診斷方法

2023-11-30 02:47:51 2

診斷方法
【專利摘要】本發明涉及一種診斷方法。已證明HBP水平在隨後發展嚴重敗血症的個體中增加。因此，在個體中的HBP水平、HBP/WBC比或HBP/NC比可用於確定個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中。
【專利說明】診斷方法
[0001]本申請是申請日為2008年6月12日，申請號為200880019915.X，發明名稱為「診斷方法」的申請的分案申請。
發明領域
[0002]本發明涉及對發展嚴重敗血症的易感性診斷和預防。
[0003]發明背景
[0004]敗血症是對感染的全身炎症反應，在嚴重情況下造成器官衰竭和死亡。它是發病和死亡的日益常見的原因，特別是在老年、無免疫應答和病危個體中。已報導敗血症在非冠脈重病監護病房中是最常見的死亡原因(Bone RC等人；Chest.1992年6月；101 (6): 1644-55)。它以所有住院治療的1%_2%發生並且死亡率範圍從敗血症的20%至嚴重敗血症的40%至敗血症性休克(嚴重敗血症的一個亞類)的>60%(Leibovici ; Ann Intern Medl991; 114(8): 703，Martin 等人；N Engl J Med.2003 年 4 月17 H ;348 (16):1546-54)。
[0005]敗血症的臨床定義為出現兩種或更多種以下的狀況，同時具有確認的或懷疑的感染:
[0006](I)發燒(溫度>38 °C )或體溫過低(溫度〈36 °C )；
[0007](2 )心率>90次每分鐘；
[0008](3)呼吸率>20次呼吸每分鐘或PaC02〈32_ Hg ;和
[0009](4)白細胞計數>12 ( X IO9細胞/L)或〈4 ( X IO9細胞/U。
[0010]已知狀況(I)至(4)為SIRS (嚴重炎症反應症候群)標準(Bone RC等人；Chest.1992Jun; 101 (6):1644-55)並且被承認是診斷嚴重炎症的國際標準。表現出SIRS標準的兩種或更多種而沒有證實的或懷疑的感染的個體被歸類為具有非感染相關的SIRS。
[0011]嚴重敗血症的臨床定義為如上定義的敗血症，伴有敗血症誘導的低血壓、器官功能障礙或灌注異常。敗血症誘導的低血壓定義為收縮壓<90mmHg或從不存在其他低血壓原因下的基線處降低〈40_ Hg。灌注異常可包括，但不限於灌注不足、乳酸性酸中毒、少尿或精神狀況的急性改變。嚴重敗血症包括作為亞類的敗血症性休克狀況。該狀況由敗血症誘導的低血壓的存在而特別定義，儘管足夠的體液復甦(Fluid resuscitation)連同存在灌注異常。接受收縮性藥或血管加壓藥的個體可能在測量灌注異常時不是低血壓。
[0012]為了治療嚴重敗血症，在更嚴重的症狀(低血壓、器官功能異常或灌注不足)發作前診斷以建立充分的治療對成功的結果是極其重要的(Rivers E等人.NEngl J Med2001; 345 (19): 1368-77)。例如，Kumar等人表明死亡與在進行第一次治療前、敗血症誘導的低血壓發作後所經過的小時數相關(Kumar等人.Crit CareMed2006; 34 (6):1589-96)。需要可靠的生物學或臨床標誌物以儘早確定個體是否處於發展嚴重敗血症的危險而最小化在治療建立前的延遲。
[0013]發明概沭[0014]肝素結合蛋白(HBP, CAP37, Azurocidin)是糖基化的、單鏈、帶負電的37kDa無活性的絲氨酸蛋白酶同源物，顯示與人中性粒細胞彈性蛋白酶44%的序列同一性。已發表了 HBP 的三維結構(Iversen 等人 Nat Struct Biol.1997 年 4 月;4 (4): 265-8)。它包含在人中性粒細胞的嗜天青顆粒(azurofilic granulae)中(Lindmark等人，J LeukocBioll999;66(4):634_43)。它是多功能蛋白，已顯示通過改變血管細胞骨架的Ca2+平衡而誘導血管滲漏(Gautam等人，Nature Medicine2001; 7 (10): 1123-7)。與纖維蛋白原複合的A族鏈球菌(GAS)的M蛋白已顯示通過刺激嗜中性粒細胞的B2-整聯蛋白受體而誘導HBP的釋放(Herwald等人，Cell2004; 116 (3):367_79)。LPS還可通過未知的機理誘導HBP釋放(Rasmussen等人，FEBS Lett 1996; 390 (I): 109 12)。HBP的序列是公開可用的(例如作為NCBI登錄號NP_001691區域:27..248)並在下面再現為序列識別號I。
[0015]序列識別號I
[0016]IVGGRKARPRQFPFLASIQNQGRHFCGGALIHARFVMTAASCFQSQNPGVSTVVLGAYDLRRRERQSRQTFSISSMSENGYDPQQNLNDLMLLQLDREANLTSSVTILPLPLQNATVEAGTRCQVAGWGSQRSGGRLSRFPRFVNVTVTPEDQCRPNNVCTGVLTRRGGICNGDGGTPLVCECLAHGVASFSLGPCGRGPDFFTRVALFRDWIDGVLNNPGP
[0017]先前還未對表現出一種或多種SIRS標準的個體中的HBP水平進行研究。本發明人首次表明，HBP水平在隨後發展嚴重敗血症的個體中增加。HBP水平在記錄敗血症誘導的低血壓之前達12小時升高，但如果建立治療則迅速降低。本發明人還首次表明，HBP/白細胞計數(WBC)比在隨後發展嚴重敗血症的個體中升高。
[0018]因此根據本發明，提供了一種鑑定個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中的方法，該方法包括測量個體中的HBP並由此確定該個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中。
[0019]在一些實施方案中，所述HBP可以是在取自所述個體的體液樣品中測量的。
[0020]本發明方法還可包括測量個體中的WBC或嗜中性粒細胞計數(NC)、分別計算HBP/WBC比或HBP/NC比並由此確定該個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中。
[0021]在一些實施方案中，所述WBC或NC可以是在取自所述個體的血樣中測量的。
[0022]在一些實施方案中，確定所述個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中可包括確定所述體液樣品中的HBP濃度是否大於20 ng/ml。
[0023]在一些實施方案中，所述體液樣品中的HBP水平或濃度相對於HBP的基線水平或濃度可增加至少2.5倍。
[0024]在一些實施方案中，當所述體液樣品中的HBP濃度是以ng/ml測量並且所述血樣中的WBC是以細胞數X 109/1測量時，確定所述個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中可包括確定HBP/WBC比是否大於2。
[0025]在一些實施方案中，所述血樣中的HBP/WBC比或HBP/NC比分別相對於基線HBP/WBC比或HBP/NC比可增加至少2.5倍。
[0026]在一些實施方案中，所述個體被懷疑處於發展嚴重敗血症的危險中。
[0027]在一些實施方案中，所述個體可具有證實的或懷疑的感染和/或顯示SIRS標準的一種或多種。
[0028]在一些實施方案中，所述個體可具有證實的或懷疑的感染和/或顯示SIRS標準的兩種或多種。
[0029]在一些實施方案中，所述證實的或懷疑的感染可影響:肺；呼吸道；肝；腎；泌尿道；皮膚(表皮的和皮下的)；心臟；胃；腸；血液；骨；關節或其任意組合。
[0030]在一些實施方案中，所述個體可以是:無免疫應答的患者；糖尿病患者；具有靜脈內導管、手術傷口、外科引流或褥瘡的住院治療的患者；或其任意組合。
[0031 ] 在一些實施方案中，所述個體可以是哺乳動物。
[0032]在一些實施方案中，所述哺乳動物可以是人。因此，本發明方法可包括測量個體中的HBP並計算個體中的HBP/WBC水平或HBP/NC比，並由此確定該個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中。
[0033]本發明還提供:
[0034]-用於檢測HBP的試劑，用來確定個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中；
[0035]-用於確定個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中的方法的測試試劑盒，所述測試試劑盒包括用於檢測個體中的HBP的試劑；
[0036]-降低個體發展嚴重敗血症的危險的方法，其包括:
[0037](i)使用本發明方法確定個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中；和
[0038](ii)將治療有效量的適於治療感染的藥劑和/或靜脈注射液施用於在(i)中被鑑定為處於危險中的個體。
[0039]在一些實施方案中，所述試劑可包括HBP特異性抗體。
[0040]在一些實施方案中，所述適於治療感染的藥劑可為抗生素。
[0041 ] 在一些實施方案中，所述抗生素可以是廣譜抗生素。
[0042]在一些實施方案中，所述抗生素可以是克林黴素。
[0043]在一些實施方案中，所述試劑盒可另外包括用於測量個體的WBC的裝置。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1顯示在嚴重敗血症組(n=51)、敗血症組(n=95)、感染而沒有SIRS組(n=44)和SIRS而沒有感染組(n=12)中的HBP濃度(圖la)、HBP/WBC比(圖lb)、CRP水平(圖lc)、IL_6水平(圖1d)和乳酸鹽水平(圖le)。在方框內的線:中值；方框邊緣:四分位數(Q1、Q3);觸鬚線:數值範圍和ο:由患者數確定的超偏值。圖1a和圖1b的直線分別表示HBP水平為20ng/ml的截斷值和HBP/WBC比為2的截斷值。
[0045]圖2顯示HBP水平和/或HBP/WBC比、HBP水平、HBP/WBC比、乳酸鹽、白細胞計數、CRP和IL-6的ROC曲線。從0，O至1，I的直線是參考線。連接產生對角線部分。
[0046]圖3顯示在嚴重敗血症組的每個個體(n=51)的HBP/WBC比(圖3a)或HBP濃度(圖3b)，依據相對於最低測量的血壓的時間(由在O小時處的箭頭表示)從收集第一個血漿樣品的時間作圖。在圖3a中的空心圓表示落在HBP/WBC比截斷水平以下但得分在HBP濃度截斷水平以上的患者。在圖3b中的空心圓表示落在HBP濃度截斷水平以下但得分在HBP/WBC比截斷水平以上的患者。
[0047]圖4顯示在取自16個患有嚴重敗血症的患者的連續的血漿樣品中經96小時的HBP/WBC比變化(圖4a)和在取自7個患有敗血症、感染而沒有SIRS或沒有感染的患者的連續血漿樣品中經72小時的HBP/WBC比變化(圖4b)。每條線表示單獨的患者。
[0048]發明詳沭
[0049]診斷[0050]本發明涉及鑑定受治療者是否處於發展嚴重敗血症的危險中的方法。因此本發明涉及個體對於嚴重敗血症的易感性診斷。在測試下的個體通常被懷疑處於發展嚴重敗血症的危險中。所述個體通常是哺乳動物。所述哺乳動物通常是人類或諸如馬、母牛、羊、狗或貓的家養哺乳動物。所述個體優選人類。
[0051]個體因為其具有證實的或懷疑的感染和/或顯示出SIRS標準的一種或多種或者兩種或更多種而可能被懷疑處於發展嚴重敗血症的危險中。所述SIRS標準是:
[0052](I)發燒(溫度>38 °C )或體溫過低(溫度〈36 °C )；
[0053](2 )心率>90次每分鐘；
[0054](3)呼吸率>20次呼吸每分鐘或PaC02〈32_ Hg ;和
[0055](4)白細胞計數>12 ( X IO9細胞/L)或〈4 ( X IO9細胞/U。
[0056]證實的或懷疑的感染通常是細菌感染、寄生蟲感染或真菌感染的一種或多種。細菌感染可由一種或多種革蘭氏陰性的或革蘭氏陽性的細菌引起。所述一種或多種革蘭氏陰性的細菌可以選自大腸桿菌(Escherichia coli)、克雷伯氏菌屬(Klebsiellaspp.)(通常為克雷伯氏肺炎菌(K.pneumoniae)或產酸克雷伯菌(K.0xytocd))、腸桿菌屬(Enterobacter spp)(通常為陰溝腸桿菌(E.cloacae)或產氣腸桿菌(E.aerogenes))、包特氏菌屬(Bordetella spp.)(通常為支氣管敗血性包特氏菌(B.bronchiseptica)、百日咳包特氏菌(B.pertussis)或副百日咳包特氏菌(B.parapertussis))、衣原體屬(Chlamydiaspp.)(通常為砂眼衣原體( C.trachomatis))、軍團菌屬(Legionella spp.)(通常為嗜肺軍團菌(L.pneumophilia))、假單胞菌屬(Pseudemonas spp.)(通常為綠膿假單胞菌(P.aeruginosa))、支原體屬(Mycoplasma spp.)(通常為肺炎支原體(Μ.pneumoniae))、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、奇異變形菌(Proteus mirabilis)、鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)、嗜麥芽糖寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)和腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)(通常為血清組A、B、C、H、1、K、L、X、Y、Z、29E或W135)。所述一種或多種革蘭氏陽性的細菌可以選自葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)(通常為金黃色葡萄球菌(S.aureus)或凝固酶陰性的葡萄球菌(Staphylococci))、鏈球菌屬(Streptococcus spp.)(通常為肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)或釀膿鏈球菌(S.pyogenes))和腸球菌屬(Enterococcus spp.)(通常為屎腸球菌(E.faecium)或糞腸球菌(E.faecalis))。真菌感染可能由一種或多種選自以下的真菌引起:白色念珠菌(Candida albicans)、熱帶念珠菌(Candida tropicalis)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、克柔念珠菌(Candida krusei)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)和煙麴黴(Aperigillus fumigatus)。
[0057]證實的或懷疑的感染可影響身體的任何部位。典型實例包括影響以下部位的感染:肺；呼吸道；肝；腎；泌尿道；皮膚(表皮和皮下的)；心臟?』胃;腸；血液；骨；關節或其任意組合。證實的或懷疑的感染可以是腦膜炎。
[0058]感染可以通過本領域中公知的診斷實踐而證實，例如取自個體的樣品的微生物培養、取自個體的尿或其他體液樣品的抗原測試(特別是對肺炎鏈球菌感染和軍團菌屬感染)或PCR分析(特別是對由諸如支原體、軍團菌屬、衣原體和百日咳包特氏菌的細菌感染引起的非典型肺炎)。新近開發了多重PCR技術，所述多重PCR技術能夠同時測試多種細菌感染和真菌感染。[0059]感染可能因為存在一種或多種以下的一般症狀而被懷疑:高於38°C的發燒；寒戰；疼痛；持續痛(ache)或觸痛(tenderness);全身的疲勞感；盜汗；和伴有發紅、發熱、腫脹或疼痛或流出白色、淡黃色或淡綠色體液的傷口或切口。
[0060]本發明可用於確定具有發展嚴重敗血症的一種或多種另外的危險因子和/或一種或多種傾向的個體的易感性。增加發展嚴重敗血症的易感性的危險因子通常包括增加感染易感性的任何因子。這些因子可包括削弱的免疫系統(即個體是無免疫應答的)、或住院治療的患者中存在靜脈內導管、手術傷口、外科引流或被稱為褥瘡潰瘍或褥瘡的皮膚受損部位。糖尿病個體更易於發展嚴重敗血症。本發明的診斷方法可以與另一檢測或遺傳測試聯合進行以改進風險預測。
[0061]通常，個體不具有慢性炎性相關的疾病和/或不顯示與這樣的疾病特別相關的症狀。這樣的疾病的實例包括動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、哮喘、類風溼性關節炎、骨關節炎和諸如克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、腸易激症候群和炎性腸病的腸的炎性疾病。如果個體確實具有慢性炎性相關的疾病，他們另外具有如上定義的證實的或懷疑的感染和/或顯示SIRS標準的一種或多種或兩種或更多種。
[0062]通常，個體不具有嚴重敗血症或不顯示將導致嚴重敗血症的診斷的症狀。通常這樣的症狀包括敗血症誘導的低血壓、器官功能障礙或灌注異常。敗血症誘導的低血壓被定義為收縮壓<90mm Hg或從不存在其他低血壓原因下的基線處降低<40mm Hg。灌注異常可包括，但不限於灌注不足、乳酸性酸中毒、少尿或精神狀況的急性改變。嚴重敗血症包括作為亞類的敗血症性休克狀況。該狀況由敗血症誘導的低血壓的存在而特別定義，儘管足夠的體液復甦連同存在灌注異常。接受收縮性藥或血管加壓藥的個體可能在測量灌注異常時不是低血壓。
[0063]本發明涉及測量HBP在個體中的水平。通常通過確定HBP在取自個體的體液樣品中的濃度而測量HBP水平。根據本發明，與基線水平或濃度相比增加的HBP水平指示個體對發展嚴重敗血症是易感性的或個體處於發展嚴重敗血症的危險中。基線水平通常為HBP在被懷疑處於發展嚴重敗血症的危險中但沒有隨後發展嚴重敗血症的個體中的水平。例如，本發明人已表明，當HBP水平是通過確定HBP在取自個體血漿樣品中的濃度而測量時，發展非嚴重敗血症的個體具有約8.5ng/ml的中值HBP濃度，具有證實的或懷疑的感染但顯示一種或更少的SIRS標準的個體具有約6.5ng/ml的中值HBP濃度，以及在不存在感染的情況下顯示兩種或更多種SIRS標準的個體具有約9ng/ml的中值HBP濃度。對於所有被懷疑處於發展嚴重敗血症的危險中但沒有隨後發展嚴重敗血症的個體類型的中值HBP濃度為約8ng/mlο
[0064]在本發明中，在取自個體的體液樣品中伴隨增加的發展嚴重敗血症易感性或危險性的增加的HBP濃度通常為大於約15ng/ml或大於約16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、21ng/ml、22ng/ml、23ng/ml或24ng/ml。伴隨增加的發展嚴重敗血症的易感性或危險性的增加的HBP濃度優選大於約20ng/ml。
[0065]根據本發明，伴隨增加的發展嚴重敗血症增加的易感性或危險性的HBP水平或濃度的增加相對於基線水平或濃度為至少2倍、2.5倍或3倍。伴隨增加的發展嚴重敗血症的易感性或危險性的HBP水平或濃度的增加相對於基線水平或濃度優選至少2.5倍。
[0066]因此，本發明還可涉及評估HBP/白細胞計數(WBC)的比以確定發展嚴重敗血症的危險。
[0067]根據本發明，相對於基線比增加的HBP/WBC比表明個體對發展嚴重敗血症是易感性的或個體處於發展嚴重敗血症的危險中。基線比通常為在被懷疑處於發展嚴重敗血症的危險中但沒有隨後發展嚴重敗血症的個體中的HBP/WBC比。當HBP在體液樣品中的濃度是以ng/ml測量並且在血樣中的WBC是以細胞數X 109/1測量時，本發明人已表明，例如，發展非嚴重敗血症的個體具有約0.7:1的中值HBP/WBC比，具有證實的或懷疑的感染但顯示一種或更少的SIRS標準的個體具有約0.85:1的中值HBP/WBC比，以及在不存在感染的情況下顯示兩種或更多種SIRS標準的個體具有約0.9:1的中值HBP/WBC比。對於所有被懷疑處於發展嚴重敗血症的危險中但沒有隨後發展嚴重敗血症的個體類型的中值HBP/WBC比為約0.75:1。
[0068]在本發明中，當HBP在體液樣品中的濃度是以ng/ml測量並且在血樣中的WBC計數是以細胞數X109/1測量時，伴隨增加的發展嚴重敗血症的易感性或危險性的增加的HBP/WBC 比通常大於約 1.4:1，或大於約 1.5: 1、1.6: 1、1.7: 1、1.8: 1、1.9:1、2.0:1、2.1:1、
2.2:1,2.3:1或2.4:1。伴隨增加的發展嚴重敗血症的易感性或危險性的增加的HBP/WBC比優選大於約2.0:1。
[0069]根據本發明，伴隨增加的發展嚴重敗血症的易感性或危險性的HBP/WBC比的增加相對於基線比至少為1.5倍、2倍、2.5倍或3倍。伴隨增加的發展嚴重敗血症的易感性或危險性的HBP/WBC比的增加相對於基線比優選為至少2.5倍。
[0070]本發明人已確定，在被懷疑處於發展嚴重敗血症的危險中的個體中的平均嗜中性粒細胞計數(NC)為白細胞計數(WBC)的約80%。本發明還可評估HBP/NC比以確定發展嚴重敗血症的危險。
[0071]根據本發明，相對於基線比增加的HBP/NC比表明個體對發展嚴重敗血症是易感性的或個體處於發展嚴重敗血症的危險中。基線比通常為在不具有感染和/或不顯示任何SIRS標準的個體中的HBP/NC比。當HBP在體液樣品中的濃度是以ng/ml測量並且在血樣中的NC計數以細胞數X 109/1測量時，本發明人已表明，例如，發展非嚴重敗血症的個體具有約0.55:1的中值HBP/NC比，具有證實的或懷疑的感染但顯示一種或更少的SIRS標準的個體具有約0.65:1的中值HBP/NC比，以及在不存在感染的情況下顯示兩種或更多種SIRS標準的個體具有約0.7:1的中值HBP/NC比。對於所有被懷疑處於發展嚴重敗血症的危險中但沒有隨後發展嚴重敗血症的個體類型的中值HBP/NC比為約0.6:1。
[0072]在本發明中，當HBP在體液樣品中的濃度是以ng/ml測量並且在血樣中的NC計數是以細胞數X109/1測量時，伴隨增加的發展嚴重敗血症的易感性或危險性的增加的HBP/NC 比通常大於約 1.1:1，或大於約 1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1或1.9:1。伴隨增加的發展嚴重敗血症的易感性或危險性的增加的HBP/NC比優選大於約1.6:1。
[0073]根據本發明，伴隨增加的發展嚴重敗血症的易感性或危險性的HBP/NC比的增加相對於基線比至少為1.5倍、2倍、2.5倍或3倍。伴隨增加的發展嚴重敗血症的易感性或危險性的HBP/NC比的增加相對於基線比優選為至少2.5倍。
[0074]本發明通常在從個體獲得的樣品上體外進行。樣品通常包含個體的體液。樣品優選血液、血漿、血清、尿、腦脊液或關節液樣品。樣品最優選血液樣品。通常在檢測前例如通過離心而處理所述樣品。樣品通常還可在檢測前儲存，優選地在_70°C以下儲存。
[0075]本領域中公知的標準方法可用於檢測HBP水平。這些方法通常包括使用用於檢測HBP的試劑。所述試劑通常與HBP特異性結合。所述試劑可以是對於HBP具有特異性的抗體。特異性應當理解為試劑或抗體與HBP結合而對任何其他的分子(特別是任何其他的蛋白)沒有顯著的交叉反應性。例如，對於HBP具有特異性的試劑或抗體將不顯示與人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶顯著的交叉反應性。可通過任何合適的方法評估交叉反應性。
[0076]用於本發明方法中的抗體可以是能夠結合至HBP的全抗體或其片段。抗體可以是單克隆的。這樣的全抗體通常是通過本領域公知的任何合適的方法製成的抗體。例如,通過用HBP在合適的條件下免疫通常為兔或小鼠的哺乳動物並從例如所述哺乳動物的血清中分離抗體分子，可以獲得多克隆的抗體。單克隆抗體可通過雜交瘤或重組體方法獲得。
[0077]雜交瘤方法涉及用HBP在合適的條件下免疫通常為兔或小鼠的哺乳動物、然後收穫所述哺乳動物的脾細胞並將其與骨髓瘤細胞融合。然後，將融合的細胞的混合物稀釋並且克隆從單個母細胞中生長。隨後測試由不同克隆分泌的抗體與HBP結合的能力，並然後將最多產且穩定的克隆在培養基中生長為高容積。收集並純化分泌的抗體。
[0078]重組方法涉及將不同免疫球蛋白基因區段克隆入噬菌體或酵母以產生具有稍微不同的胺基酸序列的抗體庫。可以選擇產生結合至HBP的抗體的序列並且該序列被克隆至，例如，細菌細胞系用於生產。
[0079]通常,抗體是哺乳動物抗體,諸如靈長類抗體、人類抗體、齧齒動物抗體(例如小鼠或大鼠)、兔抗體、綿羊抗體、豬抗體、馬抗體或駱駝抗體。抗體可以是駱駝科動物抗體或鯊魚抗體。抗體可以是納米抗體(nanobody)。抗體可以是抗體的任何類或同種型,例如IgM,但優選IgG。
[0080]可用於本方法的全抗體的片段包括抗原結合部位，例如Fab或F(ab)2片段。全抗體或片段可以與其他部分結合，所述其他部分例如可用於將2個或更多個片段或抗體連接在一起的連接體。這樣的連接體可以是化學連接體或者可以與片段或全抗體的融合蛋白的形式存在。因此，連接體可用於將具有相同或不同結合特異性的全抗體或片段連接在一起，例如將能夠結合相同或不同多態性的全抗體或片段連接在一起。抗體可以是能夠結合至兩種不同抗原的雙特異性抗體，所述兩種不同抗原通常為本文提及的任意兩種多態性。抗體可以是通過將兩種可變結構域背靠背連接而形成的「雙抗體」。在用於本方法的抗體以上述具有不同特異性的不同抗原結合部位的任何形式存在的情況下，則這些不同特異性通常為在不同位置或在不同蛋白上的多態性。在一個實施方案中，抗體是包括來自諸如人源化抗體的不同天然抗體的序列的嵌合抗體。
[0081]評估HBP水平的方法通常包括用能夠與HBP特異性結合的試劑或抗體接觸樣品。這樣的方法可包括浸潰片測定(dipstick assay)和酶聯免疫吸附測定(ELISA)。通常，浸潰片包括與HBP特異性結合的一種或多種抗體或蛋白。如果存在多於一種抗體，抗體優選地具有不同的非重疊的決定子以便它們可以同時結合至HBP。
[0082]ELISA是需要分離試劑的非均勻的、固相測定。ELISA通常使用夾心技術或競爭技術而進行。夾心技術需要兩種抗體。第一種特異性結合HBP並結合至固體支持體。第二種抗體結合至標誌物，通常是酶偶聯物。使用酶的底物量化HBP-抗體複合物並由此量化在樣品中的HBP的量。抗原競爭性抑制測定通常也需要結合至支持體的HBP-特異性抗體。將HBP-酶偶聯物加入待測定的樣品(包含HBP)。HBP-酶偶聯物與未標記的HBP之間的競爭抑制允許定量樣品中的HBP的量。用於ELISA反應的固體支持體優選包含孔。
[0083]本發明還使用不包含抗體的測量HBP的方法。高效液相色譜(HPLC)分離和螢光檢測優選用作確定HBP水平的方法。可使用先前描述的HPLC設備和方法(Tsikas D等人.JChromatogr B Biomed Sci Appl 1998; 705:174-6)。通常基於尺寸或電荷進行 HPLC 期間的分離。在HPLC之前，通常將內源胺基酸和內標L-高精氨酸加入測定樣品並且這些在CBA柱(Varian, Harbor City, CA)上被相提取。樣品中的胺基酸優選用鄰-苯二醒(OPA)衍生化。對於所有胺基酸，測定的準確度和精密度優選在質量控制樣品內測定。
[0084]可使用本領域中公知的標準方法測量個體中的白細胞計數或嗜中性粒細胞計數。這樣的方法包括自動計數或手動計數。
[0085]本發明還提供了診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包括用於測量個體中的HBP水平並從而確定該個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中的裝置。試劑盒通常包括特異性結合HBP的一種或多種抗體。例如，試劑盒可包括單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體或人源化抗體。抗體可以是完整的免疫球蛋白分子或其片段如Fab片段、F(ab』)2片段或Fv片段。如果存在多於一種抗體，抗體優選具有不同的非重疊的決定子以便它們可同時結合至HBP。
[0086]所述試劑盒可另外包括用於測量個體中WBC計數的裝置。
[0087]所述試劑盒可另外包括使上述方法的任一實施方案能夠實施的一種或多種其他試劑或裝置。這樣的試劑或裝置包括以下的一種或多種:合適的緩衝液(水溶液)、從樣品中分離HBP的裝置、從個體中獲得樣品的裝置(例如包括針的導管或裝置)或可在其上進行定量反應的包括孔的支持體。試劑盒可以任選地包括使試劑盒能夠用於本發明方法的說明書或關於本方法可對哪些個體實施的詳細說明。
[0088]治療
[0089]本發明還涉及對通過本發明方法鑑定為處於發展嚴重敗血症的危險中的個體的治療。因此，用於降低發展嚴重敗血症的危險的物質可用於製備用於治療通過本發明方法鑑定為處於發展嚴重敗血症的危險中的個體的藥物。因此，通過本發明方法鑑定為處於發展嚴重敗血症的危險中的個體的狀況可通過施用這樣的物質而被改善。從而,嚴重敗血症可被預防。可用於降低發展嚴重敗血症的危險的治療有效量的物質可給予通過本發明方法鑑定為需要其的個體。適於降低發展嚴重敗血症的危險的物質通常包括一種或多種抗生素和/或一種或多種靜脈注射液。所述一種或多種抗生素通常為廣譜抗生素。廣譜抗生素通常選自一種或多種氨基糖苷類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類、林可醯胺類、大環內酯類、青黴素類、磺胺類藥或四環素類。例如，合適的抗生素包括，但不限於，慶大黴素、卡那黴素、新黴素、鏈黴素、託普黴素、頭孢唑啉、頭孢氨苄、頭孢匹林、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢克肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢唑肟、頭孢曲松、環丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、克林黴素、阿奇黴素、克拉黴素、紅黴素、阿莫西林、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、氯唑西林、雙氯西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、苄星青黴素G、青黴素G鉀、普魯卡因青黴素G、青黴素V鉀、哌拉西林、替卡西林、替卡西林-克拉維酸鉀、乙胺嘧啶-磺胺多辛、磺胺嘧啶、磺胺異噁唑、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、金黴素、多西環素和四環素。
[0090]根據本發明可用於降低發展嚴重敗血症的危險的物質通常與藥學上可接受的載體或稀釋劑配製用於本發明中的施用。藥物載體或稀釋劑可以是，例如，等滲溶液。例如，固體口服形式可包括連同活性物質的:稀釋劑，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纖維素、玉米澱粉或馬鈴薯澱粉；潤滑劑，如矽石、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣和/或聚乙二醇；結合劑，例如澱粉、阿拉伯樹膠、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素或聚乙烯基吡咯烷酮；崩解劑，如澱粉、海藻酸、藻酸鹽或羥基乙酸澱粉鈉；沸騰複合劑；染料；增甜劑；溼潤劑，如卵磷脂、聚山梨醇酯、硫酸月桂酯；和通常用於藥物製劑的非毒性的且藥理學上非活性的物質。這樣的藥物製劑可以已知的方式製備，例如通過混合過程、粒化過程、製片過程、包糖衣過程或薄膜包衣過程。
[0091]用於口服施用的液態分散體可以是糖漿、乳液或懸浮液。糖漿可包含例如蔗糖或蔗糖與甘油和/或甘露醇和/或山梨醇作為載體。
[0092]懸浮液和乳液可包含例如天然樹膠、瓊脂、藻酸鈉、果膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素或聚乙烯醇作為載體。用於肌肉內注射的懸浮液或溶液可包含連同活性物質的藥學上可接受的載體，例如無菌水、橄欖油、油酸乙酯、諸如丙二醇的二醇，以及如果需要，合適量的利多卡因鹽酸鹽。
[0093]用於靜脈內施用或輸注的溶液可包含例如無菌水作為載體，或者優選地，它們可以無菌的、含水的、等滲的鹽溶液的形式。
[0094]將用於預防嚴重敗血症的治療有效量的物質施用於根據本發明被鑑定的患者。例如抗生素的劑量可根據多種參數確定，特別是根據使用的物質；待治療患者的年齡、體重和狀況；施用途徑；以及所需的治療方案。此外，醫師將能夠對任何特定患者確定所需施用途徑和劑量。根據特定抗生素的活性、待治療的受治療者的年齡、體重和狀況以及施用的頻率與途徑，典型的日劑量為每kg體重從約0.1mg至50mg。優選地，日劑量水平為從5mg至2g。劑量可以單劑量提供或者可以多劑量提供，例如以諸如每日施用2劑、3劑或4劑的有規律的間隔服用。
[0095]以下實施例舉例說明了本發明:
實施例
[0096]1.方法
[0097]研究參與者
[0098]2006年3月至2007年4月，具有臨床上懷疑感染的202個成年患者被選入在瑞典隆德大學醫院(Lund University Hospital)的傳染病醫療中心(Infectious DiseaseClinic)的前瞻性研究。入選的標準為發燒>38°C並且抗生素治療少於24小時。在許可進入時記錄抗生素治療的持續時間、人口統計學、SIRS標準和收縮壓(SBP)。分析C反應蛋白(CRP)、乳酸鹽和WBC計數，並且用於後來分析HBP、IL-6水平的血漿樣品在從許可進入的12小時內獲得。在20個患者中，與記錄SIRS標準和SBP平行獲得達96小時的連續血漿樣品。在出院後，記錄最終的診斷和28天死亡率並且根據SIRS標準對患者分類(Bone等人，Chestl992;101(6): 1644-55)。
[0099]嚴重敗血症(第一組)被定義為存在敗血症並且SBP〈90mmHg或在血樣收集的24h內從基線處MOmmHg的SBP降低；敗血症(第二組)被定義為顯示出兩種或更多種SIRS標準以及感染；非敗血症(第三組)被定義為顯示一種SIRS標準以及感染；和非感染(第四組)被定義為顯示兩種或更多種SIRS標準以及非感染的最終診斷。
[0100]最終感染診斷為肺炎(n=61)、上呼吸道感染(n=35)、泌尿道感染(n=38)、表皮和皮下感染(n=29)、心內膜炎(n=4)、腸胃炎(n=12)或包括局部感染的其他感染(n=ll)。在35個患者(17%)中診斷出菌血症(17個革蘭氏陰性和18個革蘭氏陽性的細菌)。顯示兩種或更多種SIRS標準的非感染的診斷是肺栓子和系統性血管炎。將血樣收集在4mL塑料的血眾朽1檬酸鹽管中、立即以3000rpm離心lOmin、等分並在_70°C下儲存直到分析時。
[0101]HBP、IL-6、CRP、乳酸鹽、TOC 和 HBP/TOC 比的分析
[0102]通過夾心ELISA測定HBP的濃度(ng/ml),如在(Tapper等人；Blood2002;99(5):1785-93)中所述。血漿樣品在PBS中稀釋1/40並且以雙份運行。如在(Rasmussen等人；FEBS Lettl996; 390 (I): 109-12)中所述生產並純化重組體人HBP。如在(Lindmark等人；J.Leukoc.Bioll999; 66 (4):634-43)中所述製備並純化針對重組體HBP的小鼠單克隆抗體(2F23A)和兔抗血清(409A)並分別以1/3000和1/7000使用。來自Bio-RadLaboratories (Richmond, CA)的過氧化物酶偶聯的山羊抗兔IgG以1/3000使用。通過用WBC ( X 109 細胞 /L)除 HBP 濃度(ng/ml)計算 HBP/WBC 比。
[0103]用市售的人IL-6 試劑盒(Quantikine, R&D Systems, UK)測試 IL-6,檢測限 3pg/mL。血眾樣品被稀釋1/40。在Roche Hitachi Modular-P上根據生產商的說明使用來自Roche Diagnostics (Mannheim, Germany)的試劑進行CRP和乳酸鹽分析，除了用於乳酸鹽分析的樣品取自血漿檸檬酸鹽管而不是草酸鹽-氟化物管。
[0104]根據生產商的說明(Sysmex)在Sysmex XE2100中測量白細胞計數(WBC)。
[0105]統計分析
[0106]以中值、四分位數範圍提供數據。使用曼-懷氏等級和檢驗(Mann-Whitney ranksum test)進行顯著性檢驗。雙尾P值〈0.05被視為統計學上顯著的。確定HBP、HBP/WBC比、CRP、WBC 和 IL-6 的接受者工作特徵(Receiver-operating characteristic) (ROC)曲線(DeLong 等人;Biometricsl988; 44 (3):837-45)和曲線下面積(AUC)。以 95% 置信區間(95%CI)報導AUC值。從交叉表計算敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值。陽性似然比和陰性似然比也在表I中報導。
[0107]2.結果
[0108]研究的參與者的特徵
[0109]滿足入選標準的202個患者包括在內。將患者分為以下4組:51個患有嚴重敗血症的患者(第一組)；95個患有敗血症的患者(第二組)；44個非敗血症的患者(第三組)和12個非感染的患者(第四組)。這4組的中值年齡和男性/女性比分別為62歲，31/20 ；57歲，42/53 ；44歲，15/29 ;和73歲，11/1。在第一組、第二組和第三組中分別有22個、11個和2個患者被發現菌血症。
[0110]研究參與者中HBP水平和HBP/TOC比的分析
[0111]許可進入時，與在第二組、第三組和第四組中分別為1/95、0/44和0/12患者相比，嚴重敗血症組(p〈0.0001)(圖1a)的HBP水平顯著較高，42/51患者超過20ng/ml的截斷水平。此外，與其他組相比，嚴重敗血症組的患者顯示顯著(p〈0.0001)較高的HBP/WBC比(圖lb)。在嚴重敗血症組的44/51患者中、在敗血症組的2/95患者中、在非敗血症組的0/44患者中和在非感染組的0/12患者中發現高於2.0的HBP/WBC比。此外，與在敗血症組中的2/95患者和在另外2個組中的O個患者相比較，在嚴重敗血症組中的47/51患者的血漿HBP水平 >20ng/ml 或 HBP/WBC 比 >2.0 (表 I)。
[0112]類似地，在嚴重敗血症組中的CRP、IR-6和乳酸鹽水平也顯著較高(p=0.003，p〈0.0001, p〈0.0001)，儘管在組之間存在大量重疊(圖1c至圖le)。
[0113]HBP水平和HBP/TOC比的預測倌分析
[0114]如在本研究中假定25%的嚴重敗血症患病率，與計算的CRP和IL-6的所有不同截斷水平相比，以下變量顯示在診斷嚴重敗血症中更好的特異性、敏感性、陽性預測值(PPV)、陰性預測值(NPV)、陽性似然比(PLR)和陰性似然比(NLR):
[0115]-HBP水平>20ng/ml表明個體將發展嚴重敗血症；或
[0116]-HBP/WBC比>2.0表明個體將發展嚴重敗血症；或
[0117]-HBP水平>20ng/ml或HBP/WBC比>2.0表明個體將發展嚴重敗血症。
[0118]這些發現在表la、表1b和表1c中概述並且由ROC曲線(圖2)所支持。在表2中顯示ROC曲線的統計學分析。
[0119]HBP水平和HBP/TOC比在臨床症狀發作前預測嚴重敗血症
[0120]在嚴重敗血症組的51個患者的20個患者中，在達到最低SBP之前，HBP值被提高，達12h(圖3a和圖3b)。在24h內，在11個患者中的HBP水平快速降低，所述患者用足夠的抗生素和靜脈注射液治療並痊癒而沒有併發症。然而，在患者持續循環系統不穩定的5個病例中，HBP水平保持升高，這些患者中的I個在入選日的28天內死亡(圖4a)。
[0121]在全部5個患者中，全部死於嚴重敗血症組並且全部是在最後一次收集的升高的HBP樣品之後1-4日內死亡。在患有敗血症的6個患者中和具有非敗血症的I個患者中，HBP水平保持低於20ng/ml，以上患者隨後連續取樣(圖4b)。
[0122]在嚴重敗血症組中的20個患者在許可進入時具有增加的HBP水平或HBP/WBC比但是正常的SBP，表明這些指標能夠在標準臨床`診斷成為可能之前預測嚴重敗血症。這通過呈現3天發燒、腹瀉和嘔吐病史的70歲女性來示例說明。身體檢查是不顯著的，除了發燒38°C、脈搏率100但130mm/Hg的正常SBP，並且她住院時臨時診斷為腸胃炎。她被給予1000ml靜脈內晶體液。6小時後，她發展為SBP為70mm/Hg的嚴重低血壓、呼吸窘迫，並被立即轉移至ICU，後來在ICU診斷出由於大腸桿菌敗血症的具有瀰漫性血管內凝血的ARDS(成人呼吸窘迫症候群)。在許可進入時，她的HBP水平為80ng/ml並且HBP/WBC比為4.2。
[0123]表1a:在診斷嚴重細菌性敗血 症中所測試的變暈的敏感性、特異性、陽性預測倌.、陰性預測值、陽性似然比和陰性似然比
[0124]
【權利要求】
1.一種鑑定個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中的方法，所述方法包括測量所述個體的HBP並由此確定所述個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述HBP是在取自所述個體的體液樣品中測量的。
3.如權利要求1或2所述的方法,其還包括測量所述個體的白細胞計數(WBC)或嗜中性粒細胞計數(NC)，分別計算HBP/WBC比或HBP/NC比，並由此確定所述個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述WBC或NC是在取自所述個體的血樣中測量的。
5.如權利要求2所述的方法，其中確定所述個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中包括確定所述體液樣品中的HBP濃度是否大於20ng/ml。
6.如權利要求2所述的方法，其中所述體液樣品中的HBP水平或濃度相對於HBP的基線水平或濃度增加至少2.5倍。
7.如權利要求4所述的方法，其中，當所述體液樣品中的HBP濃度是以ng/ml測量並且所述血樣中的WBC是以細胞數X 109/1測量時，確定所述個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中包括確定HBP/WBC比是否大於2。
8.如權利要求4所述的方法，其中所述血樣中的HBP/WBC比或HBP/NC比分別相對於基線HBP/WBC比或HBP/NC比增加至少2.5倍。
9.如前述權利要 求中任一項所述的方法，其中所述個體被懷疑處於發展嚴重敗血症的危險中。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述個體具有證實的或懷疑的感染和/或顯示SIRS標準的一種或多種。
11.如權利要求9所述的方法，其中所述個體具有證實的或懷疑的感染和/或顯示SIRS標準的兩種或多種。
12.如權利要求10或11所述的方法，其中所述證實的或懷疑的感染影響:肺；呼吸道；肝；腎；泌尿道；皮膚(表皮的和皮下的)；心臟；胃；腸；血液；骨；關節或其任意組合。
13.如權利要求9至12中任一項所述的方法，其中所述個體是:無免疫應答的患者；糖尿病患者；具有靜脈內導管、手術傷口、外科引流或褥瘡的住院治療的患者；或其任意組口 ο
14.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述個體是哺乳動物。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
16.一種用於檢測HBP以用於確定個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中的試劑。
17.如權利要求16所述的試劑，其中所述試劑包括HBP特異性抗體。
18.一種降低個體發展嚴重敗血症的危險的方法，其包括: (i)使用根據權利要求1至15中任一項的方法確定個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中；和 (ii)將治療有效量的適於治療感染的藥劑和/或靜脈注射液施用於在(i)中被鑑定為處於危險中的個體。
19.如權利要求18所述的方法，其中所述適於治療感染的藥劑為抗生素。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述抗生素是廣譜抗生素。
21.如權利要求19所述的方法，其中所述抗生素是克林黴素。
22.—種在用於確定個體是否處於發展嚴重敗血症的危險中的方法中使用的測試試劑盒，所述測試試劑盒包括用於檢測個體的HBP的試劑。
23.如權利要求21所述的 試劑盒，其另外包括用於測量個體的WBC的裝置。
【文檔編號】G01N33/68GK103543271SQ201310432428
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2008年6月12日 優先權日:2007年6月12日
【發明者】L·博喬克, 貝蒂爾·克裡斯汀森, 海科·赫沃爾德, 亞當·林德, 波爾·艾克森 申請人:漢莎醫藥有限公司