可線性化穿梭載體BmBacmid的構建方法
2024-04-08 13:35:05 3
專利名稱：可線性化穿梭載體BmBacmid的構建方法
技術領域：
本發明屬於生物技術中利用基因工程方法載體構建的技術領域。
背景技術：
家蠶是一種重要的經濟動物，具有易於飼養、成本低廉等特點。以家蠶作為宿主的杆狀病毒表達系統表達外源蛋白的產量高、成本低且質量好，因此具有廣闊的市場開發前景。並且，這種表達系統安全性好，外源基因表達水平高，並可進行翻譯後加工，是一種比較理想的真核表達系統，因此該系統已得到非常廣泛的應用。通過改造杆狀病毒載體，該系統在重組病毒的構建效率、外源基因的表達水平和表達通量方面不斷得到提升。其中，以核型多角體病毒BmNPV為載體的家蠶杆狀病毒表達系統也先後發展出可線性化病毒載體、Bacmid穿梭載體，但這些載體均無法用於外源基因的高通量表達。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種可線性化穿梭載體BmBacmid的構建方法，本發明所得的BmBacmid既可作為Bac-to-Bac系統的穿梭載體使用，也可作為一種線性化病毒載體使用，並可用於建立一套新型的BmNPV高通量載體表達系統。為了解決上述技術問題，本發明提供一種可線性化穿梭載體BmBacmid的構建方法，包括如下步驟1)、構建pBacAvrII2載體在pBacPAK8載體上引入限制性內切酶位點FseI和AvrII ；從而構建成含兩個AvrII位點的轉移載體PBacAvrII2 (即，PBacAvrII2載體)；2)、構建含細菌人工染色體BAC的pBACAvrII2載體設計一對兩端含FseI位點的引物，從DHlOBac Bacmid上擴增細菌人工染色體BAC片段，插入到pBacAvrII2中；得到pBACAvrII2載體；3)、家蠶杆狀病毒表達載體-----可線性化穿梭載體BmBacmid的構建以pBACAvrII2載體為模板，PCR擴增BAC的片段，BAC的片段含兩個AvrII和FseI酶切位點、且片段兩端為多角體基因側翼序列，然後將PCR產物和線性化的BmBacPAK共轉染家蠶細胞，在家蠶細胞內通過同源重組產生重組病毒，從而獲得BmBacmid載體，所述BmBacmid載體為可線性化穿梭載體BmBacmid。作為本發明的可線性化穿梭載體BmBacmid的構建方法的改進步驟1)為PBacAvrII2載體是在pBacPAK8載體的基礎上進行改造，成功引入兩個AvrII位點；依次進行以下步驟①、第一個AvrII位點的引入，構建pBacAvrlll載體對轉移載體pBacPAKSDNA多角體基因啟動子3'端側翼的orfl6^基因進行定點突變，將TTTAGG突變為CCTAGG，為AvrII位點，從而在SnaBI和SwaI之間，即在orf 16 基因的3'端引入第一個AvrII酶切位點；
②、第二個AvrII位點的引入，構建pBacAvrII2載體在pBacAvrlll載體DNA上的EcoRV和BamHI位點之間引入一段DNA序列；序列包含FseI和AvrII兩個酶切位點，從而構建成含兩個AvrII位點的轉移載體pBacAvrII2。作為本發明的可線性化穿梭載體BmBacmid的構建方法的進一步改進步驟3)為依次進行以下步驟①、擴增pBACAvrII2載體中BAC片段為了使BAC片段能與線性化BmBacPAK同源重組，故從pBACAvrII2上擴增兩端含多角體基因側翼序列的BAC片段；以pBACAVrII2為模板，用KOD-FX DNA聚合酶PCR擴增合成BAC片段；②、線性化BmBacPAK製備家蠶杆狀病毒BmBacPAK先經蛋白酶K消化後通過苯酚氯仿抽提獲得病毒DNA，所述病毒BmBacPAK DNA含有三個Bsu36I酶切位點，故通過Bsu36I酶切進行線性化，得到Bsu36I 線性化的 BmBacPAK DNA ；③、BmBacmid 的構建將上述步驟①中PCR產物與上述步驟②所得的Bsu36I線性化的BmBacPAK DNA按照2 1的分子數之比共轉染家蠶BmN細胞，待細胞完全病變後收集培養上清分離病毒，並提取病毒基因組DNA ；以病毒基因組DNA電轉化ElectroMAX DHlOB感受態細胞，塗含Kan、IPTG和X_gal的LB平板培養Mh，挑取狀態良好的藍斑接種LB液體培養基，振蕩培養48小時後提取Bacmid DNA ；將提取的Bacmid DNA轉染家蠶細胞，產生細胞病變的即為可線性化穿梭載體BmBacmid0綜上所述，本發明首先提供了 pBaCAVrII2轉移載體(即，pBaCAVrII2載體)的構建方法首先在pBacPAK8多克隆位點上遊EcoRV和BamHI位點之間引入限制性內切酶位點FseI和AvrII (第一個)；第二步對多角體基因啟動子3『端側翼的orf 16 基因進行定點突變，即在其基因的3'端引入另外一個AvrII位點(第二個)，從而構建成含兩個AvrII位點的轉移載體pBacAvrII2。本發明還提供了 pBACAVrII2的構建方法首先，設計引物(含FseI位點)利用PCR從商品化的DHlOBac Bacmid上擴增細菌人工染色體BAC片段，插入到pBacAvrII2中，從而構建含細菌人工染色體的轉移載體pBACAvrII2。本發明還構建了一種新型家蠶杆狀病毒穿梭載體BmBacmid 首先以pBACAvrII2為模板，PCR擴增合成兩端為多角體基因側翼序列，中間為BAC的片段(含兩個AvrII和FseI酶切位點)，然後將此PCR產物和線性化的BmBacPAK DNA共轉染家蠶細胞BmN，在家蠶細胞內通過同源重組產生重組病毒，從而獲得BmBacmid載體。本發明所構建的BmBacmid載體既能線性化後同源重組構建重組病毒表達蛋白，又可作為穿梭載體構建重組病毒表達蛋白。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是重組質粒pBacAvrlll的鑑定5
左圖M. 1 kb DNA Ladder ；1. AvrII酶切重組質粒pBacAvrlll ；右圖為測序結果。圖2是重組質粒pBaCAvrII2的鑑定圖；左圖M.Low DNA Ladder ；1. BamHI和AvrII雙酶切重組質粒pBacAvrII2 ；2. EcoRV酶切重組質粒pBaCAvrII2 ；3. AvrII酶切重組質粒pBacAvrII2 ；右圖為測序結果圖。圖3是PCR擴增結果圖。圖 4 是 BmBacPAK 的圖譜。圖5是BmBacPAK的線性化圖。圖6是PCR和酶切鑑定圖，左圖PBacPAK8-AcGFP；右圖pFastBac HTB-AcGFP。圖7是共轉染後家蠶細胞的螢光情況圖；A.透射光下線性化BmBacmid和PBacPAK8_AcGFP共轉染的家蠶細胞；B. B.螢光顯微鏡下線性化BmBacmid和pBacPAK8_AcGFP共轉染的家蠶細胞。圖8是BmBacmid-AcGFP轉染家蠶細胞後的螢光情況圖；A.透射光下轉染BmBacmid-AcGFP的家蠶細胞；B.螢光顯微鏡下轉染BmBacmid-AcGFP的家蠶細胞。
具體實施例方式實施例1、pBacAvrII2載體的構建PBacAvrII2載體是在pBacPAK8載體的基礎上進行改造，成功引入兩個AvrII位點。分兩步進行如下(1)第一個AvrII位點的引入，構建pBacAvrlll載體對載體pBacPAK8DNA多角體基因啟動子3'端側翼的orf 16 基因進行定點突變，將TTTAGG突變為CCTAGG——即AvrII位點，從而在SnaBI和SwaI之間，即在orfl6^基因的3'端引入第一個AvrII酶切位點。設計引物如下Pl 5 『 -CGGTACGTATTTTAATAATTCATTAAATTTATAATCCCTAGG-3 『(下劃線部分為AvrII位點)P2 5' -GAGGATTTAATATTTAAATTCAG-3『；以pBacPAK8 DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系為
權利要求
1.可線性化穿梭載體BmBacmid的構建方法，其特徵是包括如下步驟1)、構建pBacAvrII2載體在pBacPAK8載體上引入限制性內切酶位點FseI和AvrII； 從而構建成含兩個AvrII位點的轉移載體pBacAvrII2 ；2)、構建含細菌人工染色體BAC的pBACAvrII2載體設計一對兩端含FseI位點的引物，從DHlOBac Bacmid上擴增細菌人工染色體BAC片段，插入到pBacAvrII2中；得到pBACAvrII2載體；3)、家蠶杆狀病毒表達載體——可線性化穿梭載體BmBacmid的構建以pBACAVrII2載體為模板，PCR擴增BAC的片段，所述BAC的片段含兩個AvrII和 FseI酶切位點、且片段兩端為多角體基因側翼序列，然後將PCR產物和線性化的BmBacPAK 共轉染家蠶細胞，在家蠶細胞內通過同源重組產生重組病毒，從而獲得BmBacmid載體，所述BmBacmid載體為可線性化穿梭載體BmBacmid。
2.根據權利要求1所述的可線性化穿梭載體BmBacmid的構建方法，其特徵是所述步驟1)為PBacAvrII2載體是在pBacPAK8載體的基礎上進行改造，成功引入兩個AvrII位點；依次進行以下步驟①、第一個AvrII位點的引入，構建pBacAvrlll載體對轉移載體PBacPAKSDNA多角體基因啟動子3'端側翼的orf 16 基因進行定點突變， 將TTTAGG突變為CCTAGG，為AvrII位點，從而在SnaBI和SwaI之間，即在orf 16 基因的 3'端引入第一個AvrII酶切位點；②、第二個AvrII位點的引入，構建pBacAvrII2載體在pBacAvrlll載體DNA上的EcoRV和BamHI位點之間引入一段DNA序列；所述序列包含FseI和AvrII兩個酶切位點，從而構建成含兩個AvrII位點的轉移載體pBacAvrII2。
3.根據權利要求2所述的可線性化穿梭載體BmBacmid的構建方法，其特徵是所述步驟幻為依次進行以下步驟①、擴增pBACAvrII2載體中BAC片段為了使BAC片段能與線性化BmBacPAK同源重組，故從pBACAVrII2上擴增兩端含多角體基因側翼序列的BAC片段；以pBACAVrII2為模板，用KOD-FX DNA聚合酶PCR擴增合成 BAC片段；②、線性化BmBacPAK製備家蠶杆狀病毒BmBacPAK先經蛋白酶K消化後通過苯酚氯仿抽提獲得病毒DNA，所述病毒BmBacPAK DNA含有三個Bsu36I酶切位點，故通過Bsu36I酶切進行線性化，得到Bsu36I 線性化的BmBacPAK DNA ；③、BmBacmid的構建將上述步驟①中PCR產物與上述步驟②所得的Bsu36I線性化的BmBacPAK DNA按照 2 1的分子數之比共轉染家蠶BmN細胞，待細胞完全病變後收集培養上清分離病毒，並提取病毒基因組DNA ；以病毒基因組DNA電轉化ElectroMAX DHlOB感受態細胞，塗含Kan、IPTG和X_gal 的LB平板培養Mh，挑取狀態良好的藍斑接種LB液體培養基，振蕩培養48小時後提取 Bacmid DNA ；將提取的Bacmid DNA轉染家蠶細胞，產生細胞病變的即為可線性化穿梭載體BmBacmid0
全文摘要
本發明公開了一種可線性化穿梭載體BmBacmid的構建方法，包括如下步驟1)構建含兩個AvrII位點的pBacAvrII2載體；2)構建含細菌人工染色體BAC的pBACAvrII2載體設計一對兩端含FseI位點的引物，從DH10Bac Bacmid上擴增細菌人工染色體BAC片段，插入到pBacAvrII2中；得到pBACAvrII2載體；3)可線性化穿梭載體BmBacmid的構建以pBACAvrII2載體為模板，PCR擴增BAC的片段，然後將PCR產物和線性化的BmBacPAK共轉染家蠶細胞，在家蠶細胞內通過同源重組產生重組病毒，從而獲得可線性化穿梭載體BmBacmid。
文檔編號C12N7/01GK102559760SQ201210037290
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月17日 優先權日2012年2月17日
發明者呂正兵, 張耀洲, 陳倩, 陳健, 陳琴 申請人:浙江理工大學