具有移動容器且以連續方式生產培養物的連續培養裝置的製作方法

2023-11-02 11:13:17 2

專利名稱：具有移動容器且以連續方式生產培養物的連續培養裝置的製作方法
具有移動容器且以連續方式生產培養物的連續培養裝置 發明領域
所述發明提供了允許在液體或半固體培養基中選擇具有高生殖率 和特殊代謝性質的活細胞的方法和設備。對於選擇過程(適應進化)，遺 傳變異生物(突變體)在群體中產生，並與相同起源的其它變體竟爭。具 有最快生殖率的那些隨時間過去相對比例增加，導致產生具有增加的生 殖率的群體(和個別生物)。該過程可以提高用於工業過程或學術目的的 生物的性能。本發明利用連續培養裝置來實現活細胞(例如，原核生物、
古細菌(Archaea)、病毒、真核生物、真菌、藻類、酵母、植物細胞、動 物細胞或幹細胞)的可行生產。本發明可以用於生產由活細胞生成的活性 成分或生物製品。所述活性成分或生物製品又可以用作診斷劑、預防劑 或治療劑。
背景技術：
對增加的生殖率(適合度)的選擇需要持續的生長，後者通過生長培 養物的定期稀釋來實現。在現有技術中，這已經通過三條途徑來實現 固體培養，系列稀釋和連續培養，它們的主要差別在於稀釋程度。
固體培養包含將小體積的生長培養物或細胞從培養皿重複轉移至 裝有新鮮生長培養基的容器中。系列稀釋包含將小體積的生長培養物重 復轉移至裝有新鮮生長培養基的大的多的容器中。當培養的細胞已經在 新容器中生長至々包和時，重複該過程。在文獻(Lenski & Travisano: Dynamics of adaptation and diversification: a lO，OOO-genemtion experiment with bacterial populations. 1994. Proc Natl Acad Sci U S A. 15: 6808-14) 中，該方法已經用於實現持續培養的最長示範，在清楚地證實了生殖率 在數年時間段中一致提高的實驗中。該過程通常手工進行，相當費勞動 力，且通過暴露於外部環境而被汙染。如下段所述，系列培養也是低效 率的。
Genetical Theory of Natural Selection. 1930. Oxford University Press, London, UK)。此外，在類似於群體大小快速波動的系列轉移情況下，選擇與群體的調和平均數(&)成比例(Wright: Size of population and breeding structure in relation to evolution. 1938. Science 87: 430-431),且 因此可以通過循環過程中的最低群體估計出來。
通過連續培養可以維持群體大小，且因此使選擇更高效。不同於系 列稀釋的連續培養包含相對更小的體積，從而用等體積的新鮮生長培養 基定期替換小部分生長培養物。通過在循環稀釋過程中使它的最小大小 增加，該過程使有效的群體大小最大化。允許連續培養的設備稱作"恆 化器"(如果稀釋在指定的時間間隔發生)和"恆濁器"(如果當培養物生 長至特定密度時自動發生稀釋)。
為了簡單，兩類設備在下文中將歸入術語"恆化器"組。恆化器由2 個組在二十世紀五十年代同時發明(Novick & Szilard: Description of the chemostat. 1950. Science 112: 715-716)和(Monod: La technique de la culture continue - Th6orie et applications. 1950. Ann. Inst. Pasteur 79: 390-410)。恆化器已經用於證實生殖率的短時間段快速提高(Dykhuizen DE. Chemostats used for studying natural selection and adaptive evolution. 1993. Methods Enzymol. 224: 613-31)。
由於耐稀釋的(靜止的)變體的非計劃中的選擇，傳統的恆化器不能 維持長時間段選擇高生殖率。這些變體能通過貼壁到恆化器表面上來耐 受稀釋，且通過這樣做，竟爭過(outcompete)較低粘性的個體，包括具 有更高生殖率的那些，從而消除了設備的預期目的(Chao&Ramsdell: The effects of wall populations on coexistence of bacteria in the liquid phase of chemostat cultures,. 1985. J. Gen. Microbiol. 131: 1229-36)。
已經發明了一種方法和恆化設備(the Genetic Engine)來避免連續 培養物的稀釋抗性(PASTEUR INSTITUT [FR] & MUTZEL RUPERT [DE] 提交的專利US 6,686,194-B1)。該方法使用閥控制的流體轉移來在2個 恆化器之間定期移動生長培養物，從而允許每個在活性培養生長時間段 之間滅菌和沖洗。定期滅菌循環通過破壞耐稀釋變體來預防它們的選 擇。該方法和設備實現了該目的，但是需要在無菌(密封)環境中對幾種 流體進行獨立的複雜操作，包括一種(NaOH),它是極腐蝕性的和潛在極 反應性的，迅速破壞閥，並產生汙染和廢物處理問題。恆化設備也是有 限制的，因為沒有採取措施來提供細胞生長的支持物。諸如Genetic Engine的設備和其它已知的技術不允許連續培養非懸浮生長的和/或作為粘附細胞生長的細胞。
存在一些類型的難以大量培養的細胞，這是由於細胞存活和生長所
對於真核生物(例如，藻類、酵母、真菌、植物細胞、動物細胞和幹細胞) 情況是這樣。
例如，通常如下培養人胚胎幹細胞分離幹細胞群並將其轉移進裝 有稱作培養基的營養肉湯的實驗室用塑料培養皿。細胞在培養皿表面分
的小鼠胚胎皮膚細胞。該細胞塗布層稱作飼養層。在培養皿底部具有飼 養層的原因是，給人胚胎幹細胞提供它們可以附著的粘性表面。同樣， 詞養細胞向培養基中釋放營養物。最近，科學家已經開始設計不使用小 鼠詞養細胞的培養胚胎幹細胞的方式。這是重大的科學進步，因為它避 免了小鼠細胞中的病毒或其它大分子可能傳遞給人細胞的危險。
在幾天的過程中，內細胞群的細胞增殖，並開始擠滿培養皿。當這 發生時，將它們輕輕取出，並鋪平板進幾個新鮮的培養皿中。重複重新 鋪平板(replate)細胞的過程多次和多個月，且這稱作傳代培養。傳代培 養細胞的每個周期稱作傳代。6個月或更久以後，細胞群的原始細胞產 生數百萬個胚胎幹細胞。已經未分化地在細胞培養物中增殖6個月或更 多個月、是多潛能性的、且遺傳上表現正常的胚胎幹細胞，稱作胚胎幹 細胞系。
一旦確立了細胞系，或甚至在該階段之前，就可以將它們分批冷凍， 並運輸到其它實驗室，用於其它培養和試驗。但是，連續培養提供了抑 制最大量的對活細胞加壓和產生潛在汙染源的操作的優點。當開始培養 時，連續培養條件允許技術人員利用細胞的連續生產。 一旦生成幹細胞， 就可以不間斷地繼續生產幹細胞，以生成比現在一般使用的方法多得多 的幹細月包。

發明內容
因此，本發明的目的是，提供用於不受耐稀釋變體千擾地連續培養 細胞(包括原核生物、細菌、古細菌、真核生物和病毒)的改良的(且完 全獨立的)方法和設備。象其它恆化器一樣，該設備提供用新鮮生長培養 基定期稀釋生長培養物的工具，'用於在培養物和外部環境之間進行氣體交換、無菌和作為恆化器或恆濁器自動操作的工具。
另外，本發明的目的是，提供用於連續培養細胞的改良的且獨特的 方法和設備，所述細胞不懸浮生長和/或作為粘附細胞生長，例如真核生 物(例如，植物細胞、藻類、真菌、酵母、動物細胞或幹細胞)和某些原 核生物(例如，鏈黴菌)和可能某些古細菌和病毒。可以利用本發明培養 的幹細胞包括、但不限於胚胎幹細胞、月臺兒幹細胞、臍帶幹細胞、月臺盤 衍生的幹細胞和成年幹細胞。可以利用本發明培養的成年幹細胞包括、 但不限於造血幹細胞、骨髓幹細胞、基質細胞、星形膠質細胞和少突膠
質糹田月包G列嘖口， Hematopoietic Stem Cell Protocols by C. Klug和C. Jordan, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2002, I入本文作為參考)。
本發明被設計用於沒有任何流體轉移(包括滅菌和沖洗功能)地實 現這些目的。這在下述範圍內代表著本發明相對於現有技術的具體優 點它避免了與滅菌和沖洗有關的危害和困難，包括含有腐蝕性溶劑的 容器(containment)和複雜流體的轉移、汙染和由於培養物從一個容器 向另一個容器轉移引起的生長紊亂。
在充滿了生長培養基的柔性無菌管內實現連續培養。培養基和室表 面彼此靜止，且通過使管道系統(tubing)蠕動穿過"門"或由防止培養的細 胞在管區域之間移動的夾子無菌地細分管的點，定期且同時替換二者。 為了進一步的安全，也可以(任選地)在培養容器的上遊和下遊添加紫 外線(UV)門。
本方法和設備也是在下述範圍內優於現有技術的改進它們連續 地、而不是定期地選擇克服耐稀釋變體對恆化器表面的貼壁，因為替換 受影響的表面隨著稀釋過程串聯發生。同樣對於懸浮培養的細胞和作為 粘附細胞生長的細胞，管道系統提供生長的連續支持物，其優點是不通 過將細胞從一個容器向另一個容器轉移而幹擾細胞。
以瞬時方式細分管，從而使得存在含有飽和的(充分生長的)培養物 的區域、含有新鮮培養基的區域和這二者之間的區域，其中存在一個或 多個稱作生長室或培養室的室，以形成生長室區域，生長培養物與新鮮 培養基在其中混合，以實現稀釋。門定期從管上的一個點釋放，並在另 一個點替換，以便通過從生長室分離去除生長培養物以及它結合的生長 室表面和附著的靜止細胞，並用新鮮培養基和新鮮的室表面替換。附圖簡述
非窮盡地和非限制性地， 一個可能的普通構型將包括下文所述的幾 個組分。在下文中，在優選實施方案的基礎上示例性地解釋本發明，因
此參考附圖，其中


圖1顯示了設備的可能的構型的全景，其中
(1) 代表含有設備的不同區域的柔性管道系統，所述區域是上遊 新鮮培養基(7)、生長室(IO)、取樣室(11)和處置的生長培養區域(15)
(2) 代表允許根據用戶確定的條件調節溫度的恆溫可控箱，且在其 中可以放置
a. 所述生長室(IO),
b. 所述取樣室(ll),
c. 限定所述生長室(10)的開始的上遊門(3),
d. 限定所述生長室(10)的結束和所述取樣室(11)的開始的下遊門
(4),
e. 限定所述取樣室(11)的結束的第二個下遊門(5),
f. 允許用戶或自動控制系統監控生長培養物的光密度和操作反饋 控制系統(13)的濁度計(6)，從而在培養物密度(恆濁器功能)基礎上控制 管道系統(l)的運動，
g. —個或幾個攪拌器(9)。
應當指出，在a-g中列出的設備元件也可以位於恆溫可控箱的外 面，或沒有恆溫可控箱。
(7) 代表未使用的柔性管道系統中的新鮮培養基，
(8) 代表裝載有新鮮培養基填滿的管道系統的桶(barrel)，以在操 作過程中分配所述新鮮培養基和管道系統。
(12) 代表任選的紫外輻射門，
(13) 代表控制系統，它可以由與不同的監控或操作界面通訊的工具 相聯的計算機組成，所述工具如光密度濁度計、溫度測量和調節設備、 攪拌器和傾斜馬達等，它們允許操作的自動化和控制，
(14) 代表任選的處置桶，它上面巻撓著裝有處置的生長培養物填滿 的管道系統的管道系統，
(15) 代表位於所述取樣室下遊的處置的生長培養物。
圖2顯示了設備的兩種可能的位置，它們例示了下述事實，即所述恆溫可控箱(2)和與所述培養室有關的所述設備的其它部件可以傾斜至 不同的角度，這是為了攪拌目的、氣體循環和去除目的、和保證去除可 能通過沉降到底部而避免稀釋的顆粒化的(聚集的)細胞的目的。在細胞 的生長不需要攪拌的情況下，所述設備也可以位於相同位置(例如，平坦 位置或有一定角度)。圖3-9代表位於所述恆溫可控箱(2)中適當位置且通過門(3) 、 (4) 和(5)傳入的所述柔性管(l),在所有過程步驟中所述管都通過這些門 停留，且所述管將根據它的蠕動運動通過這些門。圖3代表設備狀態T0，其中在注射預期用於連續培養的細胞之前， 所述柔性管的所有區域都裝滿新鮮培養基。圖4代表在剛注射細胞林後所述柔性管的狀態Tl。圖5代表設備狀態T2，它是生長時間段，在這期間，培養物在定義 為所述門(3)和(4)卩艮定的生長室(10)的區域中生長。圖6代表在管和相關的培養基的第一次蠕動剛發生後的設備狀態 T3,它決定了第二個生長周期的開始，通過門3的運動導入新鮮管和培 養基，同時通過門4的運動將等體積的管、培養基和生長培養物轉移出 生長室區域(10)和進入取樣室區域(11)。關鍵是認識到，管、在管內的培 養基和已經在所述培養基中生長的任意培養物都一起運動。流體轉移僅 通過生長室區域內的攪拌在新鮮培養基和生長培養物混合物 一起的範 圍內發生。圖7代表設備狀態T4，它是第二個生長周期；在這個周期過程中， 在管蠕動後保留在生長室中的細胞現在可以利用與在該步驟過程中的 剩餘培養物相混合的新鮮培養基提供的營養物生長。圖8代表在管和包含的培養基的第二次蠕動剛發生後的設備狀態 T5,它決定了第三個生長周期的開始，通過門3的運動導入新鮮管和培 養基，同時通過門4的運動將等體積的管、培養基和生長培養物轉移出 生長室區域(10)和進入取樣室區域(11)。圖9代表設備狀態T6，它是第三個生長周期；該步驟等價於狀態 T4,並指示其它操作的重複性質。使用注射器或其它可回收裝置，可以 在任意時間從取樣室區域(11 )取出選擇的細胞的樣品。圖10顯示了決定構型中的門的牙的可能的概況，它由擠捏柔性管 的2個堆疊牙組成。門也可以由擠壓可移動帶的單個牙、可去除的夾子或阻止細胞穿過門的運動的其它機制決定，且其可以沿著管在可變的位 置交替放置和取下。發明詳述在圖3 -9中描述了設備的基本操作。在圖1中顯示了本設備的一種可能的構型，正如其在已經裝載無菌培養基的新鮮管後出現的(顯示為由所述門(3)、 (4)和(5)分成區域A-H)。 通過注射(圖4,區域B)將細胞導入生長室(圖3),可以給設備接種 選擇的細胞。然後允許培養物生長至需要的密度，並可開始連續培養(圖 5)。通過管的門控區域的重複運動，進行連續培養。這包含門、管、培 養基、和管內的任意培養物的同時運動。管總是以相同方向運動；含有 新鮮培養基的未使用的管(且在下文中稱作在生長室(7)的"上遊")將移動 進生長室，並與其中剩餘的培養物相混合，從而為其中含有的細胞的進 一步生長提供基質。在導入生長室區域之前，通過經上遊門(3)與生長室 分開，將該培養基和它有關的管維持在無菌條件下。含有生長培養物的 用過的管同時"向下遊"運動，且經下遊門(4)與生長室分開。當存在一個或多個生長室時，生長室可以用於相同或不同的目的。 例如，活細胞可以在具有相同或不同條件的第一個生長室和第二個生長 室中生長。在一個實施方案中，第一個生長室可以用於生長細胞，且第 二個生長室則可以用於在不同條件下處理活細胞。例如，可以處理細胞， 以誘導所需產物的表達。在培養開始之前或之後，可以加入培養基自身 的組分或添加劑。例如，所有組分或添加劑都可以在培養開始之前包含 在培養基中，或可以在已經開始培養之後，將組分注射進一個或多個生 長室。門構型不是本專利申請的特殊點。例如，在給定的構型中，門可以 設計成穿過同時運動的多個牙的一條鏈，或在另一個構型中，如圖l所 示在不同的同步鏈中分開。門可以由以如圖10所示的堆疊方式擠捏管 的2個牙製成的系統組成，從而通過牙之間的接觸面的精確，避免管的 G和H區域之間的汙染。在另一個構型中，可以如下得到無菌門將一 個牙壓靠到管的一側，且由此將管緊密壓靠到固定的底盤上，管在它的 蠕動過程中沿著該底盤滑動，如圖3至9標記3、 4和5所示意的。在另一個構型中，使用下述機制來移動管，其中夾子繞著關於該設備的固 定軸旋轉。通過已知的方式得到所述恆溫可控箱(2 ),例如與加熱和冷卻設備偶 聯的溫度計。當培養的細胞的生長或實驗設計需要通氣(氣體交換)時，通過使用 透氣管來直接實現，且不使用機械輔助。例如且非限制性地，可以用矽 氧烷製成柔性透氣管。通氣可以通過與環境氣氛交換或通過與接觸生長 室或整個恆化器的人工確定的氣氛(液體或氣體)交換來實現。當實驗要 求厭氧生活時，柔性管可以是不透氣的。例如且非限制性地，柔性不透 氣管可以由塗布的或處理過的矽氧烷製成。對於厭氧進化條件，也可以將管的區域限制在特定的且受控的氣氛區域內，以控制氣體交換動力學。這可以如下實現通過使所述恆溫可 控箱不透氣，且然後向其中注射中性氣體，或通過將整個設備置於氣氛 可控的室內。通過與生長培養基一起替換生長室表面，實現靜止變體的反選擇。 另外將設備設計成可以以關於重力的多個方向運行，也就是說，如 圖2所示傾斜，範圍最高達360。。如果聚集的細胞可以落入上遊並從而避免從室去除，則耐稀釋變體 可以通過彼此粘連而不是粘到室壁上來避免稀釋。因此，希望管通常向 下傾斜，從而使得聚集的細胞將落向在管移動周期過程中將從生長室取 出的區域。該構型包含使設備傾斜，從而使得下遊門就重力而言低於上 遊門。根據實驗人員選擇的條件，可以使生長室減壓或過壓。可以使用不 同的調節壓力的方式，例如通過它的上遊末端和穿過生長室給新鮮培養 基和管應用真空或壓縮空氣；通過交替擠捏和鎖定在生長室上遊或內部 的管，可以實現另一種使管減壓或過壓的方式。當在透氣管中含有培養基時，可以在培養基內形成氣泡。它們將上 升到管密封區域的頂部，且在那裡被捕獲，直到該區域(和限定它的門) 的運動將該區域釋放進生長室、取樣室或恆化器的終點(圖6，分別是區 域D-C、 B或A)。如果設備向下傾斜，這些氣泡將積聚在生長室或取樣 室中，並取代培養物。將設備設計成對於管運動周期定期向上傾斜，從 而允許積累的氣體從所述室去除。設備的傾斜運動和/或外部設備(9)對生長室的搖動，可以用於降低 生長室內細胞的聚集。或者，可以在滅菌之前在裝滿新鮮培養基的管中 包含一個或幾個攪拌棒，且在培養操作過程中磁力攪拌。在細胞生長不 需要攪拌的情況下，機器可保持在相同位置。上遊門限定的新鮮培養基區域與培養室長度的成比例的長度，將限 定在周期過程中達到的稀釋程度。可以通過定時來確定稀釋的頻率(例如，恆化器功能)。例如，可以 在有限的時間範圍收穫幹細胞，從而在細胞開始分化之前收集幹細胞。 或者，可以用反饋調節來確定稀釋的頻率，由此通過濁度計(圖1-標記6)測量生長室中培養物的密度，且當濁度達到閾值時，發生稀釋循環(恆 濁器功能)。管可以是透明的或半透明的，以測量濁度。取樣室允許取出生長培養物，以分析實驗結果、收集具有提高的生 長速率的細胞用於進一步培養、保藏或功能執行或其它目的，例如計數 群體、檢查培養基的化學組成、或測試生長培養物的pH、或大量生產 細月包(例如，真核生物例如幹細力包、原核生物、古細菌和病毒)。為了實 現生長室內pH的持久監控，管可以通過構建包含嵌入/結殼在管壁中的 pH指示線。任意形式的液體或半固體材料都可以用作本設備中的生長培養基。 利用半固體生長基質的能力是勝過現有技術的顯著進步。可以由用戶選 擇和限定生長培養基，後者將限定通過選擇過程提高的代謝過程。如果需要，該設備可以含有多個生長室，從而使得一個生長室的下 遊門變成另一個的上遊門。例如，這將允許一種細胞在第一室中單獨生 長，且然後用作第二室中第二種細胞(或病毒)的營養源。本發明可以用於生產製劑，例如用於藥物、疫苗或抗毒素的生物制 品，其從本發明培養的細胞或它們的產物合成。所述生物製品可以用作 診斷、預防或治療劑。例如，本發明可以用於生產治療性蛋白，例如胰 島素。在優選的實施方案中，所述設備和/或方法可以以一定方式循環，以 連續收集處於它們的未分化狀態的幹細胞。此外，可以修飾培養條件， 以抑制幹細胞的分化。例如，可以向培養基中加入幹細胞分化抑制劑(例如，醛脫氫酶的抑制劑、磷酸肌醇3-激酶的抑制劑、TGF受體激酶抑制 劑、TGF-B受體激酶抑制劑等)。或者，可以升高或降低過程條件，例如遞送給培養基的氧的量，以提高某些幹細胞的生長和/或減慢或提高幹細 胞的分化。由於有些細胞的生長需要基質，可以向容器培養室中加入物理支持 物或結構。在優選的實施方案中，可以在管內加入連續支持物，如由薄 連續纖維樣支持物結構構成的連續纖維床，可以加入容器培養室中，其 允許細胞三維地生長。例如，所述支持物可以是纖維床，其提供細胞生 長的支持物，所述細胞例如幹細胞、植物細胞和其它類型的偏好這種支 持物結構的細胞，或不可以懸浮生長，或作為粘附細胞生長，且在有些 特定的條件或條件變化中，以進行靶突變的天然選擇。在優選的實施方案中，在本文引入作為參考的Huang等人, Continuous Production of butanol by Clostridium acetobutylicum immobilized in a fibrous bed reactor, Appl Biochem Biotechnol. 2004 Spring; 113-116: 887-98中所述的纖維狀材料。也可以改變管的結構和 大小，以無需將支持物結構摻入可移動的容器培養室。在優選的實施方 案中，使用具有更小直徑的管，從而細胞可以以更天然的方式貼壁，或 將管用作天然支持物，無需有些粘附細胞的貼壁。該設備和方法允許研究人員和產物開發人員通過持續生長(連續培 養)進化出可懸浮培養的活細胞的任意林或在管壁上或在支持物上生長 的不可懸浮培養的活細胞的任意抹，所述支持物可以是管中的纖維床； 得到的改進的細胞可以構成新林或物種。通過培養過程中獲得的突變， 可以鑑別這些新細胞，且這些突變可以允許新細胞與它們的祖先基因型 特徵區分開。該設備和方法允許研究人員通過下述選擇任意活細胞的新 抹通過天然選擇過程，分離具有提高的生殖率的個體。本發明也提供 了改進的和完全不同的方法和設備，其用於連續培養細胞，例如真核生 物，(例如，酵母、真菌、植物細胞、藻類、動物細胞或幹細胞)、原核 生物、古細菌和病毒。在另一個實施方案中，可以用發射體持久地或暫時地使細胞遭受至 少一個輻射波、光波、x射線、聲波、電磁場、放射性場、放射性介質 或它們的組合。下面的出版物引入作為參考Biofizika. 2005 Jul-Aug, 50(4): 689-92; Bioelect畫agnetics. 2005 Sep, 26(6): 431-9; Chem Commun (Camb). 2005 Jan 14, (2): 174-6; Biophvs J. 2005 Feb, 88(2): 1496-9; Bioelect譲agnetics. 1981, 2(3): 285-9; Sb Lek. 1998, 99(4):455-64; Antimicrob Agents Chemother. 2004 Dec, 48(12): 4662-4; J Food Prot. 2003 Sep, 66(9): 1712-5; Astrobiologv. 2006 Apr, 6(2): 332-47; Life Sci Space Res. 1970， 8: 33-8; Adv Space Res. 1995 Mar, 15(3): 211-4; Radiat Res. 2006 May, 165(5): 532-7; Mutagenesis. 2004 Sep, 19(5): 349-54; 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權利要求
1.用於以連續方式培養活細胞的設備，其包含裝有培養基的柔性管和表面，活細胞在其中可以懸浮生長或不懸浮生長，粘附或不粘附，其中所述管是透明的或半透明的，以測量濁度；和夾子系統，各自能處於打開和關閉位置，夾子這樣放置從而使得能將管分成i)裝有未使用的培養基的上遊區域；ii)裝有用過的培養基的下遊區域；和iii)置於所述上遊和下遊區域之間的用於培養所述細胞的生長室區域；其中所述夾子系統被構造和排列以打開和關閉，以便打開在管的上遊和下遊區域之間的管的生長室區域的夾子和限定在管的上遊和下遊區域之間的管的生長室區域，且周期性地重新限定管的生長室區域，從而使得以前限定的生長室區域的第一部分變成管下遊區域的部分，且以前限定的管的上遊區域的部分變成管的生長室區域的部分。
2. 根據權利要求1的設備，其中所述夾子系統被構造和排列，從而 當所述夾子處於關閉位置時，每個夾子不相對於管運動。
3. 根據權利要求1或2的設備，其中所述表面是管的內表面。
4. 根據權利要求3的設備，其中所述表面是插入管內的連續支持物。
5. 根據權利要求4的設備，其中所述表面是連續纖維。
6. 根據權利要求l-5之一的設備，其中所迷管是透氣的。
7. 根據權利要求l-5之一的設備，其中所述管是不透氣的。
8. 根據權利要求l-7之一的設備，其中所迷管包含矽氧烷或任意柔 性材料。
9. 根據權利要求l-8之一的設備，其中所述設備另外包含壓力調節 器，所述調節器被構建以改變管的生長室部分相對應環境壓力的壓力。
10. 根據權利要求l-9之一的設備，其中所述管包含pH指示劑。
11. 根據權利要求l-10之一的設備，另外包含溫度調節器，所述調 節器被構建以允許控制管的生長室區域的溫度。
12. 根據權利要求1-11之一的設備，其中所述設備另外包含攪拌器，所述攪拌器被構建以允許攪拌管的生長室部分。
13. 根據權利要求12的設備，其中所述攪拌器包含至少一個攪拌棒。
14. 根據權利要求l-13之一的設備，另外包含發射體，所述發射體 被構建以使生長培養室區域遭受下述的至少一個輻射波、光波、x射 線、聲波、電磁場和放射性場。
15. 根據權利要求l-14之一的設備，另外包含使生長室區域遭受不 同重力的工具。
16. 根據權利要求l-15之一的設備，其中所述生長室區域包含一個或多個裝有培養基的生長室。
17. 根據權利要求l-16之一的設備，另外包含用於測量管內的濁度的濁度計。
18. 根據權利要求1-17的設備，其中每個夾子可繞著關於所述設備 的固定軸旋轉移動，從而能移動管。
19. 根據權利要求1-18之一的設備，另外包含在管組合物或襯裡中 的pH指示劑，以允許測量培養基的pH。
20. 根據權利要求l-19之一的設備，另外包含傾斜裝置，以使生長 室管向下傾斜以去除聚集的細胞，或向上傾斜以去除空氣。
21. 根據權利要求l-20之一的設備，其中所述設備允許連續培養細 胞，其中所述細胞是真核生物、原核生物、古細菌和病毒，其中所述細 胞不在培養基中懸浮生長，或不在管中懸浮生長。
22. 根據權利要求1-21之一的設備，其中所述設備允許連續培養細 胞，其中所述細胞是真核生物、原核生物、古細菌和病毒，且其中所述 細胞作為粘附細胞生長。
23. —種以連續方式培養細胞的方法，其包含a)提供柔性的、透明的或半透明的裝有培養基的管和表面，其中活 細胞可以在所述管中生長，和夾子系統，每個夾子能處於打開和關閉位 置，夾子這樣放置從而使得能將管分成i) 裝有未使用的培養基的上遊區域；ii) 裝有用過的培養基的下遊區域；和iii) 置於所述上遊和下遊區域之間的用於培養所述細胞的生長室區域；b)用濁度計或測量濁度的其它裝置測量管內的濁度；C)關閉選擇的管上的夾子，以限定在管的上遊和下遊區域之間的管生長室區域，和將活細胞引入生長室區域；d) 監控管內的濁度，直到得到培養物的有關的需要的生長；e) 周期性地關閉和打開所選夾子，以重新限定管的生長室區域，從 而使得以前限定的生長室區域的第一部分變成管下遊區域的部分，且以 前限定的管的上遊區域的部分變成管的生長室區域的部分；和f) 重複步驟e),直到已經培養足夠量的細胞。
24. 根據權利要求23的方法，其包含從下遊區域的所述培養基取出 一些活細胞的額外步驟。
25. 根據權利要求23或24的方法，另外包含從下遊區域分離所述 活細月包。
26. 根據權利要求23-25之一的方法，其中所述活細胞選自藻類、 真菌、酵母細胞、動物細胞、植物細胞和幹細胞。
27. 根據權利要求26的方法，其中所述活細胞是幹細胞。
28. 根據權利要求27的方法，其中所述活細胞選自造血幹細胞、 骨髓幹細胞、基質細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞、胚胎幹細胞、 胎兒幹細胞、臍帶幹細胞、胎盤衍生的幹細胞和成年幹細胞。
29. 根據權利要求23-28之一的方法，其中細胞生長的表面是管的 內表面。
30. 根據權利要求23-29之一的方法，其中細胞生長的表面是連續纖維。
31. 根據權利要求23-30之一的方法，另外包含在生長室區域中存 在的一個或多個生長室中培養細胞。
32. 根據權利要求23-31之一的方法，另外包含在生長室區域培養 一個或多個類型的細胞。
33. 根據權利要求23-32之一的方法，其中所述管是透氣的。
34. 根據權利要求23-32之一的方法，其中所述管是不透氣的。
35. 根據權利要求23-34之一的方法，另外包含調節管的生長室部 分相對應環境壓力的壓力。
36. 根據權利要求23-35之一的方法，另外包含測量生長室區域中 培養基的pH。
37. 根據權利要求23-36之一的方法，另外包含用溫度調節器調節 生長室區域的溫度，所述溫度調節器被構建以控制管的生長室區域的溫度。
38. 根據權利要求23-37之一的方法，另外包含用攪拌器攪拌生長 室區域中的培養基。
39. 根據權利要求23-38之一的方法，其中所述攪拌器包含至少一 個攪拌棒。
40. 根據權利要求23-39之一的方法，另外包含使生長培養室區域 遭受下述的至少一個輻射波、光波、x射線、聲波、電磁場和放射性 場。
41. 根據權利要求23-40之一的方法，另外包含使生長室區域遭受 不同重力。
42. 根據權利要求23的方法，其中步驟e)允許如下稀釋提供特定 量的來自上遊區域的新鮮培養基進入生長室，同時通過所述生長室的另 一個末端，從生長室分離和取出等量的培養物到下遊區域。
43. 根據權利要求23或42的方法，其中步驟e)另外包含在每個生 長周期之間移動管，從而使得生長室管與未使用的培養基的導入一起更 新，從而預防耐稀釋群體的可能的增殖，同時避免分離的生長室的可能 的汙染。
44. 根據權利要求23-43之一的方法，其中所述細胞不懸浮生長。
45. 根據權利要求23-44之一的方法，其中所述細胞作為粘附細胞 生長。
全文摘要
用於以連續方式培養植物細胞、動物細胞或幹細胞的方法和設置。
文檔編號C12M1/24GK101517063SQ200780036125
公開日2009年8月26日 申請日期2007年7月30日 優先權日2006年7月28日
發明者尤德斯·德克雷西 申請人:尤德斯·德克雷西