一種優化的蒙藥阿給issr分子標記方法

2024-04-07 14:29:05

專利名稱：：一種優化的蒙藥阿給issr分子標記方法
技術領域：
：本發明涉及分子生物學領域，具體地，涉及一種優化的蒙藥阿給ISSR分子標記方法。
背景技術：
：蒙藥阿給[Agi]——冷蒿(ArtemisiafrigidaWilld.)，又名小白蒿、菟毛蒿，為菊科蒿屬的小灌木[1]。阿給為蒙醫常用藥，具有止血、消腫之功效，臨床上主治各種出血、關節腫脹、腎熱、月經不調、瘡痛等，也是蒙醫上常用的「人造聖水組成之一」。隨著DNA分子標記技術的發展，人們已將這一技術廣泛地應用於傳統藥材資源、鑑定、栽培等方面。阿給的分子生物學水平的研究很少，且都不是作為藥物進行研究。目前僅獲得了5條DNA序列，它們是小白蒿葉綠體的leu-tRNA基因的片段以及核糖體rRNA基因片段，主要用來分辨各個植物之間的差別。王靜等人檢測了阿給作為牧草在不同放牧壓力下群體的遺傳多樣性變化。由於阿給是風媒異花受粉，在時間上和空間上有廣泛的分布，所面臨的環境差異大，個體和種群數目多，基因交流頻繁，因此產生新的遺傳變異的機會多，這有利於其增加遺傳多樣性水平，並使之保持較高的水平(多態位點百分率為94.49%),高於高等植物平均遺傳多樣性水平為70%。遺傳多樣性隨著放牧強度的不同也有所不同。加強蒙藥阿給的分子生物學水平的研究，無疑為其種子種苗研究、資源保護、功效應用等提供了堅實的理論基礎。ISSR(Inter-SimpleSequenceR印eat，簡單重複序列)分子標記是20世紀90年代發展起來的一種新技術，基本原理是利用在植物基因組中常出現的SSR本身設計引物，對位於反向排列的SSR之間的DNA序列進行PCR擴增。ISSR呈孟德爾式遺傳，為顯性標記，穩定性高，技術簡單、快速、成本低廉。由於SSR在真核生物中分布非常普遍，且串聯重複的數目是可變的，呈高度多態性，因此ISSR標記技術可以檢測基因組許多位點的差異。目前該技術在植物的指紋圖譜、遺傳多樣性、遺傳作圖和基因定位研究中得到了廣泛應用。
發明內容本發明的目的是提供一種優化的蒙藥阿給ISSR分子標記方法。本發明的優化的蒙藥阿給ISSR分子標記方法包括以下步驟1)提取阿給的基因組DNA；2)進行ISSR擴增，其中，所述ISSR擴增的反應體系為20μ反應體系中含有10XPCR緩衝液2yL，模板DNA50ng,此外，Mg2+為1.5mmol·ΛdNTP為0.25mmol·ΛTaq酶為1.5U,引物為0.75μmo1·lA所述ISSR擴增的條件為94°C退火5min，然後94°Clmin、56°C40s、72°Clmin30s40個循環，最後72°C延伸5min,其中，所述引物序列如以下所示。弓丨物序列(5，-3，)UBC807AGAGAGAGAGAGAGAGTUBC810GAGAGAGAGAGAGAGATUBC811GAGAGAGAGAGAGAGACUBC823TCTCTCTCTCTCTCTCCUBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYTUBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYTUBC841GAGAGAGAGAGAGAGAYCUBC845CTCTCTCTCTCTCTCTRGUBC857ACACACACACACACACYGUBC864ATGATGATGATGATGATGUBC873GACAGACAGACAGACAUBC887DVDTCTCTCTCTCTCTC本發明所建立的蒙藥阿給ISSR反應體系擴增出的條帶具有多態性高、特異性強、背景清楚及穩定性強的優點。圖1為正交試驗設計ISSR-PCR反應體系的擴增結果，1_9為表3的處理組合編號；引物為UBC807圖2為12個不同引物的ISSR擴增結果，M:100bpladder；1.UBC807；2.UBC810；3.UBC811；4.UBC823；5.UBC834；6.UBC840；7.UBC841,8.UBC845；9.UBC857；10.UBC864；11.UBC873；12.UBC887。圖3為ISSR-PCR反應體系中不同退火溫度的擴增結果，1.52.0°C；2.52.3°C；3.52.90C；4.53.8°C；5.55.0°C；6.56.0°C；7.56.6°C；8.57.0°C；M:100bpladder；引物為UBC807。圖412個不同引物的ISSR擴增，1-12選用引物分別是UBC807、UBC810、UBC811、UBC823、UBC834、UBC840、UBC841、UBC845、UBC857、UBC864、UBC873和UBC887；MIOObpladder。圖5ISSR-PCR反應體系中不同循環數的擴增結果，1-4分別表示所用循環數目為30個循環、35個循環、40個循環和45個循環；MIOObpladder；引物為UBC807。具體實施例方式實施例1提取阿給基因組DNA。1、擴增體系的篩選正交優化設計篩選ISSR的最優反應體系(四因素三水平)，選用L9(34)正交表，設計PCR擴增體系各成分的因素-水平正交設計實驗表(方案見表2及表3)。以UBC807為引物，利用表3中的9個體系，對阿給進行ISSR擴增。反應體系為20μL，除表中所列因素外，每管含有IOXPCRbuffer2μL，模板DNA50ng。初擴增程序為4°C預變性5min;94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸1.5min，循環45次；72°C延伸5min，4°C保存。表1ISSR擴增引物和序列_引物序列(5，-3，)PrimerPrimersequences(5，_3，)_UBC807AGAGAGAGAGAGAGAGTUBC810GAGAGAGAGAGAGAGATUBC811GAGAGAGAGAGAGAGACUBC823TCTCTCTCTCTCTCTCCUBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYTUBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYTUBC841GAGAGAGAGAGAGAGAYCUBC845CTCTCTCTCTCTCTCTRGUBC857ACACACACACACACACYGUBC864ATGATGATGATGATGATGUBC873GACAGACAGACAGACAUBC887DVDTCTCTCTCTCTCTC_表2ISSR-PCR反應體系的因素與水平『S^if平(體系終濃度J3,Mg2+Zmmol·L'11.52.02.5dNTP/mmol·L"10J502025TaqDNA聚合酶/(U·之。+·1)0.51.01.5引物/μιηο·L'1_025_05_0.75表3ISSR-PCR反應體系的正交試驗設計[L9(34)]tableseeoriginaldocumentpage6參照何正文等的方法，對電泳條帶的強弱和雜帶的多少做直接分析。從圖1可以看出，在9個處理組合中，由於Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物4種影響因素組合的不同，擴增效果存在著明顯差異。第1、6號處理擴增效果較差，譜帶弱且多態性低，第3號處理效果最好，譜帶強，多態性高。因此獲得的最佳ISSR擴增反應體系為反應總體積為20μL，Mg2+為1.5mmol·ΛdNTP為0.25mmol·ΛTaqDNA聚合酶為1.5U，引物為0.75μmol·Γ1。採用優化後的體系，以相同的DNA模板，以UBC807，UBC810，UBC811，UBC823，UBC834，UBC840，UBC841，UBC845，UBC857，UBC864，UBC873，UBC887為引物，進行ISSR擴增，能夠擴增出清晰且穩定性好的條帶，多態性高(圖2)。說明該反應體系適合於阿給ISSR-PCR反應。2、擴增條件的篩選1)根據電泳結果，選用體系3為阿給ISSR反應條件。即在20μL反應體系中，Mg2+為1.5mmol·ΛdNTP為0.25mmol·ΛTaqDNA聚合酶為1.5U，引物為0.75μmol·Λ此外，每個反應體系中含有2μL10XPCRbuffer2μL，模板DNA為50ng，不足體積用滅菌的雙蒸水補足。2.1退火溫度的篩選在上述試驗確定的最佳反應體系基礎上，對退火溫度進行梯度試驗，優化篩選最佳退火溫度，根據在引物理論退火溫度上下波動2-4°C的原則，在PCR梯度擴增儀上設置最小退火溫度為52°C，最大為57°C，PCR儀自動形成8個梯度，即52.0°C>52.3°C>52.9°C、53.8°C>55.0°C>56.0°C>56.6°C>57.0°C。從圖3可以看出當退火溫度為52.0-53.8°C時，產生的條帶不清晰，而當退火溫度高於56.0°C時，產生雜帶。因而認為UBC807引物的退火溫度為56°C較為合適。使用引物UBC810；3.UBC811；4.UBC823；5.UBC834；6.UBC840；7.UBC841,8.UBC845；9.UBC857；10.UBC864；11.UBC873；12.UBC887，以56°C退火溫度進行擴增，擴增結果如圖4所示，產生的條帶清晰。2)循環數的確定根據正交實驗及退火溫度篩選的結果，進行循環數的確定。循環數依次為30，35，40，45。每個循環設2個重複。根據正交試驗及退火溫度的結果，選擇最佳退火溫度進行循環數的檢測。從圖5可以看出當循環數為30，35時，條帶不清晰，循環數為40，45時，條帶較清晰，且無雜帶，從節約時間和成本的角度考慮，選擇循環數40較為合適。結論利用正交試驗設計，從Mg2+濃度、dNTP濃度、TaqDNA酶濃度和引物濃度4因素3水平，對蒙藥阿給ISSR-PCR反應體系進行優化分析，並在此基礎上對PCR的循環數及退火溫度進行試驗。結果表明，20μL反應體系中，Mg2+為1.5mmol·L—1，dNTP為0.25mmol·ΛTaqDNA酶為1.5U，引物為0.75μmol·L—1時，且ISSR最適的循環數為40，最適退火溫度為56°C，擴增效果最好。為阿給遺傳多樣性的進一步研究奠定技術基礎。權利要求一種優化的蒙藥阿給ISSR分子標記方法，所述方法包括以下步驟1)提取阿給的基因組DNA；2)進行ISSR擴增。其中，所述ISSR擴增的反應體系為20μL反應體系中含有10×PCR緩衝液2μL，其中Mg2+為1.5mmol·L-1，模板DNA50ng，dNTP為0.25mmol·L-1，Taq酶為1.5U，引物為0.75μmol·L-1。所述ISSR擴增的條件為94℃退火5min，然後94℃1min、56℃40s、72℃1min30s40個循環，最後72℃延伸5min。其中，所述引物序列如以下所示引物序列5』-3』UBC807AGAGAGAGAGAGAGAGTUBC810GAGAGAGAGAGAGAGATUBC811GAGAGAGAGAGAGAGACUBC823TCTCTCTCTCTCTCTCCUBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYTUBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYTUBC841GAGAGAGAGAGAGAGAYCUBC845CTCTCTCTCTCTCTCTRGUBC857ACACACACACACACACYGUBC864ATGATGATGATGATGATGUBC873GACAGACAGACAGACAUBC887DVDTCTCTCTCTCTCTC。全文摘要本發明涉及分子生物學領域，具體地，涉及一種優化的蒙藥阿給ISSR分子標記方法。根據本發明的優化的蒙藥阿給ISSR分子標記方法包括以下步驟1)提取阿給的基因組DNA；2)進行ISSR擴增，其中，所述ISSR擴增的反應體系為20μL反應體系中含有10×PCR緩衝液2μL，模板DNA50ng，此外，Mg2+為1.5mmol·L-1，dNTP為0.25mmol·L-1，Taq酶為1.5U，引物為0.75μmol·L-1。所述ISSR擴增的條件為94℃退火5min，然後94℃1min、56℃40s、72℃1min30s40個循環，最後72℃延伸5min。本發明所建立的蒙藥阿給ISSR反應體系擴增出的條帶具有多態性高、特異性強、背景清楚及穩定性強的優點。文檔編號C12Q1/68GK101818197SQ201010108950公開日2010年9月1日申請日期2010年2月8日優先權日2010年2月8日發明者馮金朝,劉越,周宜君,孫洪波,張淑萍,張琳霞,王俊麗,王斌,王真,申剛義,韋善君,高飛申請人:中央民族大學