PCR擴增mIL3R α特異性抗體的重鏈和輕鏈可變區。然後，將重鏈可變區克隆入哺乳動物表達載體pcDNA3. l(+)-mIgG2a，該載體基於pcDNA3. 1(+)表達載體(Invitrogen),其經修飾包括鼠IgG2a恆定區和終止密碼子。將輕鏈可變區克隆入表達載體pcDNA3. I (+) -m κ，該載體基於pcDNA3. I (+)表達載體，其經修飾包括鼠κ恆定區。表達載體還含有Kozak翻譯起始序列、ATG起始密碼子和合適的信號肽。3)細胞培養從Genechoice Inc獲得適應無血清懸浮的合適的293-T細胞。細胞在補充了青黴素/鏈黴素/兩性黴素B試劑(Invitrogen)的FreeStyle ExpressionMedium(Invitrogen)中培養。在轉染之前，將細胞在37° C下在潮溼的孵化器中維持，且大氣為8%C02。4)瞬時轉染利用293fectin轉染試劑(Invitrogen),按照生產商的說明書,進行利用293-T細 胞的抗mIL3Ra表達質粒的瞬時轉染。合併輕鏈和重鍊表達載體，並用293-T細胞共轉染。以IxlO6活細胞/ml的終濃度轉染細胞(1000ml)，並在37° C下，在2/10Wave Bioreactor系統 2/10 或20/50 (Wave Biotech/GE Healthcare)上，在大氣為 8%C02 的 Cellbag 2L (WaveBiotech/GE Healthcare)中孵育5天。培養條件為以8°的角度每分鐘轉35轉。在轉染後4小時,添加Fluronic. F-68 (Invitrogen)至O. 1%ν/ν的終濃度。轉染後24小時，為細胞培養物補充胰蛋白腖NI (Organotechnie, France)至O. 5%v/v的終濃度。通過在2500rpm下離心來收集細胞培養物上清，然後在純化之前使上清通過O. 45 μ M過濾器(Nalgene)。5)蛋白表達分析5天後，將20 μ I培養物上清在4-20%Tris_甘氨酸SDS聚丙烯醯胺凝膠上電泳，並通過考馬斯亮藍試劑染色來顯現抗體。6)抗體純化在4° C下，利用蛋白A親和層析純化抗mIL3Ra抗體，其中將MabSelect樹脂(5ml, GE Healthcare, UK)裝入 30ml Poly-Prep 空柱(Bio-Rad, CA)。首先用 10 柱體積的無熱原GIBCO蒸懼水(Invitrogen, CA)洗漆樹脂，以去除存留的甲醇，然後用5柱體積的無熱原磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(GIBC0 PBS, Invitrogen, CA)平衡。通過重力供給將經過濾的條件細胞培養物培養基(IL)加載於樹脂上。然後，用5柱體積的無熱原PBS洗滌樹脂，以去除非特異性蛋白。用2柱體積的O. IM甘氨酸(pH 2.8) (Sigma, MO)將結合抗體洗脫入含有O. 2柱體積的2M Tris-HCKpH 8. O) (Sigma, MO)的級分，以中和低pH。在4° C下，將洗脫的抗體在截留MW為3. 5kD的12ml Slide-A-Lyzer盒(Pierce, IL)中相對5L PBS透析18小時。利用Ultraspec 3000 (GE Healthcare, UK)分光光度計，通過測量280nm處的吸光度來確定抗體濃度。通過SDS-PAGE分析抗體的純度,將處於還原樣品緩衝液(Invitrogen, CA)中的2μ g蛋白加載至Novex 10_20%Tris甘氨酸凝膠(Invitrogen, CA),按照生產商的說明書，在具有 Tris 甘氨酸 SDS 電泳緩衝液的 XCell SureLock Mini-Cell (Invitrogen, CA)中施加150V的恆定電壓持續90分鐘，然後利用考馬斯染色顯現。參考文獻I. 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權利要求
1.治療患者中慢性炎症狀態的方法，其包括給予所述患者阻斷或抑制所述患者中IL-3信號轉導事件的試劑。
2.如權利要求I所述的方法，其中所述試劑阻斷或抑制所述患者中IL-3/IL-3R或IL-3/IL-3RQ的相互作用。
3.如權利要求I或2所述的方法，其中所述試劑是與IL-3、或IL-3R、IL_3Ra、或IL-3Ri3選擇性結合的抗原結合分子。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述抗原結合分子是單克隆抗體、或其抗原結合片段和/或包含可變結構域的片段。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述抗原結合分子是與IL-3選擇性結合的單克隆抗體。
6.如權利要求4所述的方法，其中所述抗原結合分子是與IL_3Ra選擇性結合的單克隆抗體。
7.如權利要求I所述的方法，其中所述試劑包含抗細胞部分。
8.如權利要求7所述的方法，其中所述抗細胞部分是選自以下的放射性同位素a-放射體，尤其是211砹；β -放射體，尤其是131碘；以及俄歇放射體。
9.如權利要求I或2所述的方法，其中所述試劑是結合IL-3R但不會導致IL-3信號活化的IL-3突變蛋白。
10.如權利要求I或2所述的方法，其中所述試劑是能與IL-3結合的可溶性受體。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述試劑是IL-3Ra的胞外部分，或包含相融合的IL-3Ra胞外部分與IL_3Ri3胞外部分的融合多肽。
12.如權利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述慢性炎症狀態是關節炎，尤其是炎性關節炎。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述慢性炎症狀態是類風溼性關節炎(RA)。
14.如權利要求1-13中任一項所述的方法，其中所述患者是人。
15.阻斷或抑制IL-3信號轉導事件的試劑在治療患者的慢性炎症狀態中的用途，或在製備用於治療患者的慢性炎症狀態的藥物中的用途。
16.如權利要求15所述的用途，其中所述試劑阻斷或抑制所述患者中IL-3/IL-3R或IL-3/IL-3Ra的相互作用。
17.如權利要求15或16所述的用途，其中所述試劑是與IL-3、或IL-3R、IL_3Ra、或IL-3Ri3選擇性結合的抗原結合分子。
18.如權利要求17所述的用途，其中所述抗原結合分子是單克隆抗體、或其抗原結合片段和/或包含可變結構域的片段。
19.如權利要求18所述的用途，其中所述抗原結合分子是與IL-3選擇性結合的單克隆抗體。
20.如權利要求18所述的用途，其中所述抗原結合分子是與IL-3Ra選擇性結合的單克隆抗體。
21.如權利要求15所述的用途，其中所述試劑包含抗細胞部分。
22.如權利要求21所述的用途，其中所述抗細胞部分是選自以下的放射性同位素a -放射體，尤其是211砹；β -放射體，尤其是131碘；以及俄歇放射體。
23.如權利要求15或16所述的用途，其中所述試劑是結合IL-3R但不會導致IL-3信號活化的IL-3突變蛋白。
24.如權利要求15或16所述的用途，其中所述試劑是能與IL-3結合的可溶性受體。
25.如權利要求24所述的用途，其中所述試劑是IL-3Ra的胞外部分，或包含相融合的IL-3Ra胞外部分與IL_3Ri3胞外部分的融合多肽。
26.用於治療患者中慢性炎症狀態的試劑，其中所述試劑阻斷或抑制所述患者中的IL-3信號轉導事件。
27.如權利要求26所述的試劑，其中所述試劑阻斷或抑制所述患者中IL-3/IL-3R或IL-3/IL-3Ra的相互作用。
28.如權利要求26或27所述的試劑，其中所述試劑是與IL-3、或IL-3R、IL_3Ra、或IL-3Ri3選擇性結合的抗原結合分子。
29.如權利要求28所述的試劑，其中所述抗原結合分子是單克隆抗體、或其抗原結合片段和/或包含可變結構域的片段。
30.如權利要求29所述的試劑，其中所述抗原結合分子是與IL-3選擇性結合的單克隆抗體。
31.如權利要求29所述的試劑，其中所述抗原結合分子是與IL-3Ra選擇性結合的單克隆抗體。
32.如權利要求26所述的試劑，其中所述試劑包含抗細胞部分。
33.如權利要求32所述的試劑，其中所述抗細胞部分是選自以下的放射性同位素a -放射體，尤其是211砹；β -放射體，尤其是131碘；以及俄歇放射體。
34.如權利要求26或27所述的試劑，其中所述試劑是結合IL-3R但不會導致IL-3信號活化的IL-3突變蛋白。
35.如權利要求26或27所述的試劑，其中所述試劑是能與IL-3結合的可溶性受體。
36.如權利要求35所述的試劑，其中所述試劑是IL-3Ra的胞外部分，或包含相融合的IL-3Ra胞外部分與IL_3Ri3胞外部分的融合多肽。
37.藥物組合物，其包含權利要求26-36中任一項所述的試劑以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑和/或稀釋劑。
38.試劑盒，其包含⑴權利要求26-36中任一項所述的試劑，以及任選地(ii)按照用於治療患者中慢性炎症狀態的方法使用所述試劑的說明書。
全文摘要
治療患者中慢性炎症狀態的方法，其包括給予所述患者阻斷或抑制所述患者中IL-3信號轉導事件的試劑。
文檔編號A61K51/10GK102821815SQ201080064317
公開日2012年12月12日 申請日期2010年2月18日 優先權日2010年2月18日
發明者基諾·路易吉·瓦伊洛, 約翰·艾倫·漢密爾頓, 安德魯·大衛·庫克 申請人:Csl有限公司, 墨爾本大學