控制水稻抽穗期基因EHD5及其編碼蛋白質和應用

2024-04-13 21:43:05

控制水稻抽穗期基因ehd5及其編碼蛋白質和應用
技術領域
1.本發明屬於基因工程領域，具體涉及一個控制水稻抽穗期基因ehd5及其編碼蛋白質和應用。


背景技術：

2.隨著世界人口日益增長，糧食安全成為人類面臨的巨大挑戰。水稻是世界上最重要的穀類作物之一，養育著全球一半以上的人口。開花(水稻表現為抽穗)是高等植物由營養生長向生殖生長轉換的重要標誌，是確定區域和季節適應性的重要農藝性狀(srikanth,a.and schmid,m.(2011)cell mol.life sci.68(12):2013-2037)。全球變暖和自然災害使得培育對環境波動和不利氣候有抵抗力的品種尤為重要。
3.隨著對開花機制的不斷深入了解，植物學家建立了比較完整的水稻抽穗期網絡體系，其大致分為兩條途徑：一條是與擬南芥中的gi-co-ft(gigatea-constans-flowering locus t)同源的osgi-hd1-hd3a(rice gigatea-heading date 1-heading date 3a)途徑(kojima,s.et al.(2002)plant cell physiol.43(10):1096-1105；yano,m.et al.(2000)plant cell 12(12):2473-2484)，另一條是單子葉植物特有的以ehd1為樞紐的途徑(doi,k.et al.(2004)genes dev.18(8):926-936)。這兩條途徑都會影響成花素(hd3a和rft1)的形成。成花素從葉片中產生，通過篩管移動到頂端分生組織，從而促進成花轉變(tsuji,h et al.(2011)curr.opin.plant biol.14(1):45-52)。
4.研究抽穗期有關基因對於擴大水稻品種間的地域適應性和提高雜交水稻遺傳多樣性具有重要意義。


技術實現要素：

5.本發明的目的在於公開控制水稻抽穗期基因ehd5及其編碼蛋白質和應用。
6.本發明的目的可通過如下技術方案實現：
7.控制水稻抽穗期基因ehd5，基因序列如seq id no.1所示，編碼一個rna結合蛋白，胺基酸序列如seq id no.3所示。
8.所述的控制抽穗期基因ehd5在水稻品種改良中的應用。
9.所述的控制水稻抽穗期基因的突變基因ehd5，基因序列如seq id no.2所示，包含rna結合蛋白ehd5的第936位胺基酸由半胱氨酸cys(tgc)突變為終止密碼子(tga)，胺基酸序列如seq id no.4所示。
10.所述的控制抽穗期基因的突變基因ehd5在水稻品種改良中的應用。
11.本發明還提供基因ehd5或突變基因ehd5在水稻抽穗期調控育種中的應用，如果通過將抽穗期基因ehd5轉基因至該基因功能缺陷的水稻中，可以培育早抽穗水稻品種，如果用傳統雜交或轉基因編輯的方法將ehd5基因轉移到野生型材料中，可獲得ehd5的功能缺陷型基因型、抽穗期較野生型稍晚的水稻品種。
12.本發明的有益效果：
13.本發明通過轉基因方法進行基因ehd5的轉化或者用傳統雜交或轉基因編輯的方法將ehd5基因轉移到野生型材料中，可獲得抽穗期較早或者ehd5的功能缺陷型基因型、抽穗期較野生型稍晚的水稻品種。通過本發明的基因可以調整水稻品種的地域適應性，為擴大雜交稻制種的遺傳多樣性提供了技術支持。
14.有益結果：
15.(1)本發明通過mutmap克隆了一個控制水稻抽穗期的基因ehd5，通過轉基因到水稻中，可以獲得抽穗期較早的水稻品種；而如果通過轉基因敲除則可以獲得ehd5功能喪失後出現晚抽穗表型的水稻品種。
16.(2)用傳統雜交或轉基因編輯的方法將ehd5基因轉移到野生型材料中，可獲得ehd5的功能缺陷型基因型、抽穗期較野生型稍晚的的水稻品種，進一步轉基因融合互補ehd5能夠恢復ehd5突變體晚抽穗的表型。
17.(3)ehd5較野生型稍晚抽穗的表型在長、短日照下較穩定，因此突變基因ehd5可以通過雜交或者轉基因編輯方法導入常規品種。
18.(4)通過本發明的基因可以調整水稻抽穗期時間，從而調整水稻品種的地域適應性，獲得生育期適應不同地區的水稻品種，為擴大雜交稻制種的遺傳多樣性提供了技術支持。
附圖說明
19.圖1為野生型dongjin與突變體ehd5的表型及其在長、短日照下的抽穗期統計圖。
20.圖2為ehd5的mutmap分析。
21.圖3為ehd5的基因結構。
22.圖4為轉基因敲除表型。
23.圖5為轉基因融合互補表型。
具體實施方式
24.以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。
25.實施例1、水稻rna結合蛋白突變基因的分子克隆
26.1、突變基因ehd5位點的定位
27.將水稻晚抽穗突變體ehd5(圖1)與野生型水稻品種dongjin進行雜交，得到的f1和f2群體進行遺傳分析，結果表明ehd5的晚抽穗表型由隱性單基因控制。選取f2群體的早、晚極端各30株，構建這兩個極端的dna混池，送至公司進行二代測序，測序後經mutmap pipeline(fekih,r.et al.(2013)plos one 8(7):e68529)分析關聯到第2號染色體(圖2)。
28.早、晚2個極端混池提取dna的方法如下所述：
29.a)f2群體中早、晚極端每株剪取0.1g構建早、晚2個混池，混池葉片在研缽中用液氮研磨充分。
30.b)加入10ml ctab提取液，將樣品在65℃水浴鍋中孵育30min，每10min上下顛倒一次以保證充分混勻。
31.c)加入等量氯仿：異戊醇(24:1)，顛倒混勻並靜置3min。
32.d)12000rpm離心10min。
33.e)小心吸取6ml上清，轉移至一個新的離心管中，並加入0.7倍上清體積的異丙醇，混勻後放置於-20℃。
34.f)冷凍4小時後，12000rpm離心10min(4℃)，小心棄去上清液。
35.g)用70％乙醇洗滌沉澱兩次，通風櫥中將沉澱晾乾。將dna沉澱溶於500μl去離子水中，-20℃保存備用。
36.2、目的基因的克隆
37.在關聯區間內利用rice genome annotation project rice genome browser-release 7網站預測，發現其中一個orf發生了一個鹼基的替換，即由野生型的seq id no.1所示基因變為突變型的seq id no.2所示的基因，導致了半胱氨酸變為終止密碼子，編碼的胺基酸序列由seq id no.3突變為seq id no.4。
38.3、野生型ehd5基因的序列分析
39.野生型ehd5的基因序列見seq id no.1，編碼1001個胺基酸，含有3個rna識別基序。通過搜索水稻基因組資料庫，發現ehd5由14個外顯子和14個內含子組成(圖3)。
40.實施例2、轉基因敲除和融合互補植物的獲得和鑑定
41.1、表達載體構建
42.a)利用crispr-p在線網站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/crispr)設計候選基因ehd5的敲除引物,引物序列為：
43.crispr-f：5'ggcacatctcaggtcatggatcag 3'
44.crispr-r：5'aaacctgatccatgacctgagatg 3'
45.兩條引物(10μm)混勻，95℃孵育5min形成dimer adapter，連接體系：10
×
buf：1μl，50
×
oligo：0.2μl，atp(10mm)：1μl，pcambia 1305.1(80ng/μl)：1μl,dimer adapter：1μl，aari：0.2μl，t4連接酶：0.1μl，水：5.5μl。以上連接體系在pcr儀中進行連接：37℃5min，20℃5min，10個循環，4℃5min。
46.b)分別以野生型的dna和cdna為模板，進行pcr擴增獲得ehd5基因的啟動子和cds，構建pcambia1390互補載體，pcr引物序列如下：
47.pro-f：
48.5'ccggcgcgccaagcttggaccttccctgcttactgt 3'
49.pro-r：
50.5'catgacctgagatggcatcctgcaagcgcatagccatgg 3'
51.cds-f：
52.5'ccatggctatgcgcttgcaggatgccatctcaggtcatg 3'
53.cds-r：
54.5'atccgtcgacctgcagtcagtccttggcaggccctg 3'
55.上述引物擴增的pcr產物純化回收後與對應的線性化載體(pcubi1390)重組。重組體系：dna片段1(擴增啟動子)：2μl，dna片段2(擴增cds)：2μl，線性載體1μl，2
×
buf(abclonal)：5μl。以上重組體系在50℃下反應20min。
56.c)載體轉化步驟：
57.①
將連接或者重組產物轉移到100μl的大腸桿菌感受態(dh5α)中吹打混勻，冰浴30min。隨後在42℃水浴鍋中熱激90s，置於冰上靜置5min。
58.②
加入700μl大腸桿菌培養基在37℃搖床復甦1h。
59.③
在含卡那抗素的平板上塗勻，並在37℃培養箱中倒置培養16h。
60.④
挑取單克隆菌株測序，待測序正確後提取質粒。
61.⑤
用液氮速凍法分別將敲除載體和融合互補載體轉入農桿菌eha105。
62.2、農桿菌介導轉化獲得轉基因植株
63.以農桿菌eha105為介導，將上述構建的敲除載體和融合互補表達載體分別導入野生型品種nipponbare和ehd5突變體中
64.1、愈傷組織的侵染
65.a)28℃條件下培養敲除菌株和融合互補菌株16小時，收集菌體，並稀釋到n6液體培養基(sigma)中至濃度為od600≈0.5，獲得菌液；
66.b)將培養至一個月的相應的成熟胚愈傷組織與上述菌液混合侵染半小時，無菌濾紙吸乾菌液後轉入n6固體共培養基(sigma)，24℃培養3天；
67.c)將侵染後的愈傷組織轉移到含有150mg/l潮黴素b(sigma)的n6固體培養基中第一次篩選15天；
68.d)挑取健康愈傷用含有200mg/l潮黴素b(sigma)的n6固體培養基中第二次篩選15天，每15天繼代一次；
69.e)挑取抗性愈傷置於150mg/l潮黴素b的分化培養基上分化。
70.2、轉基因植株的鑑定：
71.轉基因敲除植株的鑑定：
72.在敲除靶點上下遊300bp附近設計擴增引物(引物為cr-de-f：5'gatccggtggaatctagttg 3'，cr-de-r：5'ggtaatgactcctgcttcca 3')，提取轉基因植株dna進行擴增，測序分析編輯方式。t1代基因型和抽穗期表型共分離實驗分析，證實了轉基因後的晚抽穗性狀是由ehd5引起的(圖4)。
73.功能互補植株的鑑定：野生型rna結合蛋白ehd5的轉基因植株，t0代經pcr分子檢測(引物com-de-f：5'agagtgtcgtgctccaccat 3'，com-de-r：5'
74.gcacgcagaatgagagagct 3')、t1代基因型及抽穗期表型共分離證實轉入野生型的ehd5後，ehd5突變體會由晚抽穗恢復成早抽穗，即轉基因前的晚抽穗表型是由ehd5引起的(圖5)。
75.用傳統雜交或者轉基因編輯的方法將突變基因轉入野生型材料，獲得ehd5純合基因型，具有較野生型晚抽穗的材料，可以定向調節目的品種的抽穗期。
76.本發明所涉及公知公用品種如下：
77.dongjin(公知公用品種，粳稻品種)
78.ehd5晚抽穗突變體(由粳稻品種dongjin組培誘變獲得)；nipponbare(公知公用品種，粳稻品種)。