治療多囊病的方法和組合物的製作方法

2024-01-28 11:26:15

專利名稱：：治療多囊病的方法和組合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及多囊疾病領域及涉及該疾病的診斷和治療。
背景技術：
：常染色體顯性遺傳性多囊腎病(ADPKD)是最常見的遺傳性腎病，發病率為1:1000個體，其特徵表現為在所有腎小管中的病灶囊腫形成(Friedman,J.CysticDiseasesoftheKidney,InPRINCIPLESANDPRACTICEofMEDICALGENETICS(A.EmeryandD.Rimoin，Eds.)pp.1002-1010,ChurchillLivingston,Edinburgh,U.K.(1983);Striker&Striker(1986)Am丄Nephrol.6:161-164.腎外症狀包括肝和胰腺囊腫，及心血管併發症。Gabow&Gr肌tham(1997)PolycysticKidneyDisease,inDISEASESOFTHEKIDNEY(R.Schrier&C.Gottschalk，Eds.)，PP.521-560,LittleBrown,Boston;Welling&Grantham(1996)CysticDiseasesofthekidney,inRENALPATHOLOGY(C.Tisch&B.Brenner,Eds.)pp:1828-1863,Lippincott，Philadelphia。目前為止，僅PKD1和PKD2被認為是與這些細胞異常有關的分子。'據報導，PKD1和PKD2分別佔導致這些疾病的原因的85%和15%。Burn,etal.(1995)Hum.Mol.Genet.4:575-582。儘管在對ADPKD在遺傳性和病理生理方面的了解已經取得了顯著的進步，但是對於疾病形成基因引發囊腫形成的突變如何進行和其它分子在囊腫表型中起到什麼樣的重要作用仍然是不清楚的。因此，需要表徵參與囊腫表型的生物化學途徑，並能找出另外的治療靶點。本發明可以滿足這樣的需要，並能提供相關改進。
發明內容本發明通過修飾下述表2到6中所列的至少一個基因的生物活性來診斷和治療腎囊腫病的組合物和方法。這裡使用的術語"腎囊腫病"包括(但不限於)大量疾病，包括多囊腎病、vonHippel-Lindau、結節性硬化(tuberosclerosis)、腎消耗病、常染色體顯性遺傳多囊腎病(ADPKD)、常染色體隱性遺傳多囊腎病(ARPKD)和獲得性腎囊腫(ACKD)。僅作為舉例說明，組織生長因子a(TGF-a)基因或其表達產物為下述表2到6中所列基因中的一個例子。因此，儘管下面要進行的討論和實施例大多數是涉及TGF-a基因和其生物等同物，但本發明並不限於此。該申請涉及的發明包括表2到6中所列的任一個基因，將它們作為治療和藥物幹預的靶點；TGF-a僅是這些耙點中的一個。因此，應該理解的是，儘管沒有詳細說明，表2到6中所列的任何一個基因都可代替本發明使用的術語"TGF-a，'。一方面，本發明提供了一種修飾表2到6中所列的至少一個基因的生物活性的方法，通過將有效量的修飾劑和分子與需要治療的細胞或組織接觸。該方法中使用的合適的修飾劑包括但不限於小分子、核酶(ribozyme)、反義寡核苷酸、雙鏈RNA、雙鏈幹擾RNA(SiRNA)、三鏈RNA、RNA適配物，和結合到基因產物上並抑制其活性的抗體分子的至少一部分。所述這樣抗體部分的例子包括但不限於完整的抗體分子、單鏈可變區(ScFv)、單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。所述抗體可以在任何合適的體內或體外系統中產生，如猿、小鼠、大鼠或人。合適的抗TGF-a抗體可從Sigma(E3138)、Calbiochem(Ab畫2)、OncogeneScience(GF10或Clone213-9.4)和PeninsulaLaboratories(IHC8040)商業獲得。所述抗體可任選地結合到細胞毒素部分、治療部分、可檢測部分或抗囊腫製劑上。一方面，所述製劑或分子先被分離，然後再被傳遞。本發明還提供了治療或改善異常囊機能障礙和與組織中囊形成相關的疾病的組合物和方法。所述方法和組合物通過抑制如TGF-.a基因表達、TGF-d受體基因表達或其基因表達產物的生物活性來治療和改善組織中病理性膽囊的形成。根據本發明的另一實施方案，本發明還提供了治療、抑制或改善與常染色體顯性遺傳多囊腎病(ADPKD)相關的症狀的方法。該方法需要向需要治療的病人給藥有效量的抑制劑或分子，如抗TGF-ct抗體，以抑制TGF-a基因、其受體或其表達產物的多囊生物學活性。一方面，所述藥物或分子先被分離，然後再被傳遞。另一方面，在由於基因低表達而導致疾病或症狀發生的部位，向該部位給藥能增強表達的基因或其表達產物(多肽)。這種藥物是本領域已知的，包括但不限於，編碼肽或多肽本身的多聚核苷酸。本發明還提供了通過檢測基因表達水平或其表達產物來幫助診斷存在於組織中的囊異常的方法。該方法可用於幫助診斷ADPKD相關腎囊腫和其它器官中存在的囊性異常(這些症狀通常在ADPKD中出現)，所述器官包括肝、胰腺、脾和卵巢。此外，通過在異常囊腫形成之前檢測蛋白質或多聚核苷酸的過表達或低表達，人們可預測患ADPKD的傾向，並及早診斷和/或治療。本發明進一步提供的是實施所述診斷和預測方法的組合套裝(kit)。該組合套裝含有用於這些方法的組合物和使用說明。本發明還提供了用於所述治療和診斷方法的組合物。一方面，該組合物含有包含抗體可變區的分子，所述抗體可變區特異性地結合到TGF-a蛋白質(如，SEQIDNO:2)上或其細胞表面受體上。表皮生長因子受體(EGFR)是已知的TGF-a受體。Solari等人(2004)Ped.Surg.Int.20:243-247。SEQIDNO:3和4分別表明了EGFR的多聚核苷酸和多肽序列。在治療和診斷使用中，分子可為例如，完整的抗體分子、單鏈可變區(ScFv)、單克隆抗體、嵌合的或人源化抗體。抗體可在細胞培養物、在噬菌體中或在各種動物中產生，所述動物包括但不限於牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、綿羊、狗、貓、猴子、黑猩猩、猿，等等。所述分子可任選地結合到細胞毒素部分、治療部分、可檢測部分或抗囊腫製劑上。.在另一方面，本發明提供了抑制TGF-d基因或受體基因表達的核酸分子。這裡所述的核酸包括但不限於核酶、反義寡核苷酸、雙鏈RNA、iRNA、三鏈RNA、RNA適配物。一方面，所述核酸以分離的形式被傳遞。所述核酸可從動物中分離出來，或者，可在任何合適的重組系統中經重組性產生，所述重組系統為例如細菌、酵母菌、杆狀病毒(baculoviral)或哺乳動物。另一方面，本發明提供了能提髙、支持、增強或增加基因表達或其轉錄和/或翻譯產物核酸分子。這裡所述的核酸分子包括但不限於核酶、反義寡核苷酸、雙鏈RNA、iRNA、三鏈RNA或RNA適配物。一方面，所述核酸以分離的被傳遞。所述核酸可從動物中分離出來，或者，可在任何合適的重組系統中經重組產生，所述重組系統為例如細菌、酵母菌、杆狀病毒或哺乳動物。本發明的又一方面是提供了一種鑑定參與TGF-ci相關囊腫形成的TGF-a結合配體的方法。將測試化合物或藥物，如抗體或抗體衍生物與在合適樣品中的TGF-ci蛋白或其片段在有利於與TGF-a結合的條件下接觸。如果發生配體結合，則將被檢測出。與蛋白結合的測試化合物或藥物被認為是TGF-a囊腫調節中的配體。抑制TGF-cc與其受體結合的測試化合物或藥物被認為是可參與TGF-a囊腫調節並可作為治療劑的候選者。一方面，所述治療和診斷藥用於與其它製劑聯合使用。這些製劑或分子與其它藥物或治療劑的共同給藥可收到出人意料的協同治療益處。在這個共同給藥方法中，所述製劑或分子通過減少劑量也用於減小已知療法和治療藥的有害副作用，及那些待發現的療法和治療藥的有害副作用。一方面，這種有效組合的使用是要提供這樣的治療組合該組合所需的每種成分的總劑量比單獨使用每個治療方法、化合物或藥物時所使用的劑量要低，從而減少有害副作用。因此，本發明也包括涉及本發明所述化合物與一種或多種其它活性製劑或方法共同給藥的方法。實際上，本發明的另一方面是提供通過共同給藥本發明化合物來提高其它療法和/或藥物組合物的療效的方法。在共同給藥方法中，製劑可以被同時給藥或先後給藥。在一個實施方案中，本發明所述化合物在給藥其它活性製劑物、進行其它一種或多種治療進行給藥。藥物劑型和給藥模式可以是本發明所描述的或本領域技術人員已知的那些中的任何一個。本發明的另一實施方案是確定用來治療囊腫性損傷的候選藥物的方法，該方法是通過將表達TGF-ct基因或其受體配體基因的細胞與測試化合物或藥物接觸。如果某測試化合物減少TGF-a基因或編碼其受體配體的基因的表達，則該化合物就被認為是用來治療囊腫異常的候選藥物。可以通過本領域已知的任何方法來檢測和量化表達，如逋過將細胞或組織的mRNA與核酸探針雜交，所述核酸探針與TGF-a或受體配體mRNA是互補的。能減少表達的測試化合物或製劑被認為是用來治療異常囊腫形成的候選藥物。發明人還提供了一種組合套裝用來測定病態細胞或病人是否適合於用本發明描述的一種或多種治療劑進行治療。此外，還提供了能實施測試的組合套裝。這些藥盒含有本發明所述的至少一種組合物及使用說明書。圖1是12組表明多克隆中和抗TGF-ct抗體在體外抑制囊腫形成的圖。表的簡要說明表1是篩選到的SAGE文庫的匯總。其總結了全部的測序標記和單獨標記。表2列出了在囊腫性肝臟(CL)中前20個上-和下-調基因。其中給出了這20個下-(頂部)或上調(底部)標記(10個鹼基長)及它們在正常肝臟(NL)或囊腫性肝臟(CL)上皮細胞的文庫中的數量、Genebank註冊號、基因命名和HUGO分配。標籤的第11個鹼基的給出是為了當10鹼基的標記具有數個Unigene相配物時來幫助區別這些基因。表3列出了在囊腫性腎臟(CK)中的前20個上-和下-調基因。這20個下-或上-調標記及它們在正常腎臟(NL)或囊腫性腎臟髒(CK)中的數量及其它的內容，如表2中所列。表4列出了在肝臟和腎臟上皮細胞中的大於常見的5倍的(>5xcommon)上調基因。在CK和CL中上調的常見基因也在此給出，以及10個鹼基標記序列、第11個鹼基、CL/NL和CK/NK比率、Genebank註冊號、基因描述和相應的HUGO命名。表5A和5B列出了在囊腫疾病中過度表達基因的功能組。表5A列出了在CL中上調基因的功能組。表5B列出了在CK中上調基因的功能組。表6列出了在CL中過度表達的其餘的基因。具體實施例方式在整個公開中，各種出版物、專利和公開的專利說明書通過引用作為參考。這些出版物、專利和公開的專利說明書所公開的內容在此通過參考併入本發明中以便更充分地描述本發明相關的技術狀態。敘除非另有說明，本發明的實施將採用免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學和重組DNA中常用的技術，這些技術在本領域的技術範疇之內。見，例如，Sambrook，FritschandManiatis,MOLECULARCLONING:ALARBORATORYMANUAL,2ndedition(1989);CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel，etal.eds.，(1987));theseriesMETHODSINENZYMOLOGY(AcademicPress,Inc.):PCR2:APRACTICALAPPROACH(M丄MacPherson，B.D.HamesandGR.Tayloreds.(1995》，HarlowandLane,eds,(1988)ANTIBODIES,ALABORATORYMANUAL,HarlowandLane,eds.(1999)USINGANTIBODIES,ALABORATORYMANUAL和ANIMALCELLCULTURE(R丄Freshney,ed.(1987))。這裡所使用的某些術語具有下述定義的含義。除非上下文中清楚地說明，否則在說明書和權利要求書中所使用的單數形式的和特指形式的名詞包括其複數形式。例如，術語"細胞"包括多個細胞，包括這些細胞的混合物。這裡所使用的術語"包含"是指所述組合物和方法包括所敘述的成份，但是不排除還包括其它成份。當使用"基本由...組成"來定義組合物和方法時，其是指排除對組合來說非常明顯的其它成份。因此，基本由本發明定義的成分組成的組合物不排除來自分離和純化方法中的痕量汙染物和藥學可接受的載體，如磷酸鹽緩衝的食鹽水、防腐劑，等等。"由...組成"是指排除其它成分和用以給藥本發明組合物的主要方法步驟中的痕量物質。經這些過渡術語中的每一個確定的具體實例在本發明的範圍內。所有數字形式的定義，如pH、溫度、時間、濃度和分子量，包括範圍都是近似值，以變量O.l(+)或(-)變化。儘管沒有總是明確說明，但是應當理解的是所有的數字形式的定義都應在其前面加上術語"約"。儘管沒有總是明確說明，但是應當理解的是，本發明中公開的試劑僅僅是舉例說明，其等同物是本領域已知的。術語"多肽"以其最廣泛的含義加以使用，是指兩個或多個亞單元胺基酸化合物、胺基酸類似物或仿肽(peptidomimetics)。所述亞單元可以通過肽鍵連接。在另一個實施方案中，所述亞單元可以通過其它鍵連接，如酯、醚，等等。本發明所用術語"胺基酸"是指天然和/或非天然或合成胺基酸，包括甘氨酸和D或L光學異構體，和胺基酸類似物和仿肽。三個或多個胺基酸的肽，如果肽鏈短則通常被稱為寡肽。如果肽鏈長，則該肽通常被稱為多肽或蛋白質。術語"分離"是指從組分、細胞或其它中分離出來，其中的多聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或它們的片段天然狀態時通常是結合在一起的。本發明的一方面，將分離的多聚核苷酸從3'和5'個相鄰核苷中分離出來，該多聚核苷酸與這些核苷在其固有或天然環境中通常是結合在一起的，所述環境為如在染色體中。本領域技術人員顯而易見的是，非天然生成的多聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或它們的片段不需要進行"分離"以區別於天然生成的對應物。此外，"濃縮的"、"分離的"或"稀釋的"多聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或它們的片段區別於其天然生成的相應物，因為每體積中的分子濃度或數目比其天然生成的對應斷鄰縮的"大或比"分離的"小。在一級序列方面或例如其糖基化模式不同於其天然生成相應物的多聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或它們的片段不需要以其分離形式存在，因為它們由於其一級序列，或者其它特徵如糖基化模式而不同於其天然生成的相應物而能與後者區別開來。因此，非天然生成的多聚核苷酸作為單獨的不同於經分離出的天然生成的多聚核苷酸的實施方案給出。在細菌細胞中產生的蛋白質作為單獨的實施方案給出，不同於從真核細胞中分離出的天然生成的蛋白質，在真核細胞中所述蛋白質天然產生。術語"多聚核苷酸"和"寡聚核苷酸"可相互交換使用，是指任何長度的核苷酸的聚合形式，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或它們的類似物。多聚核苷酸可以有任何三維結構，可以完成已知的或未知的任何功能。下述為多聚核苷酸的非限定性例子基因或基因片段、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多聚核苷酸、支鏈多聚核苷酸、質粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。多聚核苷酸可以包含經修飾的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果要對核苷酸結構進行修飾，該修飾可以在聚合物聚集之前或之後進行。核苷酸的序列可經非核苷酸成分斷開。多聚核苷酸可以在聚合之後進一步經修飾，如通過與標記組分結合而得到修飾。這個術語也指雙鏈和單鏈分子。除非特別提到或需要，本發明涉及多聚核苷酸的任何實施方案包括雙鏈形式和兩個互補單鏈形式中的每一個，該互補單鏈形式已知或被預測為能形成(makeup)雙鏈形式。多聚核苷酸由四個核苷酸鹼基的特定序列組成腺嘌呤(A);胞嘧啶(C);鳥嘌呤(G);胸腺嘧啶(T);當多聚核苷酸為RNA時，對應鳥嘌呤的為尿嘧啶(u)。因此，術語"多聚核苷酸序列"為多聚核苷酸分子的字母表示形式。這個字母表示形式可輸入到具有中心處理單元的電腦資料庫中，並用於生物信息應用如功能基因學和同源檢索。"基因"是指含有至少一個開放閱讀框的多聚核苷酸，其能夠在經轉錄和翻譯後編碼特定多肽或蛋白質。這裡所述的多聚核苷酸的任何一個可以用來識別與之相關的基因的更大片段或全長編碼序列。分離更大片段序列的方法是本領域技術人員已知的，其中一些在本發明中也進行了描述。"基因產物"或"表達產物"是指當基因經轉錄和翻譯後產生的胺基酸(如，肽或多肽)。"在轉錄的控制下，，是本領域熟知的術語，表明多聚核苷酸序列(通常為DNA序列)的轉錄取決於其與能有助於引發起始(或啟動)轉錄的元件進行可操作連接。"可操作連接"是指並列，其中所述要素位於能使它們起作用的位置。"基因傳遞載體"定義為能攜帶插入多聚核苷酸進入宿主細胞的任何分子。基因傳遞載體的例子是脂質體、生物相容性聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽、多糖；脂多糖；人工病毒囊膜；金屬粒子；和細菌，或病毒，如杆狀病毒、腺病毒和反轉錄病毒、噬菌體、粘粒、質粒、真菌載體和其它常用於本領域的重組載體，它們被公開用於在各種真核和原核宿主中表達，並可用於基因治療和簡單的蛋白質表達。這裡使用的"基因傳遞"、"基因轉移"等術語是指向宿主細胞中引入外源性多聚核苷酸(有時也稱作"轉基因")，不管引入的方法是什麼。這些方法包括各種已知技術，如載體-介導的基因轉移(通過，例如病毒感染/轉染，或各種其它基於蛋白或基於脂的基因轉運複合體)和能促進"裸"多聚核苷酸傳遞的技術(如電穿孔、"基因槍"傳遞和各種其它用於引入多聚核苷酸的技術)。引入的多聚核苷酸可以穩定地或短暫地停留在宿主細胞中。穩定停留往往需要引入的多聚核苷酸含有與宿主細胞相容的複製原點或者結合進入宿主細胞的複製子中，如染色體外複製子(如，質粒)或核的或線粒體的染色體。許多載體已知可以介導基因轉運到哺乳動物細胞中，正如本領域所熟知的那樣，並在本發明中有所描述。"病毒載體"定義為在體內、間接體內(exvivo)或體外重組生產的病毒或病毒顆粒，其含有要傳遞到宿主細胞中的多聚核苷酸。病毒載體的例子包括逆轉錄病毒表達載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、(X-病毒載體等。(x-病毒載體，如塞姆利基森林病毒基載體和辛德畢斯病毒基載體已經被開發出來用於基因治療和免疫治療。見，SchlesingerandDubensky，Curr.Opin.Biotechnol.(1999)5:434-439和Ying，etal.，Nat.Med.(1999)5(7):823-827。在基因轉移由逆轉錄病毒載體介導的情況下，載體構件體(vectorconstruct)是指含有逆轉錄病毒基因組或該基因組一部分的多聚核苷酸，以及治療基因。這裡使用的"逆轉錄病毒介導的基因轉移"或"逆轉錄病毒轉導"含義相同，是指憑藉進入細胞的病毒將其基因組整合入宿主細胞基因組中而將基因或核酸序列穩定轉移進入宿主細胞的方法。所述病毒可通過正常的感染機制進入宿主細胞，或經過修飾使其能與不同的宿主細胞表面受體或配體結合而進入宿主細胞。這裡使用的逆轉錄病毒載體是指能通過病毒或病毒樣進入機制將外源核酸弓I入到細胞中的病毒顆粒。逆轉錄病毒以RNA形式攜帶它們的基因信息；然而，一旦病毒感染了細胞，所述RNA就反轉錄成DNA形式，該DNA整合進入被感染細胞的基因組DNA中。經整合的DNA形式被稱為前病毒。在基因轉移由DNA病毒載體介導的情況下，如腺病毒(Ad)或腺相關病毒(AAV)，載體構件體是指含有病毒基因組或該基因組一部分的多聚核苷酸，和轉基因多聚核苷酸。腺病毒(Ads)為病毒經相對較好特徵化的同源組，包括超過50個血清型。見，例如，國際PCT申請No.WO95/27071。Ads很容易生長，不需要整合到宿主細胞基因組中。已經構建得到重組的Ad衍生的載體，特別是能減少野生型病毒重組和生成的可能性的那些載體。見，國際PCT申請Nos.WO95/00655和W095/11984。野生型AAV具有高度的感染性和特異地整合到宿主細胞基因組。見，Hermonat和Muzyczka,(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6466-6470和Lebkowski，etal.，(1988)，Mol.Cell.Biol.8:3988-3996。含有啟動子和克隆位點的載體是本領域已知的，其中在所述克隆位點多聚核苷酸可以有效連接。這樣的載體能夠體外或體內轉錄RNA，並且可以提供者處商業上購得，如Stratagen(LaJolla,CA)和PromegaBiotech(Madison,WI)。為了優化表達和/或體外轉錄，可能需要除去、加入或改變克隆物5'和/或3'未翻譯的部分以除去額外的、可能不合適的替代翻譯啟動密碼或其它可能在轉錄水平或翻譯水平幹擾或減少表達的序列。或者，共有的核糖體結合位點可被直接插入到啟動密碼的5'以提高表達。基因傳遞載體也包括若干非病毒載體，包括DNA/脂質體複合體和靶向病毒蛋白質-DNA複合體。也含有靶向抗體或其片段的脂質體也可用在本發明的方法中。為了提高向細胞的傳遞，本發明的核酸或蛋白質可結合到抗體或其結合片段上，該抗體或其結合片段結合細胞表面抗原，如TCR、CD3或CD4上。當用於多聚核苷酸操縱這一情況中，"探針"是指寡核苷酸，該寡核苷酸用作試劑，通過與靶點雜交來檢測存在在待測的樣品中的潛在的靶點。通常，探針包括標記(label)或媒介，通過該媒介，標記可以在雜交反應前或雜交後進行連接。合適的標記包括但不限於放射性同位素、螢光染料、化學發光的化合物、染料和蛋白質，包括酶。"引物，，是短的、通常具有游離的3'-OH基團的多聚核苷酸，其通過與靶點雜交而結合到存在在待測的樣品中潛在的靶點或"模板"上，然後促進與耙點互補的多聚核苷酸的聚合。"聚合酶鏈式反應"("PCR")為一種反應，其中複製品(replicatecopies)由靶點多聚核苷酸製備，通過使用"引物對"或"一套引物"，該"一套引物"由"上遊"和"下遊"引物組成，和聚合反應催化劑，如DNA聚合酶，和典型的熱穩定聚合酶。進行PCR的方法是本領域已知的，公開在例如，"PCR:APRACTICALAPPROACH"(M.MacPhersonetal.，IRLPressatOxfordUniversityPress(1991))。所有生產多聚核苷酸複製品的方法，如PCR或基因克隆在本發明中統稱為"複製"。引物也可在雜交反應中用作探針，所述雜交反應如SouthernorNorthernblot分析(S咖brooketal.，上述的)。"資料庫"這一詞表示一組儲存的數據，該數據代表序列的集合，該序列反過來代表生物相關材料的集合。術語"cDNAs"是指互補DNA，即存在在細胞或有機體中的利用酶如逆轉錄酶合成cDNA的mRNA分子。"cDNA庫"是所有存在在細胞或有機體中的mRNA的集合，所有mRNA通過逆轉錄酶轉變成cDNA分子，然後被插入到"載體"中(其它在加入外來DNA後能繼續複製的DNA分子)。用於文庫的載體的例子包括噬菌體(也稱作"噬菌體")、感染細菌的病毒，例如，X噬菌體。該文庫然後可針對待測的具體的cDNA(即mRNA)而被探針化。當"差異表達"用於基因時，其是指從基因轉錄的mRNA或由基因編碼的蛋白質產物的不同產物。與正常的或對照細胞的表達水平相比，差異表達的基因可以是被過表達的或低表達的。一方面，其是指比在對照樣品中探測到的表達水平高或低2.5倍的差異，或5倍差異，或10倍差異。術語"差異表達"也指細胞或組織中的核苷酸序列，其在對照細胞中是沉默的而表達的或在對照細胞中被表達的地方是沒有被表達的。如這裡使用的，"固相載體"或"固體載體"是可相互替換的，該定義並不限於具體的載體類型。而許多是可購得的或本領域技術人員已知的載體。固相載體包括矽膠、樹脂、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、氧化鋁膠。這裡使用的"固體載體"也包括合成的存在抗原的基質、細胞和脂質體。合適的固體載體可以根據最終用途和對各種實驗方案的適合性進行選擇。例如，對於肽合成，固體載體可以指樹脂如聚苯乙烯(如，PAM-樹脂，從BachemInc.,PeninsulaLaboratories,etc獲得)，POLYHIPE⑧樹脂(從Aminotech，Canada獲得)、聚醯胺樹脂(從PeninsulaLaboratories獲得)、接枝了聚乙二醇的聚苯乙烯樹脂(TentaGel,RappPolymere,Tubingen,Germany)或聚二甲基丙烯醯胺樹脂(從Milligen/Biosearch，Galifornia獲得)。多聚核苷酸也可被連到固體載體上以用於高通量篩選分析。例如，國際PCT申請NoWO97/10365公開了高密度寡聚核苷酸晶片的構建。也參見美國專利Nos.5，405，783、5,412,087和5,445,934。利用這個方法，在衍生的玻璃表面(也被稱作晶片陣列(chiparrays))上合成探針。將光保護的亞磷酸胺核苷偶合到玻璃表面，利用光解作用通過光刻掩膜選擇性地去保護，並與另一個經保護的亞磷酸胺核苷反應。該偶合/脫保護過程重複進行直到完成得到所需的探針。本發明使用的"表達"是指一個過程，通過該過程多聚核苷酸被轉錄成mRNA和/或一個過程，通過該過程被轉錄的mRNA接下來被翻譯成肽、多肽或蛋白質。如果所述多聚核苷酸衍生自基因組DNA，則表達可包括mRNA在真核細胞中的拼接。用於基因的"過表達"是指從基因轉錄的mRNA的過生產，或由基因編碼的蛋白質產物的過生產，比在對照樣品中探測到的表達水平要高2.5倍、或者高5倍，或者高10倍。"雜交"是指一個反應，其中一種或多種多聚核苷酸反應形成通過氫鍵穩定的複合體，該氫鍵在核苷酸殘基鹼基的之間形成。所述氫鍵可以通過Watson-Crick鹼基配對、Hoogstein結合產生，或採用任何其它序列特異性方式產生。所述複合體可以包括兩個鏈(形成雙鏈結構)，三個或更多個鏈(形成多鏈結構)，單一自雜交鏈，或它們的任意組合。雜交反應可以是一個更大的方法的一個步驟，如PCR反應的引發，或通過核酶進行的多聚核苷酸的酶斷裂反應。雜交反應可以在具有不同"嚴謹性"的條件下進行。通常，低嚴謹性雜交反應在約40'C在10XSSC中進行，或在等價離子強度/溫度的溶液中進行。適中的嚴謹性雜交典型的是在約5(TC,在6XSSC中進行，高嚴謹性雜交反應通常是在約60°C,在1XSSC中反應。當雜交以反式平行構型在兩個單鏈聚核苷酸之間發生時，該反應被稱為"退火"，這些多聚核苷酸被稱為"互補體"。如果雜交能在第一多聚核苷酸鏈中的一個與第二之間發生時，則雙鏈多聚核苷酸可以是另一個多聚核苷酸的"互補體，，或"同源體"。"互補度"或"同源性"(一個多聚核苷酸與另一個核苷酸互補的程度)可以根據鹼基在相對鏈(被認為根據普遍接受的鹼基配對原則會相互之間形成氫鍵)中的比例進行多聚核苷酸或多聚核苷酸區(或多肽或多肽區)與另一個序列具有一定的"序列相似性"百分比是指經比對後，在比較這兩個序列時，相同的鹼基(或胺基酸)的百分比，例如80%、85%、卯％、95%。這種序列比對和同源百分比或序列同一性可以通過本領域已知的軟體程序確定，例如，在CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(RM.Ausubeletal.，eds.,1987)增刊30，7.7.18節，表7.7.1中描述的那些。優選地，預設參數可以用於序列比對。優選的序列比對程序為使用預設參數的BLAST。特別地，優選程序為BLASTN和BLASTP，使用下列預設參數遺傳密碼(geneticcode)=標準(standard);過濾器(filter)二無(none);鏈(strand)-兩個都有(both);截止值(cutoff)=60;期望值(expect)=10;序列號(Matrix)=BLOSUM62;定義(Descriptions)=50個序列；sortby(按…序列)二(高分值)HIGHSCORE;資料庫(Databases)=不冗餘(non-redundant)，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+SwissProtein+SPupdate+PIR。這些程序的詳細內容可以在下述網址內找到http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。"抑制"細胞生長是指下列狀態的任何一種或所有情況緩慢、推遲和阻止腫瘤生長，和腫瘤萎縮。細胞和組織的生長可以通過本領域已知的任何方法進行評估，包括但不限於測量囊腫大小、利用311-胸腺嘧啶脫氧苷整合實驗法判定細胞是否增生，或細胞計數。"組合物"是指活性劑與另一個化合物或組合物(惰性的(例如，可檢測的試劑或標記)或活性的，如佐劑)的組合。"藥物組合物"包括活性劑和載體(惰性或活性的)的組合，使該組合物適用於體外、體內或間接體內診斷或治療用途。這裡所使用的術語"藥學可接受的載體"包括任何一個標準的藥學可接受的載體，如磷酸鹽緩衝的食鹽溶液、水，和乳液，如油/水或水/油乳液，和各種類型的潤溼劑。所述組合物還可以包括穩定劑和防腐劑。載體、穩定劑和佐劑的例子參見Martin,REMINGTON'SPHARM.SCI"15thEd.(MackPubl.Co"Easton(1975))。"有效量"是足以引起有益的或所希望的結果的量。有效量可以分一次或多次給藥，或一次或多次施用，或一個或多個劑量給藥。"受試者""個體"或"病人"在本發明中可以互換使用，是指脊椎動物，優選哺乳動物，更優選為人類。晡乳動物包括，但不限於，小鼠、大鼠、猿、人、農畜、工作動物(sportanimals)和寵物。"對照"是指實驗中對比用的受試者或樣品。對照可以是"陽性的"或"陰性的"。例如，如果一個實驗的目的是確定基因改變的表達水平與癌特定類型症的關係，則通常優選使用陽性對照(受試者或受試者的樣品攜帶這樣的改變和表現出那種疾病的症狀特徵)，和陰性對照(受試者或來自受試者的樣品缺少經改變的表達和那種疾病的臨床症狀)。表皮生長因子(EGF)和轉化生長因子(TGF-a)通過他們共同的受體-表皮生長因子受體(EGFR)的活性在多囊腎疾病(PKD)中起著重要的病理作用。EGF和TGF-a是結構相關的酪氨酸激酶受體，即ErbB受體家族的EGF相關肽配體大家族中最有名的兩個。KkpperL等人(2000)Adv.CancerRes.77:25-79。EGFR，也稱為ErbB-1，是EGF和TGF-a的受體。EGF類肽結合至ErbB受體的細胞外部分，導致受體的二聚作用，酪氨酸激酶被激活，和自體磷酸化。大部分包括磷酸酪氨酸結合基序的胞漿蛋白，，參與激活ErbB受體。特定生長因子觸發的反應包括各種細胞內信號級聯反應和特定轉錄因子的激活，其導致了依賴於細胞基質和細胞-細胞間相互作用的細胞增殖或分化。MoghalNNeelB(1998)Mol.CellBiol.18:6666-6678。儘管EGFmRNA和蛋白質的表達在cpk和pcy小鼠以及Han:SPRD大鼠的腎中顯著下調(GattoneVH(19卯)Dev.Biol.138:225-230;CowleyBJ,RuppJ(1995)J.Am.Soc.Nephrol.6:1679-1681)，來自ADPKD，ARPKD和小鼠以及大鼠PKD模型的腎囊腫液體中含有促有絲分裂濃度的多種EGF或EGF類肽，這些EGF肽以可誘導細胞增殖的量被分泌到囊腫腔中。WilsonP等人(1993)Eur.J.CellBiol.61:131國138;LeeDC等人(1998)J.Urol.159:291-296。TGF-ctmRNA和蛋白質的表達在ADPKD腎中增加。LeeDC等人(1998)J.Urol.159:291-296。過度表達TGF-ct的轉基因小鼠發生腎囊腫疾病，作為轉基因的TGF-a的腎表達加速了pCy小鼠的PKD的進展(LowdenD等人(1994)J.Lab.Clin.Med.124:386-394;GattoneVH等人(1996)J.Lab.Clin.Med.127:214-222)。EGF和TGF-a是各種體外系統中促囊腫生成(AvnerE，SweeneyW(1990)Pediatr.Nephrol.4:372-377;NeufeldT.等人(1992)KidneyInt.41:1222-1236)。在人ADPKD和ARPKD以及PKD的cpk、bpk、orpk小鼠模型中，EGFR被過度表達並錯誤定位到囊腫上皮細胞的頂(腔)表面(DuJ,WilsonP(1995)Am.J.Physiol.269:C487國C495;SweeneyW等人(2000)KidneyInt.57:33-40)。EGFR在囊腫列上皮的頂(腔)表面的過度表達和異常定位產生了持續的囊腫中的增生自分泌-旁分泌剌激循環。DuJ.WilsonPD(1995)supra.。頂部表達的EGFR表現了對EGF的高親和的結合性，對EGF反應的自體磷酸化和當被適當的受體剌激時傳送促有絲分裂信號。治療方法
技術領域：
：本發明提供了治療和/或改善與存在在組織中的囊腫異常有關的症狀的方法。一方面，所述囊腫為常染色體顯性遺傳性多囊腎病(ADPKD)的症狀。該疾病的主要表現為腎小管漸進式囊腫增大，並最終導致感染的病人中的一半腎衰竭。美國專利No.5，891，628和Gabow，P.A.，Am.J.KidneyDis.(1990)16:403-413。ADPKD相關的腎囊腫可能會增大，以至含有幾升液體，並且腎臟由於漸進式增大而導致疼痛。其它異常如血尿、腎和泌尿器官感染、腎癌、鹽水失橫和通常由腎缺陷導致的高血壓。在其它器官中的囊腫異常也經常在ADPKD中發現，所述其它器官包括肝、胰腺、脾臟和卵巢。嚴重的肝腫大有時會導致門靜脈高血壓和肝衰竭。在ADPKD中也觀察到賁門瓣異常和蛛網膜下和其它顱內出血頻率增加。美國專利No.5，891，628。已經觀察到的生化異常涉及蛋白質分選、細胞膜標識在腎上皮細胞中的分配、細胞外基質、離子傳遞、上皮細胞翻轉，和上皮細胞增生。這些發現中記載最詳細的是管狀上皮細胞組成異常，和細胞膜蛋白正常極化分布的反轉，如Na+ZK+ATPase。Carone,F.A.etal.，Lab.Inv.(l994)70:437-448。因此，本發明提供了抑制、減少或改善上述與ADPKD相關的生化的、結構的和生理異常的方法。該方法需要向需要治療的細胞或組織傳遞有效量的試劑或分子，該試劑或分子能在感染的組織中修飾(抑制或增加)表2到6所列基因的表達或其表達產物。一方面，申請人出人意料地發現，TGF-cl基因在組織中的過表達與囊腫異常有關，並且該基因或其表達產物的向下調節能治療或改善與囊腫異常有關的症狀。抑制TGF-cl與細胞表面受體的結合也可治療或改善與囊腫異常有關的症狀。在感染的細胞或組織中，TGF-ct的受體是EGF受體，其在ADPKD和ARPKD囊腫的頂膜中過渡表達和異常定位。在ADPKD的早期，腎囊腫與腎單位連接，從其伸展，從而，抗體可以很容易接近這些囊腫。可是，當囊腫增大至2-3mm時，其中大多數從腎單元分離。在ADPKD中，27%的囊腫保持其與腎單元的連接，而大約73。％的囊腫分離。GranthamJJ，(1996)AmJKidneyDis.28:788。目標為中和囊腫內TGF-a的抗體治療方法能治療從腎單元分離的囊腫並不是顯而易見的。真的沒想到抑制TGF-a信號能夠抑制囊腫形成及其相關疾病。據報導，人TGF-a的cDNA含有起始點位於位置1的4119個核苷酸的開放閱讀框。CDNA編碼160個胺基酸的肽。mRNA序列也可以在GenBankNo:NM—003236中獲取，其在SEQIDNO:1中表明。從這個序列中表達的160個胺基酸的多肽可在GenBankNo:NP_003227中獲取，其在SEQIDNO:2中表明。本發明使用的術語"治療"或類似詞語是指獲得所希望的藥理和/或生理效果。該效果就完全或部分預防疾病或體症或其症狀方面是預防性的，和/或就部分或完全治癒疾病和/或由於該疾病導致的副反應時是治療性的。"治療"也包括所有對哺乳動物疾病的治療，包括(a)防止疾病在可能感染該疾病(但是還沒有被診斷感染了該疾病)的受試者體內發生；(b)抑制疾病，即阻止疾病的發展；或(c)減輕或改善疾病，如使疾病(如ADPKD)消退。這裡使用的進行"治療"包括與病理相關的症狀的全身性改善和/或症狀發作的推遲。"治療"的臨床和亞臨床證據會因病理、個體和治療的變化而改變。表2到6中所列基因的過度表達或在某些情況下的低表達導致細胞和/或組織的病理狀態，然後該細胞和/或組織就可以用本發明的方法進行治療。這些細胞或組織可以通過本領域已知的任何方法進行識別，這些方法可以對基因的不同表達或其表達產物進行識別。實例性方法在本文給出。治療劑可以給藥到合適的細胞、組織或個體，或此外給藥到可能會感染或具有囊異常患病危險的個體。當將治療劑給藥到受試者如小鼠、大鼠或病人時，可以將該治療劑加到藥學可接受的載體中，並全身性地或局部地給藥到受試者。為了判定病人能收到有益治療，需要檢驗囊腫得到了消退。治療量可以憑經驗判斷，並根據進行治療的病症、進行治療的受試者和治療的效果和毒性而變化。體內給藥可以在整個治療過程中連續或間歇以一個劑量起作用。確定最有效的給藥途徑和劑量的方法是本領域技術人員已知的，並根據用於治療的組合物、治療目的、進行治療的靶細胞和進行治療的受試者而變化。根據主治醫師選擇的劑量和形式也可進行單一或多次給藥。進行治療劑給藥的合適的劑量製劑和方法是本領域已知的。本發明的藥劑和組合物通過按照常規步驟給藥(如作為在藥物組合物中的活性成分)而用於製備用於治療人和其它動物的藥物。本發明的藥劑可以通過任何合適的途徑進行給藥治療，所述途徑包括經鼻、局部、(包括透皮、氣霧劑、口腔和舌下)，parental(包括皮下、肌內、靜脈內和皮內)和經肺。可以理解的是，優選的途徑將隨接受者的身體狀況和年齡，及進行治療的疾病而變化。用於本發明方法的多聚核苷酸可以利用PCR複製。PCR技術是美國專利Nos,4，683,195;4,800,159;4,754,065和4,683,202的發明主題，並在PCR中描述THEPOLYMERASECHAINREACTION(Mullisetal.eds，BirkhauserPress,Boston(1994))，及其中引用的參考文獻中。或者，本領域技術人員可以利用本發明提供的序列和購得的DNA合成儀來複製DNA。相應地，本發明還提供了通過給出多聚核苷酸線性序列、合適的引物分子、化學製品(如酶)和對它們複製的說明，和化學複製或將該核苷酸以正確的方向連接來獲得本發明多聚核苷酸的方法。在單獨的實施方案中，這些多聚核苷酸被進一步分離。而且，本領域技術人員可以將多聚核苷酸插入到合適的複製載體中，並將該載體插入到合適的宿主細胞中(原核或真核)以進行複製和放大。如此經過放大的DNA可通過本領域技術人員已知的方法從細胞中分離出來。本發明進一步涉及用於通過這個方法得到多聚核苷酸的步驟，和由此得到的多聚核苷酸。RNA可以通過首先將DNA多聚核苷酸插入到合適的宿主細胞中獲得。該DNA可以通過任何合適的方法插入，如通過使用合適的基因傳遞媒介(如，脂質體、質粒或載體)或通過電穿孔。當細胞複製和DNA被轉錄為RNA時；該RNA可以隨之通過本領域技術人員已知的方法分離出來，如在Sambrook等(1989)supra中描述的那樣。例如，mRNA可以根據Sambrook，等(1989)supra中描述的步驟使用各種細胞溶解性酶或化學溶液分離出來，或按照生產商提供的說明用核酸結合樹脂提取出來。反義核酸是DNA或RNA分子，它們與特定轉錄RNA分子的至少一部分是互補的。在細胞中，該反義核酸雜交到相應的轉錄本RNA中，形成雙鏈分子，從而幹擾mRNA的翻譯，因為細胞不翻譯雙鏈mRNA。約15個核苷酸的反義寡聚體是優選的，因為它們容易合成，而且與較大分子相比，它們較少可能地產生問題。使用反義方法抑制基因體外翻譯是本領域已知的。Marcus-Sakura，Anal.Biochem.(1988)172:289和DeMesmaeker，等，Curr.Opin.Struct.Biol.(1995)5:343-355。這些出版物中公開的信息是本領域技術人員已知的，它們與本發明的說明書結合就可以使本領域技術人員了解和使用反義DNA或RNA分子作為治療劑。用低聚核苷酸阻止轉錄是已知的三螺旋策略(triplextrategy)，因為該低聚物圍繞在雙螺旋DNA周圍，形成三鏈螺旋。三螺旋化合物被設計成能識別所選基因上的唯一位點。Maher,等，AntisenseRes.AndDev.(1991)1(3):227，Helene，C.，AnticancerDrugDesign(1991)6(6):569。核酶是具有專一性切斷其它單鏈RNA能力的RNA分子，採取的方式類似於DNA限制性內切酶。通過修飾編碼這些RNAs的核苷酸序列就可能設計出能識別RNA分子中的專一核苷酸序列的分子，並將其切斷。該方法的主要優點是僅具有特定序列的mRNA因其序列專一性而被失活。美國專利No.6，458，559公開了如何生產和使用RNA適配體分子來抑制基因表達。該專利中公開的內容和本發明的說明書結合可以使本領域技術人員製備和使用適配體作為TGF-ct抑制分子。美國公開的專利文件US20030180744公開了生產和使用對生長因子具有高親和力的低聚核苷酸配體的方法。該專利中公開的內容和本發明的說明書結合可以使本領域技術人員製備和使用低聚核苷酸配體作為治療分子。美國公開的專利文件US20030051263公開了將雙鏈RNA引入到活細胞中從而在該細胞中抑制靶基因基因表達的方法。抑制是序列專--性的，因為RNA的雙螺旋區的核苷酸序列和靶基因的一部分的核苷酸序列是相同的。該專利中公開的內容和本發明的說明書結合可以使本領域技術人員製備並使用雙鏈RNA分子作為治療劑。見，如Elbashir，S.M等，Nature(2001)411:494。當治療劑是核酸時，可以通過本領域已知的方法將其加入細胞培養物中，所述方法包括但不限於磷酸鈣沉澱、微注射或電穿孔法。它們可以單獨加入或與合適的載體(如藥學可接受的載體如磷酸鹽緩衝的食鹽水)一起加入。或者或此外，可以將該核酸整合到表達或插入載體中以整合進入細胞中。即含有啟動子又含有克隆位點(其中多聚核苷酸可以有效地與該位點連接)的載體是本領域已知的。這樣的載體可以體外或體內轉錄RNA，並可從如Stratagen(LaJolla，CA)和PromegaBiotech(Madison,WI)這樣的供源處購得。為了使表達和/或體外轉錄最優化，有必要在轉錄水平或翻譯水平除去、加入或改變克隆物中5鄰減3'未翻譯部分，以排除另外的、潛在的不合適的替代翻譯起始密碼或其它可能會干擾或減少表達的序列。或者，共有的核糖體結合位點可以被緊鄰插入到起始密碼的5'中以提高表達。載體的例子為病毒，如杆狀病毒和反轉錄病毒、噬菌體、腺病毒、腺相關病毒、粘粒、質粒、真菌載體和其它常用於本領域的重組載體，它們已經被公開在各種真核和原核宿主中進行表達，並可以用於基因治療和用於簡單的蛋白質表達。在這些載體中，有一些非病毒載體，包括DNA/脂質體複合物，及靶向的病毒蛋白DNA複合物。為了提高向細胞的傳遞，本發明的核酸和蛋白質可以共軛到結合細胞表面抗原的抗體上或其結合片段上。脂質體(也包括靶向抗體或其片段)可以用在本發明的方法中。本發明還涉及用於本發明公開的方法中的靶向複合物。使用本領域已知的方法將多聚核苷酸插入載體基因組中。例如，插入物和載體DNA可以在合適的條件下與限制酶接觸以在每個分子(可以相互配對，並通過連接酶連在一起)上產生互補端。或者，可以將合成的核酸連接子(linker)連接在被限制的多聚核苷酸的末端。這些合成的連接子含有對應於載體DNA中特定限制位點的核酸序列。此外，含有終止編碼子和合適的限制位點的低聚核苷酸可經連接以用於插入載體中，該載體含有，例如，下述中的一些或全部可選擇的標記基因，如用於在哺乳動物細胞中進行穩定或瞬時轉染選擇的新黴素基因；用於高水平轉錄的來自人類CMV立即早期基因的增強子/啟動子序列；用於mRNA穩定的來自SV40的轉錄終止序列和RNA加工信號；用於合適的附加型複製的複製SV40多起源點和ColEl;通用的多克隆位點；和用於體外正義和反義RNA轉錄的T7和SP6RNA啟動子。其它方法是本領域已知的，可以得到。本發明還涉及被分離的由表2到表6所列基因(如，TGF-a基因)編碼的多肽。一方面，所述TGF-a多肽具有SEQIDNO:2所示的胺基酸序列。另一方面，該多肽通過用保守胺基酸取代得到修飾。另一方面，通過使用後面給出的實施例可以確定該多肽具有與SEQIDNO:2多肽相同的功能，並且該多肽經在合適的條件下運行的序列比對程序.如BLAT確定，其與SEQIDNO:2的序列同源性大於80%，或者大於85%，或者大於卯％，或者大於95%，或者大於97%,或者大於98%或99%。一方面，該程序是在默認參數的條件下進行的。本發明還涉及這些實施方案中的活性片段。本發明方法中使用的肽通過任何常用的方法獲得。例如，肽可以通過使用標準技術的化學合成來製備。特別方便的方法是固相肽合成技術。自動的肽合成儀可以購得，它們用途所需的試劑也可以購得。在一個實施方案中，本發明經分離的肽可以使用合適的固相合成方法進行合成。StewardandYoung,eds.(1968)SOLIDPHASEPEPTIDESYNTHESIS,Freemantle,SanFrancisco,Calif.—個方法就是Merrifield方法。Merrifield,RecentProgressinHormoneRes.(1967)23:451。一旦得到本發明經分離的肽，其可以通過標準方法進行純化，這些方法包括色譜法(如，離子交換、親和及體積柱色譜(sizingcolumnchromatography))、離心、溶解度差異或通過任何其它用於蛋白質分離的常規技術。對於免疫親和色譜，抗原決定表位的分離可以是通過與含有抗體(該抗體用於對抗該肽，或本發明中的相關肽)的親和柱結合進行的，並且所述抗體附在固定的載體物上。或者，可以將親和標籤，如hexa-His(Invitrogen)、Maltose結合結構域(NewEnglandBiolabs)、流感殼序列(Kolodziej等，MethodsEnzymol.(1991)194:508-509)和穀胱甘肽-S-轉移酶與本發明的肽相連，從而能使肽在通過合適的親和柱後較容易地得到純化。經分離的肽也可以利用諸如蛋白質水解、核磁共振和X射線結晶等方法進行物理性表徵。或者，所述多聚核苷酸可以通過PCR或基因克隆技術進行複製。這樣，本發明還涉及有效連接在某些元件上的本發明的多聚核苷酸，這些對於這些多聚核苷酸在宿主細胞中的轉錄和/或翻譯是必需的。一方面，所述多聚核苷酸是用於插入到宿主細胞中的基因傳遞媒介物的組分。用於將表達重組體(expressionconstruct)轉化細胞的方法包括但不限於微注射、電穿孔、轉導、轉染、脂質轉染、磷酸鈣顆粒轟擊介導的基因轉移或者直接注射核酸序列，或其它本領域技術人員已知的方式(Sambrook等，(1989)supra)。轉化哺乳動物細胞的各種技術參見，如Keown等，MethodsinEnzmology(19卯)185:527-537。宿主細胞包括真核細胞和原核細胞，如細菌細胞、酵母菌細胞、猿細胞、鼠細胞和人細胞。這些細胞可以是培養的或臨時從受試者分離的。宿主細胞在多肽重組生產或多聚核苷酸重組複製所必需的條件下培養。本發明進一步涉及重組生產的多聚核苷酸和/或多聚核苷酸。本發明在其範圍內還包括在翻譯期間或翻譯後經不同修飾的多肽，例如通過磷酸化、糖基化、交聯、乙醯化、蛋白裂解、與抗體分子，膜分子或其它配體相連。Ferguson等，Ann.Rev.Biochem.(1988)57:285-320。這可以通過各種化學方法實現，或通過在不同的宿主細胞中表達多聚核苷酸實現，所述宿主細胞例如，細菌、哺乳動物、酵母菌或昆蟲細胞。本發明還提供了單獨的或與載體結合的肽片段，如免疫原或抗原部分。本發明的抗原肽可以以各種製劑形式使用，製劑形式根據使用目的而變化。本發明的抗原肽可以共價或非共價連接(複合)到各種其它分子上，其類型可以根據具體目的而變化。例如，本發明的肽可以共價或非共價複合到大分子載體上，該載體包括但不限於天然和合成的聚合物、蛋白質、多糖、多(胺基酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮，和脂質。肽可以偶聯到脂肪酸上以用於引入到脂質體中。美國專利No.5，837，249。本發明的合成肽可以共價地或非共價地與固相載體物複合，許多固相載體物是本領域已知的。本發明的抗原肽表位可以與含有或不含有共刺激分子的抗原遞呈基質(antigen-presenting)相連，這一點下面要詳細描述。蛋白質載體物的例子包括但不限於超抗原、血清蛋白、破傷風類毒素、卵蛋白素、甲狀腺球蛋白、肌球蛋白和免疫球蛋白。肽蛋白載體聚合物可以使用常用的交聯劑形成，所述交聯劑為如碳二醯亞胺。碳二醯亞胺的例子為1-環己基-3-(2-嗎啉基-(4-乙基)碳二醯亞胺(CMC)、l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二醯亞胺(EDC)和1-乙基-3-(4-氮絲(a咖ia)-44-二甲基戊基)碳二醯亞胺。其它合適的交聯劑為溴化氰、戊二醛和丁二酸酐。通常，可以使用同雙官能試劑中的任何一個，所述同雙官能試劑包括同雙官能乙醛、同雙官能環氧化物、同雙官能亞氨酸酯、同雙官能N-羥基琥珀醯亞胺酯、同雙官能馬來醯亞胺、同雙官能垸基滷代物、同雙官能吡啶基二硫化物、同雙官能芳基滷代物、同雙官能醯肼、同雙官能重氮衍生物和同雙官能光反應化合物。還包括雜雙官能化合物，如具有胺反應基團和巰基反應基團的化合物和具有胺反應基團和光反應基團的化合物，和具有羰基反應基團和巰基反應基團的化合物。這樣的同雙官能交聯劑的具體例子包括雙官能N-羥基琥珀醯亞胺酯(N-hydroxysuccinimideesters),二硫代雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)(dithiobis(succinimidylpropionate)、二琥珀醯亞胺基辛二酸酯(disuccinimidylsuberate)和二琥珀醯亞胺基酒石酸酉旨(disuccinimidyltartarate);雙官能醯亞胺酯二甲基己二醯亞胺酯(imidoestersdimethyladipimidate)、二甲基庚二醯亞胺酯(dimethylpimelimidate)和二甲基亞胺(dimethylsuberimidate);雙官能巰基反應交聯劑1,4-二-[3'-(2'-吡啶二硫代)戊酮(propion)-醯亞胺]丁烷、雙馬來醯亞胺己垸(bismaleimidohexane)和雙-N-馬來醯亞胺-1,8-辛烷；雙官能芳基滷代物1,5-二氟-2,4-二硝基苯和4，4'國二氟-3，3'國二硝基苯基碸(1,5-difluoro國2，4-dinitrobenzeneand4，4'-difluoro-3，3'-dinitrophenylsulfone);雙官能光反應試劑如雙-[b-(4-疊氮基水揚基氨基)乙基]二硫化物；雙官能醛類，甲醛、丙二醛、琥珀醛、戊二醛和己二醛(adipaldehyde);雙官能環氧化物，如1,4-丁二醇(butaneodiol)二縮水甘油醚、雙官能醯肼脂肪酸二醯肼(dihydrazide)，羰醯肼(carbohydrazide)和琥珀酸二醯肼；雙官能二氮鑰(diazoniums)鄰甲基苯胺、二氮化的和雙二氮化的對二氨基聯苯；雙官能滷代烷基，NlN'-亞乙基-雙(碘代乙醯胺)，NIN'-環己基-雙(碘代乙醯胺)，NlN-十一亞甲基-雙(碘代乙醯胺)，和滷代苯甲烷(benzylhalides)和滷代芥子氣(halomustards)，分別如ala'-二碘代-對二甲苯磺酸和三(2-氯乙基)胺。其它常見的能使蛋白質結合到肽上的雜雙官能交聯劑的例子包括但不限於SMCC琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)(maleimidomethyl)環己烷-l-羧酸酯、MBS(間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯)、SIAB(N-琥珀醯亞胺基(4-碘代乙醯基)氨基苯甲酸酯)、SMPB(琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁酸酯)、GMBS(N-(馬來醯亞胺基丁醯氧基)琥珀醯亞胺酯)、MPBH(4-(4-N-馬來醯亞胺基苯基)丁酸醯肼、M2C2H(4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-l-羧基-醯肼)、SMPT(琥珀醯亞胺基氧基羰基-a-甲基-a-(2-吡啶基二硫代)甲苯)和SPDP(N-琥珀醯亞胺基3-(2-卩比啶基二硫代)丙酸酯)。交聯可以通過還原氨化將羰基偶聯到胺基團或醯肼基團上完成。本發明的肽可以作為單體的非共價附屬物通過離子的、吸附的或生物專一性的相互作用進行配製。具有高正電荷或負電荷分子的肽複合物可以在低離子強度的環境中(如在去離子水中)通過形成鹽橋來製備。大的複合物可以使用帶電荷的聚合物如分別帶有大量負電荷和正電荷的聚-(L-穀氨酸)或聚-(L-賴氨酸)製備。肽也可被吸附到諸如微粒、乳膠粒或其它疏水聚合物的表面，形成能有效模擬交聯的或化學聚合的蛋白質的非共價連接的肽-超抗原複合物。最後，肽可以通過利用與其它分子之間的生物專一性相互作用進行非共價連接。例如，利用生物素對蛋白質(如抗生物素蛋白或鏈黴親和素或它們的衍生物)的強親和力可以形成肽複合物。這些生物素結合蛋白質含有四個結合位點，這些位點可以在溶液中與生物素相互作用，或可以經共價連接到另一分子上。Wilchek，AnalBiochem.(1988)171:1-32。可以使用常見的生物素(醯)化試劑對肽進行修飾以使其擁有生物素基團，所述生物素(醯)化試劑為如D-生物素(NHS-生物素)的N-羥基琥珀醯亞胺酯，該試劑與蛋白質上的胺基團反應。然後，生物素(醯)化的肽可以與抗生物素蛋白或鏈黴親和素一起孵育以產生大的複合物。這樣得到的聚合物的分子量可以通過仔細控制生物素(醯)化的肽對抗生物素蛋白或鏈黴親和素的摩爾比率進行調節。本發明還提供了共軛連接到用於診斷方法中的可檢測試劑上的本發明描述的肽和多肽。例如，經可檢測標記的肽和多肽可以結合到柱上，並用於檢測和純化抗體。它們也可以用作免疫原用來生產抗體，如下所述。本發明的肽也可以與各種液相載體結合，所述液相載體為如無菌的或含水溶液，藥學可接受的載體、懸浮液和乳液。非水溶劑的例子包括丙基乙二醇、聚乙二醇和植物油。當被用於製備抗體時，這些載體也可以包括佐劑以用於非專一性增加特定免疫反應。熟練技術人員可以很容易地判定是否需要佐劑，和選擇哪一種佐劑。然而，為了說明目的，合適的佐劑包括但不限於弗氏完全或不完全佐劑(Freund'sCompleteandIncomplete),礦物鹽和多聚核苷酸。本發明的蛋白質和多肽可以通過利用商業可購得的自動合成儀進行的化學合成獲得，所述合成儀為如由PerkinElmer/AppliedBiosystemsInc，430A或431A型，FosterCity,CA，USA製造的那些。經合成的蛋白質或多肽可以經沉澱和進一步純化，例如通過高效液相色譜法(HPLC)。相應地，本發明還提供通過提供蛋白質序列和試劑(如胺基酸和酶)，並將所述胺基酸按正確的方向連接來化學合成該蛋白質的方法，及線性序列。人們可以通過細胞分裂、細胞分化或TGF-ct過表達減少來判斷本發明的方法的目的(即，細胞或組織的病理狀態得到逆轉)是否完成。細胞分化可以通過組織學方法進行監測，或通過某些細胞表面標記是否存在或丟失而監測。人體內病理狀態的逆轉可以例如通過使用NMR來測量膀胱(cystic)(或腎)的體積的減小而檢測。該方法也可以通過向感染的組織傳遞有效量的治療劑(如阻斷或抑制抗體或其衍生物或小分子)來實施。實例性抗體在下文中將提到。它們可以單獨傳遞或與載體如藥學可接受的載體結合傳遞。本領域技術人員通過使用本發明的蛋白質可以很容易地生產另外的能專一性結合到蛋白質或其片段上的抗體。這樣的抗體可以是單克隆或多克隆的。它們可以是嵌合的、人源化的或完全人類抗體。可以使用抗體的任何功能片段或衍生物，包括Fab，Fab'，Fab2，Fab'2，和任何單鏈可變區。抗體可以在細胞培養物中、在噬菌體中或在各種動物體內產生，所述動物包括但不限於牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、綿羊、狗、貓、猴子、猩猩、猿等。只要所述片段或衍生物對蛋白質或其片段保持結合專一性，其就可以使用。抗體的結合專一性可以通過在給定的一組條件下將其與合適抗原結合和其與不相關抗原或抗原混合物的結合進行比較來測試。如果抗體與合適抗原的結合比其與不相關抗原或抗原混合物的結合多2、5、7，優選10倍，則該抗體被認為是專一性的。製備這種從部分到完全人抗體的技術是本領域已知的，任何這樣的技術都可以使用。根據一個實施方案，完全人類抗體序列是在轉基因小鼠體內製備的，該轉基因小鼠已經被改造來表達人類重或輕鏈抗體基因。已經製備了這種轉基因小鼠的多個品系，其可以產生不同種類的抗體。能產生所需抗體的來自轉基因小鼠的B細胞可經融合後製備雜交瘤細胞系用於所需抗體的連續生產。見，例如，Russel,N.D.等，InfectionandImmunity(2000)20004月1820-1826;Gallo,M.L.等，EuropeanJ.ofImmun.(2000)30:534-540;Green,L.L.，J.ofImmun.Methods(1999)231:11-23;Yang,X-D等，J.ofLeukocyteBiology(1999A)66:401-410;Yang，X國D,CancerResearch(1999B)59(6):1236-1243;Jakobovits,A.，AdvancedDrugDeliveryReviews(1998)31:33-42;Green,L.andJakobovits,A.,J.Exp.Med.(1998)188(3):483-495;Jakobovits,A.，Exp.Opin.InvestDrugs(1998)7(4):607-614;Tsuda，H.等，Genomics(1997)42:413-421;Sherman國Gold，R"GeneticEngineeringNews(1997)17(14);Mendez,M.等，NatureGenetics(1997)15:146-156;Jakobovits,A"WEIR'SHANDBOOKOFEXPERIMENTALIMMUNOLOGY,THEINTEGRATEDIMMUNESYSTEMVOL.IV,(1996)194.1-194.7;Jakobovits,A.，CurrentOpinioninBiotechnology(1995)6:561國566;Mendez，M.等，Genomics(1995)26:294-307;Jakobovits,A.，CurrentBiology(1994)4(8):761-763;Arbones，M,等，Immunity(1994)1(4):247-260;Jakobovits,A.，Nature(1993)362(6417):255-258;Jakobovits，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci,USA(1993)卯(6):2551-2555;Kucherlapati，等，美國專利No.6,075，181。抗體還可以通過噬菌體展示技術進行製備。這樣的技術用於分離起始抗體或用於產生具有不同專一性或親和力特徵的變體。也可以使用單鏈Fv，其是方便的。如果需要，它們可以從經接種的轉基因小鼠製備。抗體也可以在細胞培養物、噬菌體或在各種動物中生產，所述動物包括但不限於牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、綿羊、狗、貓、猴子、猩猩、猿等。抗體可以用可檢測部分進行標記，所述可檢測部分為如放射性原子、發色團、螢光團等。這種經標記的抗體可以用於在體內或在分離的測試樣品中進行的診斷技術。抗體也可以共軛連接到例如藥物中(如化學治療藥物或毒素)。它們可以連接到細胞因子、配體或另一個抗體上。用於結合到抗體上以獲得抗腫瘤效果的合適的製劑包括細胞因子，如白細胞介素2(IL-2)和腫瘤壞死因子(TNF);用在光動力治療中的光敏劑，包括四磺酸酞菁鋁(m)、血卟啉和酞菁；放射性核素，如碘-131(1311)、紀-90(90Y)、鉍畫212(212Bi)、秘-213(213Bi)、鎝-99m(99mTc)、錸-186(186Re)和錸-188(188Re);抗生素類，如阿黴素(doxorubicin)、阿黴素(adriamycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、甲氨喋呤、道諾黴素(daunomycin)、新抑癌蛋白和卡鉑(carboplatin);細菌、植物和其它毒素，如白喉毒素、假單胞菌外毒素A、葡萄菌外毒素A、相思豆A毒素、蓖麻毒蛋白A(去糖基化蓖麻毒蛋白A和天然蓖麻毒蛋白A)、TGF-a毒素、來自中國眼鏡蛇的細胞毒素(浙江眼鏡蛇(najanajaatra)和白樹毒素(gelonin)(植物毒素)；來自植物、細菌和真菌的核糖體失活蛋白質，如局限曲菌素(restrictodn)(由局限麴黴產生的核糖體失活蛋白質)、皂草素(saporin)(來自石鹼花的核糖體失活蛋白質)和RNase;酪氨酸激酶抑制劑；ly207702(二氟化(difluprednate)嘌呤核苷酸)；含有抗囊腫劑的脂質體(如，反義低聚核苷酸、編碼毒素的質粒、甲氨喋呤，等)；和其它抗體或抗體片段，如F(ab)。診斷方法一方面，本發明提供了一種有助於診斷存在組織中的囊腫異常的方法。通過TGF-a基因、針對其受體(EGFR)的基因或它們的表達產物的差異表達來識別細胞或組織的病理狀態。通常，基因表達是通過關注測試系統中基因表達的量(如果有，例如發生改變)進行判斷的，例如，表達差異是通過從基因轉錄過來的mRNA水平的增加(或在某些方面減少)至少2.5倍，優選5倍，更優選10倍來判斷的。在單獨的實施方案中，由基因編碼的多肽或蛋白質水平的增加說明細胞存在病理狀態。該方法可以用於幫助診斷ADPKD相關的腎囊腫和在其它器官(包括肝臟、胰腺、脾臟和卵巢)中通常會在ADPKD中發現的囊腫異常。此外，通過在異常囊腫形成之前檢測蛋白質或基因表達異常，人們就可以預測患囊腫異常的可能性和/或可以較早進行診斷和治療。用於本發明的細胞或組織樣品包括體液、實體組織樣品、組織培養物或從它們衍生得到的細胞和它們的子代，及從這些來源中的任何一個製備的切片或塗片，或任何其它可能含有具有表達異常細胞的樣品。優選的樣品是從受試者腎小管中製備得到的樣品。利用重組DNA技術和生物信息學的診斷方法一方面，本發明提供了通過測定TGF-a基因的表達水平或其受體，並將測定的表達水平和疾病或其進展聯繫起來進行診斷或監測囊腫異常(如與ADPKD疾病相關的那些)的組合物和方法。己知有許多方法可以用來量化感興趣的基因的表達，所述方法包括但不限於雜交分析(RNA印記分析)和基於PCR的雜交分析。在分析mRNA水平變化時，首先要將樣品中的核酸根據本領域的標準方法提取出來。例如，根據上述Sambrook等(1989)描述的步驟利用各種細胞溶酶或化學溶液將mRNA分離出來，或者通過核酸結合樹脂按照製造商提供的說明提取出來。作為例子，在提取的核酸樣品中的TGF-ctmRNA可以接著按照標準步驟分別通過使用核酸探針和/或引物的通過雜交(如，RNA印記分析)和/或擴增程序進行檢測。在診斷方法中，具有至少IO個核苷酸的、對TGF-(i表現出序列互補或同源性的核酸分子可用作TGF-d雜交探針或TGF-aPCR引物。本領域已知的是，特定雜交不需要"完美相配"的探針。由於取代、消除或插入少量數目的鹼基而導致的探針序列的細小變化不會影響雜交專一性。通常，可以允許多達20%的鹼基對錯配(當最佳比對時)。例如，用於檢測TGF-amRNA的探針與含在在先識別的序列(如，見SEQIDNO:1)中的相同大小的同源區中的至少80%相同。或者，在與同源區比對後，所述探針與相應基因序列的至少85%，或至少卯%相同。片段的總長度，和互補序列段的長度依賴於特定核酸片段的應用用途。基因的更小片段通常可以用於雜交方案中，其中根據人們希望檢測的互補序列，互補區的長度會發生變化，如從約10個到約100核苷酸，或甚至是全長。具有在長度上多於10個核苷酸的互補序列段的核苷酸探針能增加穩定性和雜交的選擇性，從而提高所得特定雜交分子的專一性。人們可以設計含有在長度上具有大於約25個甚至更多，優選多於約50個核苷酸的基因互補序列段的核酸分子，或者根據需要該互補序列段可以更長。這樣的片段可以很容易進行製備，例如，通過化學方法經由通過核酸複製技術直接合成該片段，所述核酸複製技術為如在美國專利No.4，603，102中公開的具有兩個引物低聚核苷酸的PCR技術，或者將選擇的序列引入到重組載體中以進行重組生產。在特定實施方案中，有利的是採用本發明的核酸序列，並與合適的手段相結合，如標籤，用於檢測雜交並由此得到的互補序列。許多種合適的指示方式是本領域己知的，包括螢光的、放射性的、酶的或其它配體，如抗生物素蛋白/生物素，它們可以提供可檢測的信號。也可以使用螢光標籤或酶標誌(如脲酶、鹼性磷酸酶或過氧化酶)以代替放射性的或其它對環境不利的試劑。在使用酶標誌的情況下，比色指示劑物質是已知的，可以採用該物質以提供一種人眼可視或通過分光光度計能檢測的方法以識別含有互補核酸的樣品的特定雜環。雜交反應可以在不同"嚴謹"的條件下進行。相關的條件包括溫度、離子強度、孵育時間、反應混合物中其它溶質的存在(如甲醯胺)，和洗滌步驟。較高嚴謹的條件是如較高的溫度和較低鈉離子濃度，這樣的條件需要雜交元素之間較高的最低互補度以形成穩定的雜環複合體。增加雜交反應嚴謹的條件是公知的，並公開在現有技術中。見，上述Sambrook等，(1989)。人們也可以使用定量PCR或利用高通量分析如在Velculescu，V.等，Science(1995)270:484-487中描述的基因表達系列分析進行檢測並量化mRNA水平或其表達。簡言之，該方法包括從被認為含有該轉錄本的細胞或組織樣品中分離多mRNAs。任選地，所述基因轉錄本可以被轉化為cDNA。基因轉錄的樣品經序列專一性分析和量化。將這些基因轉錄本序列的豐度與參考資料庫序列豐度(包括患病的和健康病人的正常數據組)對比。病人患有與病人的數據組大多數緊密相關的疾病，並且對於本申請而言包括轉錄差異。本發明的核苷酸探針也可用作引物用於基因或基因轉錄本的增殖和檢測。用於檢測差異表達的mRNA的引物與相同長度的基因或多聚核苷酸的同源區有至少約80%相同。為了本發明的目的，增殖是指採用能夠以合理可信度複製靶序列的引物依賴型聚合酶的任何方法。增殖可以通過天然或重組DNA-聚合酶如T7DNA聚合酶、E.coliDNA聚合酶的Klenow片段和反轉錄酶進行。PCR的常用步驟在MacPherson等，PCR:APracticalApproach,(IRLPressatOxfordUniversityPress(1991))中公開。然而，針對每個反應所使用的PCR條件要根據經驗進行判斷。許多參數影響反應的成功。其中，退火溫度和時間、持續時間、Mg^ATP濃度、pH和引物的相對濃度、模板和脫氧核苷酸。在增殖後，所得DNA片段可以通過凝膠電泳，然後溴化乙錠著色和紫外光照進行檢測。感興趣的差異表達基因的特定增殖可以通過證明該增殖的DNA片段具有預測的長度、具有預期的限制性消化圖譜和/或雜交到正確的經克隆的DNA序列上得到證實。探針也可以利用本領域己知的方法連接到固體載體上以用在高通量篩選分析中。例如，國際PCT申請No.WO97/10365和美國專利號5,405,783、5,412,087和5,445,934公開了含有一個或多個序列的高密度低聚核苷酸晶片的構建。該晶片可以在衍生的玻璃表面上利用美國專利Nos.5，405，783、5,412，087和5，445，934中公開的方法進行合成。可以將光保護的亞磷酸核苷酸結合到玻璃表面上，利用光刻掩膜通過光解進行選擇性地脫保護，並與另一種經保護的亞磷酸核苷酸反應重複進行。重複該結合/脫保護過程直到得到所需要的探針。基因表達水平可以通過將被猜測含有多聚核苷酸的樣品暴露在探針修飾的晶片上來檢測。對提取出的核酸優選在增殖步驟進行標記，例如，用螢光標籤。經標記的樣品的雜交是在合適的嚴謹水平進行的。探針-核酸雜交的程度利用檢測設備(如共聚焦顯微鏡)定量測量。見，美國專利Nos.5，578，832和5,631,734。將所得的測量結果直接與基因表達水平聯繫起來。所述探針和高密度低聚核酸酸探針陣列也提供了監測基因多樣性表達的有效方法，其中之一就包括該基因。因此，該表達監測方法可以用在許多情況中，包括疾病的檢測、鑑別從同一病人經一段時間間隔分離得到的樣品之間的差異基因表達或篩選在同一時間(或者相反，在一段時間內)上調或下調基因表達的組合物。雜交的探針和樣品核酸可以通過本領域已知的各種方法進行檢測。例如，經雜交的核酸可以通過檢測與樣品核酸相連的一個或多個標記進行檢測。該標記可以通過本領域技術人員已知的眾多方法中的任何一個進行結合。一方面，該標記是在製備樣品核酸中在增殖步驟中同時結合的。這樣，例如，與經標記的引物或經標記的核苷酸進行的聚合酶鏈反應(PCR)將提供經標記的增殖產物。在單獨的實施方案中，如上所述，使用經標記的核苷酸(如，螢光標記的UTP和/或CTP)的轉錄增殖將標記結合進入到轉錄核酸中。或者，可以將標記直接加到起始核酸樣品中(如，mRNA、polyA、mRNA、cDNA，等)或在增殖完成後直接加到增殖產物中。將標記連接到核酸上的方法是本領域技術人員已知的，包括例如，通過核酸激酶進行的缺口平移或末端標記(如，使用標記的RNA)，然後將連接樣品核酸的連接子與標記(如，螢光團)相連。適用於本發明的可檢測標記包括任何通過分光鏡的、光化學的、生物化學的、免疫化學的、電學的、光學的或化學方法可檢測的任何組合物。本發明有用的標記包括用標記的鏈黴素親和素共軛物著色的生物素、磁珠(如，DynabeadsTM)、螢光染料(如，螢光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色螢光蛋白質等等)、放射標記物(如，3H、1251、35S、"C或34)酶(如，辣根過氧化酶、生物鹼磷酸酶和其它ELISA中常使用的酶)和比色標記，如膠體金或彩色玻璃或塑料(如，聚苯乙烯、聚丙烯、橡膠，等等)珠。公開這些標記的用途的專利包括美國專利Nos,3，817,837;3,850,752;3，939，350;3，996，345;4,277,437;4，275'149;和4,366,241。檢測這些標記的方法是本領域技術人員已知的。因此，例如，放射標記可以使用膠巻或閃爍計數器進行檢測，螢光標記物可以使用光電探測器來檢測發射出的光。酶標記通過將酶與底物接觸，並對酶在底物上作用時產生的反應產物進行檢測，比色標記可以通過簡單觀察彩色標記進行檢測。專利公開WO97/10365公開了在雜交之前，或在雜交之後將標記加到靶(樣品)核酸中的方法。這些是在雜交之前直接連接到或結合進入靶(樣品)核酸中的可檢測的標記。相反，"非直接標記"是在雜交之後連接到雜環雙鏈上。通常，所述非直接標記是與在雜交之前已經連接到耙核酸上的結合部分相連。這樣，例如，靶核酸可能在雜交之前經生物素化。在雜交之後，抗生物素蛋白-共軛的螢光團將結合到含有雜交雙鏈的生物素上，從而得到可很容易檢測到的標記。有關標記核酸和檢測經標記的雜交核酸的方法的詳細綜述參見LABORATORYTECHNIQUESINBIOCHEMISTRYANDMOLECULARBIOLOGY,24巻HybridizationwithNucleicAcidProbes,R丁^jssen,ed.Elsevier,N.Y(199:3)。核酸樣品也可利用在國際PCT申請No.W097/10365中公開的方法在雜交之前經修飾成高密度探針陣列，以減少樣品複雜度，從而減少背景信號和提高測量敏感度。從晶片分析得到的結果通過利用計算機軟體進行分析。見，例如，EP0717113A2和WO95/20681。將雜交數據讀進程序，其會計算靶基因的表達水平。將該圖與現存的針對患病的和健康的個體的基因表達數據組對比。所得數據和患病個體數據之間的關聯說明疾病已經在受試病人體內發生。檢測和量化蛋白質或多肽的診斷方法另一方面，本發明提供了通過檢測和/或量化經下面表2到6中所列的存在在樣品中的基因表達所得的蛋白質或多肽或其受體來診斷或檢測囊腫異常(如與ADPKD疾病相關的那些)的方法和組合物。本領域有許多技術可用於蛋白質分析，包括但不限於放射免疫分析、ELISA(酶連免疫放射性分析)、"三明治"免疫分析、免疫放射性分析，原位免疫分析(使用例如，膠體金、酶或放射同位素標記)、western印記分析、免疫沉澱分析、免疫螢光分析和PAGE-SDS。在診斷由基因差異表達表徵的疾病時，人們通常進行受試者與合適的對照物之間的比較分析。優選地，診斷測試包括衍生自受試者的對照樣品(下面統稱為"陽性對照")，其表現出病理的或異常的基因表達水平。有用的，還要包括"陰性對照"，該對照缺少病理狀態的臨床特徵，並且其基因表達水平在正常的範圍內。受試者與陽性對照之間在經確定的改變方面具有陽性關係，則說明患有或可能會患有疾病。受試者和陰性對照之間缺少關聯則肯定了診斷結果。人們也可以改變己知的免疫分析方法以檢測和量化表達。基因產品的確定需要測量發生在對抗體基因產品的反應之間的免疫專一性結合的量。為了檢測和量化免疫專一性結合，或在雜交或增殖步驟產生的信號，可以採用數字影像分析系統，其包括但不限於使用檢測探針放射性或化學發光的數字影像分析系統。確定治療劑的方法
技術領域：
：本發明還提供了用於確定先導藥物(leads)的篩選和逆轉細胞或組織病理狀態的方法，或選擇性抑制細胞或組織生長或增生的方法。一方面，所述篩選確定了能用於治療囊腫異常或治療或改善與ADPKD相關的症狀的先導化合物或生物製劑。該篩選可以在體外或體內進行。一方面，需要確定能結合到本發明可溶TGF-ci的候選藥物。在某些應用中，希望得到能夠抑制蛋白質與其受體結合的候選藥物。對於某些應用，能夠結合受體的候選藥物的確定可能用作傳遞治療劑或診斷劑或阻止TGF-ci與其受體結合的方法。對於其它應用，希望得到能模擬天然配體活性的候選藥物。這樣，通過操縱結合配體複合體的結合，人們就可以促進或抑制囊腫病灶的發展。用於篩選的實驗物質可以通過各種來源獲得。它們可以來自天然產物庫、組合化學庫、通過重組庫得到的生物產品，等等。實驗物質的來源對於本發明來說並不是重要的。本發明提供了篩選化合物和組合物的方法，所述化合物和組合物可能在先前的其它篩選方案中被忽略了。為了進行體外篩選和分析，首先要得到合適的細胞培養物或組織培養物。所述細胞可能是經培養的細胞或經基因修飾的差異表達基因的細胞。或者，所述細胞可以來自組織切片。美國專利No.5,789，189公開了生產多囊腎病細胞(來自體外囊腫)培養物的方法。該細胞在一定條件(溫度、生長或培養介質和氣體(C02))下培養足夠的時間以獲得指數增生而沒有密度依賴型限制的細胞。也希望保留另外的單獨的細胞培養物；沒有給予待測試藥物的培養物作為對照。本領域技術人員可以顯然易見的是，將合適的細胞在微孔板上培養，幾個製劑可以通過觀察遺傳型變化、表型變化和/或細胞死亡而同時測試。一方面，所述篩選使用了下文中要提到的組合物和MDCK囊腫分析方法。當製劑是組合物而不是DNA或RNA核酸分子時，可以將合適的條件直接施用到細胞培養物上或加到培養介質中以進行添加。本領域技術人員已知的是，"有效"量必須根據經驗確定。所述篩選包括將製劑與差異表達基因的測試細胞接觸，然後分析細胞的基因表達水平。在某些方面，可能需要在分析之前確定基因的表達水平。這提供一個基線以對比在向細胞培養物給予所述製劑之後的表達。在另一實施方案中，測試細胞是從已建立的差異表達TGF-ci基因的細胞系得到的經培養的細胞。如果一個製劑能將基因表達恢復(減少和增加)到正常細胞中存在的狀態，則該製劑就是治療劑。再一方面，將測試細胞或組織樣品從要進行治療的受試者中分離出來，篩選出一個或多個有潛能的製劑來針對那個病人確定最佳治療和/或療程。例如，腎或肝組織適合這種分析。為了實現本發明的目的，"製劑"包括但不限於生物或化學化合物如簡單的或複雜的有機或無機分子、肽、蛋白質或低聚核苷酸。可以合成大量的化合物，例如，低聚體如寡肽和寡核苷酸，和基於各種核心結構的合成有機化合物也包括在術語"製劑"中。此外，各種天然來源也能為篩選提供化合物，如植物或動物提取物，等等。應該可以理解的是，儘管沒有總是詳細說明，但是所述製劑可以單獨使用或與其它用本發明篩選確定的具有相同或不同生物活性的製劑一起使用。這些製劑和方法也可與其它治療結合使用。它們可以同時給藥或順序給藥。所述篩選在動物如大鼠或小鼠中的應用，該方法提供了一種方便的動物模型系統，該系統可以在治療劑臨床實驗前使用或者用於先導物優化。在這個系統中，如果基因表達與未經處理的具有病理細胞的動物相比恢復到正常水平或與含有TGF-a基因差異表達的細胞的存在相關的症狀得到改善，則該候選藥物是具有潛力的藥物，可能適合進一步開發。在該篩選中使用單獨的健康的和未經處理的細胞或動物的陰性對照組也是有用的，可以提供另一個比較基準。己經描述了許多具有非常類似人PKD(如，囊腫的形態學、囊腫位置、疾病進展)的突變型的多囊腎疾病的(PKD)鼠類模型。例如，參見GretaN.等人(1996)Nephrol.Dial.Transplant11:46-51;SchierenG.等人(1996)Nephrol.Dial.Transplant11:38-45;Guay-WoodfordL.(2003)Am.J.RenalPhysiol.285:F1034-F1049。這些PKD鼠類模型包括，但不局限於下面描述的那些。先天多囊腎小鼠(cpk)是自發突變中首次被描述的模型。PremingerG等人(1982)J.Urol.127:556-560;FryJ.等人(1985)J.Urol.134:828-833。突變誘發了巨大的腎囊腫疾病以及進行性腎功能不全，其模式非常類似人ARPKD。幼年囊腫腎小鼠(jck)突變發生在具有MMTV/c-myc轉基因的小鼠系。AtalaA.等人(1993)KidneyInt.43:1081-1085。在感染的小鼠中，病灶腎囊腫最早在生後3天明顯，腎囊腫疾病進展很慢。多囊腫腎疾病(pcy)突變首先發生在糖尿病易感KK小鼠株。TakahashiH.等人(1986)J.Urol.135:1280-1283;TakahashiH.等人(1991)J.Am.Soc.Nephral.1:980-989。在腎囊腫位置和緩慢的疾病進展方面表現型類似人的ADPKD。突變在生後8周誘發腎增大，生後18周發生進展的氮血症和間質纖維化。-由於腎衰而導致的死亡發生在出生後30-36周。Han:SPRD大鼠已被很詳細的描述並作為ADPKD模型被廣泛研究。CowleyB.等人(1993)KidneyInt.49:522-534;GretzN.等人(1996)Nephrol.Dial.Transplant11:46畫51;Kaspareit國RittinghausenJ.等人(19卯)Transpl.Proc.22:2582畫2583;SchaferK.等人(1994)KidneyInt.46:134-152。突變在Sprague-Dawley系中自發產生，早期分析表明其作為常染色體顯性遺傳。在雜合子中，腎囊腫損傷在生後前幾周內明顯，主要涉及近端小管，且進展緩慢。在疾病表現中具有性別二態性。腎增大和囊腫改變在雄性雜合子中比同齡的雌性雜合子中發展更快。CowleyB.等人(1997)Am.J.KidneyDis.29:265-272;GretzN.等人(1995)KidneyInt.48:496-500。診斷和治療性抗體組合物本發明也提供了一種能專一性地與本發明的蛋白質或多肽形成複合體的抗體，其可用於本發明的診斷和治療方法中。術語"抗體"包括多克隆抗體和單克隆抗體及它們的衍生物(如上所述)。抗體包括但不限於小鼠、大鼠、兔或人抗體。抗體可以在細胞培養物、噬菌體或各種動物中產生，所述動物包括但不限於牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、綿羊、狗、貓、猴子、黑猩猩、猿等等。該抗體還可用於識別和純化治療性和域診斷用多肽。製備多克隆抗體和單克隆抗體的實驗室方法，和推導出它們相應的核酸序列的方法是本領域已知的，見上述Harlow和Lane(1988)和(1999)和上述Sambrook等，(1989)。本發明的單克隆抗體可以通過將蛋白質或其片段引入到動物(如小鼠或兔)體內進行生物性生產。將在動物體內生產抗體的細胞分離出來，並與骨髓瘤細胞或異骨髓瘤細胞融合產生雜交細胞或雜交瘤細胞。因此，本發明還提供了產生單克隆抗體的雜交瘤細胞。為了進行說明，抗TGF-ci抗體是可以購得的，結合已知的方法，本領域技術人員可以生成和篩選本發明的雜交瘤細胞和具有結合TGF-a或其受體能力的抗體。如果經測試的單克隆抗體與蛋白質或多肽結合，則該經測試的抗體和本發明雜交瘤細胞提供的抗體是等價的。也可以不進行過多實驗就確定一個抗體是否與本發明的單克隆抗體具有相同的專一性，方式是通過確定經測試的抗體是否阻止本發明單克隆抗體與蛋白質或多肽結合(通常，所述的單克隆抗體對蛋白質和多肽是有反應的)。如果進行測試的抗體與本發明的單克隆抗體進行競爭(表現為本發明的單克隆抗體的結合降低)，則說明可能兩種抗體結合到相同的或非常相似的表位上。或者，人們可以預先將本發明的單克隆抗體與通常該抗體會對其有反應的蛋白質一起，並確定進行測試的單克隆抗體與抗原結合的能力是否受收到抑制。如果進行測試的單克隆抗受到抑制，則非常有可能的是，該抗體與本發明的單克隆抗體具有相同或非常相關的表位專一性。術語"抗體"也包括所有同型抗體。單克隆抗體特定的同型可以直接通過從起始融合中選擇進行製備，或其次，從分泌不同同型單克隆抗體的親本雜交瘤通過使用同系選擇技術(sibselectiontechnique)來分離類別轉換變體(classswitchvariants),使用Steplewski，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(l985)82:8653或Spira等，J.Immunol.Methods(1984)74:307中描述的方法。本發明還提供了上述多克隆和單克隆抗體的生物活性片段。這些"抗體片段"保留了某些選擇性地與其抗原或免疫抗原結合的能力。這樣的抗體片段包括但不限於Fab;Fab';F(ab')2;Fv，和SCA。"生物活性抗體片段"的具體例子是抗體的CDR區。製備這些片段的方法是本領域已知的，見例如，上述Harlow和上述的Lane(1988)和(1999)。本發明的抗體可以經修飾後產生嵌合抗體和人化抗體。Oi，等，BioTechniques(1986)4(3):214。嵌合抗體是那些其中抗體的各種重和輕鏈結構域是由來自一種以上種類的DNA編碼的。能分泌具有本發明單克隆抗體專一性的單克隆抗體的其它雜交瘤細胞的分離也可以由本領域技術人員通過產生抗獨特型抗體來完成。Herlyn，等，Science(1986)232:100。抗獨特型抗體是能識別存在在單克隆抗體(由感興趣的雜交瘤細胞產生)上的唯一決定簇的抗體。兩個雜交瘤細胞單克隆抗體之間的獨特性識別說明兩個單克隆抗體在對相同的表位決定簇識別方面是一樣的。因此，通過使用針對存在在單克隆抗體上的表位決定簇抗體就可以識別其它表達具有相同表位專一性的單克隆抗體的雜交瘤細胞。也可以使用抗獨特型抗體技術生產能模擬表位的單克隆抗體。例如，針對第一個單克隆抗體製備的抗獨特型單克隆抗體將在高變區具有結合結構域，該高變區是由第一個單克隆抗體結合的表位的鏡像。這樣，在這種情況下，所述抗獨特型單克隆抗體可以用於免疫作用以生產這些抗體。在本發明中所使用的術語"表位"包括對本發明的單克隆抗體具有專一親和力的任何決定簇。表位決定簇通常由分子如胺基酸或糖側鏈的化學活性表面基團組成，並通常具有專門的三維結構特徵，和專門的電荷特徵。本發明的抗體可以連接到可檢測的製劑或標記上。有許多本領域技術人員已知的不同的標記和標記方法。將抗體結合到小分子量的半抗原上會增加分析的敏感度。然後，通過另一個反應對所述半抗原進行專一性檢測。例如，通常使用半抗原如生物素，其會與抗生物素蛋白反應，或者二硝基苯酚、吡咳醛和螢光素，它們會與專門的抗半抗原抗體反應。見上述Harlow和上述的Lane(1988)和(1999)。本發明的抗體也可與許多不同的載體結合。因此，本發明還提供組合物，該組合物含有所述抗體和另一種活性或惰性物質。已知的載體的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、澱粉酶、天然和改性的纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖和磁鐵石。這些載體的性質可以是可溶的或不可溶的，根據發明的目的決定。本領域技術人員會了解用於結合單克隆抗體的其它合適的載體，或能夠根據常規實驗進行判斷。含有抗體、其片段或產生該抗體的細胞系的組合物也在本發明的保護範圍內。當這些組合物用於藥物用途時，它們也可以與藥學可接受的載體結合。下面實施例用於解釋而不是限制本發明。實驗方法1.EGFR被過度表達並錯定位至在jck小鼠腎和cpk小鼠腎的囊腫上皮的頂膜。A.免疫組化分析jck(50天)或cpk(10天)45^多聚甲醛/PBS固定/石蠟包埋小鼠腎切片(5iim)在100%二甲苯溶液中孵育5分鐘，兩次，在100%乙醇中孵育5分鐘，兩次，在95%乙醇中孵育5分鐘，兩次，在80%乙醇中孵育5分鐘，兩次，在蒸餾水中孵育5分鐘，兩次，在磷酸鹽緩衝液(PBS)中孵育5分鐘，兩次。在含有3%(重量/體積)牛血清白蛋白(PBS/BSA)的PBS中封閉(block)30分鐘。根據廠家推薦，在室溫下在胰蛋白酶溶液(Sigma/Aldrich，StLouis，MO)將切片孵育30分鐘，暴露抗原，隨後將每片切片在5PBS中清洗5分鐘。將兔抗EGFR(CellSignaling,Beverly,MA)在12.5ug/mlPBS/BSA中在室溫下孵育2小時，隨後用5PBS清洗5分鐘。將抗-兔Cy3抗體(Sigma/Aldrich)在1:100稀釋度(vol/vol)的PBS/BSA中孵育1小時，隨後用5PBS清洗5分鐘。B.WestemBlot分析使用組織均質化儀器，將來自於野生型、jck(20和50天)或cpk(20天)(小鼠來自於JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)在冰上在7倍體積的含有250mM的蔗糖、lmMPMSF和完全的蛋白酶抑制劑混合物(Roche,Basel,Switzerland)的pH7.4的lOmM的Hepes緩衝液中均質化。1000g離心後除去大的細胞碎片。用BCA蛋白分析試劑盒(Pierce,Rockford，IL)測量蛋白濃度。使用SDS-PAGE(3-12%梯度)分離蛋白(lOOug)，並根據Sambrook等人，1989中的描述在20mMTris、150mM甘氮酸和20%甲醇中用2小時將分離的蛋白轉移至ImmobilonP膜上(Millipore，Bedford,MA)。在封閉緩衝液(含有0.05%Tween20/5。/。無脂幹奶的Tris鹽緩衝液(TBS))中，在室溫下將膜飽和2小時，而後，用山羊抗EGFR抗體(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz，CA)在室溫下在封閉緩衝液中標記2小時。然後在含有0.05%Tween20(TBS-T)的TBS中清洗膜。將驢抗山羊辣根過氧化物酶(HRP)偶聯抗體(SantaCruzBiotechnology)以1:10000的稀釋度在封閉緩衝液中在室溫下孵育1小時，隨後在TBS-T中清洗3次。使用增強的化學螢光(Amersham/PharmaciaBiotech,LittleChalfontBuckinghamshire,England)檢測免疫反應的蛋白質。II.在jck囊腫上皮和cpk囊腫上皮中表達TGF-a免疫組化分析jck(50天)或cpk(10天)4X多聚甲醛/PBS固定/石蠟包埋小鼠腎切片(5um)在100%二甲苯溶液中孵育5分鐘，兩次，在100%乙醇中孵育5分鐘，兩次，在95%乙醇中孵育5分鐘，兩次，在80%乙醇中孵育5分鐘，兩次，在蒸餾水中孵育5分鐘，兩次，在磷酸鹽緩衝液(PBS)中孵育5分鐘，兩次。在含有3。Z(重量/體積)牛血清白蛋白(PBS/BSA)的PBS中阻斷30分鐘。根據廠家推薦，在室溫下在胰蛋白酶溶液(Sigma/Aldrich,StLouis，MO)將切片孵育30分鐘，暴露抗原，隨後將每片切片在5PBS中清洗5分鐘。將小鼠抗TGF-a(Calbiochem，SanDiego，CA)在5ug/mlPBS/BSA中在室溫下孵育2小時，隨後用5PBS清洗5分鐘。將抗小鼠FITC抗體(Sigma/Aldrich)在1:100稀釋度(vol/vol)的PBS/BSA中孵育1小時，隨後用5PBS清洗5分鐘。HI.在jck和pcy小鼠的囊腫液中分泌TGF-a收集50天的jck小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)和100天的pcy小鼠(V.H.GattoneII,Ph.D.，IndianaUniversitySchoolofMedicine)的被C02窒息處死的動物的腎，並快速切碎以收集囊腫液。通過200g離心除去細胞碎片。用心內穿剌法收集血液，根據廠家推薦(BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)使用BDMicrotainer^血清分類管離心分離血清。根據廠家推薦(R&DSystems,Minneapolis,MN)使用抗TGF-a捕獲和檢測抗體通過ELISA測定在血清中和囊腫液中的TGF-a濃度。IV.抗-TGF-a抗體在體外抑制囊腫形成使用三維MDCK(Madin-Darbycaninekidney)細胞培養分析檢測抗-TGF-a阻斷的抗體。MDCK細胞在補充有10%胎牛血清、100U/ml的青黴素、10ug/ml鏈黴素和ImM的丙酮酸納(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA)的高葡萄糖Dulbecco，sModifiedEagleMedium(DMEM)中生長。用Hanks'緩衝液衝洗亞融合的MDCK細胞單層兩次，並用含有0.25X胰蛋白酶/lmMEDTA(Gibcol/Invitrogen)的Hanks'緩衝液分離。將細胞以4X1(T個細胞/ml的密度分散於膠原質凝膠溶液(補充有10%胎牛血清、100U/ml的青黴素、10ng/ml鏈黴素和ImM的丙酮酸納、2.8mM的Na0H、1.34mg/mlNaHC03和0.84mg/ml膠原質的高葡萄糖DMEM)中，並覆蓋在無細胞的硬性膠原質凝膠溶液頂部。10分鐘後在37-C下為使細胞/膠原質混合物變硬，加入MDCK培養基。在加入多克隆中和抗TGF-ct抗體前，允許囊腫形成72小時。在不同濃度下以2倍稀釋的增幅在MDCK生長培養基中從100ug至0.1lig/ml檢測多克隆中和抗TGF-ct抗體(R&DSystems,Minneapolis,MN)。V.抗TGF-ci抗體在Han:SPRD(cy/+)大鼠中抑制囊腫生成A)早期處理(媒介、低劑量、高劑量)對新生(最大l周)Han:SPRD大鼠(B.Cowley,M.D.UniversityofKansas)腹腔注射低劑量抗TGF-a抗體(0.5mg/kg)、高劑量抗TGF-a抗體(5mg/kg)或無關的抗體媒介，每周2次。3周齡後，將動物分性別，稱重，然後麻醉。測量血清肌氨酸酐水平。除去腎臟並進行組織學檢測。移除肝臟，稱重，粗測囊腫表達，而後定表現型。處理A結果對照(野生型)雄性接受低劑量抗體治療的大鼠身體重生長比接受高劑量或媒介治療的大鼠高。腎的尺寸也增加，低劑量組中的腎重量明顯超過高劑量組。腎體重的比率在這些組中並無明顯不同，儘管在高劑量組中有低的腎體重比率的傾向。血清肌氨酸酐水平不受低劑量抗體的影響，但在接受高劑量治療的組中增加。對照(野生型)雌性在身體或腎尺寸，或血清肌氨酸酐方面各組間無差別。雜合子(cy/+)雄性與高劑量組和媒介組相比，低劑量抗體組的身體重量增加。低劑量組中的總腎重量增加，儘管在一定程度上與體重增加成比例。與低劑量組相比，高劑量抗體組的身體重量、腎重量和腎身體重量比率降低。各組中的血清肌氨酸酐無差別。雜合子(cy/+)雌性在低劑量組中身體和腎重量增加，但這種改變成比例所以腎身體重量沒有變化。各組的血清肌氨酸酐無差別。與低劑量組相比，高劑量抗體組的腎和身體重量降低，但腎身體重量比例和血清肌氨酸酐相似。純合子(cy/cy)雄性和雌性表現出非常增大的腎，以及腎身體重量比例，和明顯增加的血清肌氨酸酐。各組間無顯著差別。B)進一步分析處理起始天(1天及7天)的早期處理A(以上)結果的再分析處理B結果雜合子(cy/+)雄性開始於第7天的低劑量治療導致了身體和腎的生長，儘管血清肌氨酸酐不受影響。這些效果在從生後1天的處理大鼠中看不到。開始於生後7天的高劑量組，對身體或腎的尺寸沒有顯著影響。與媒介處理的大鼠相比，具有低的血清肌氨酸酐的趨勢。無論是開始於生後1天或7天，高劑量抗體組的囊腫重量顯著降低。雜合子(cy/+)雌性無論處理開始於生後1天或7天，低劑量與大的身體和腎尺寸相關，但在腎身體重量比例上沒有變化。開始於生後7天的高劑量處理增加了腎尺寸，而開始於生後1天的沒有，腎身體重量比例沒有變化。在生後1天接受髙劑量處理的大鼠與生後7天開始接受這些處理的大鼠相比，總腎重量顯著降低，但腎身體重量比例沒有變化。在所有組中，血清肌氨酸酐值相似。在生後7天開始的高劑量抗體顯著降低囊腫重量，甚至比開始於生後1天的更有效。C)後期處理(媒介、低劑量、高劑量)向3周齡的雄性雜合(cy/+)Han:SPRD大鼠腹腔注射低劑量抗TGF-ct抗體(0.5mg/kg)、高劑量抗TGF-a抗體(5mg/kg)或不相關抗體媒介，每周2次。在第6周齡，清醒測量所有大鼠的收縮血壓、尾巴血血清肌氨酸酐水平。收集24小時尿測量蛋白和肌氨酸酐(用於計算肌氨酸酐清除)。用3%水楊磺酸沉澱尿蛋白並測量。用分光譜測量肌氨酸酐。在10周齡，重複測量血壓和代謝籠收集物(metaboliccagecollections)。然後將大鼠稱重、麻醉。取出腎、稱重、並進行組織學檢測。取出肝，粗略檢測囊腫表達，然後定基因型。處理C結果在所有組中，身體重量隨時間的增加相似。在所有組中，收縮血壓有增高的趨勢，但僅在低劑量組中顯著增加。蛋白尿在所有組中適度並相同的增加。肌氨酸酐清除值僅在接受媒介的組中顯著增加。在研究最後，三組表現相同的身體重量、腎重量、腎身體重量比例、收縮血壓、肌氨酸酐清除和蛋白尿。可以理解的是，儘管本發明結合上述實施方案進行說明，但是前述說明和實施例僅用於說明而不是限制本發明。本發明範圍內的其它方面、優點及改變對於本領域技術人員來說是顯而易見的，本發明也涉及這些內容。表1.SAGE庫的總結tableseeoriginaldocumentpage47tableseeoriginaldocumentpage48tableseeoriginaldocumentpage49tableseeoriginaldocumentpage50tableseeoriginaldocumentpage51tableseeoriginaldocumentpage52tableseeoriginaldocumentpage535-細胞骨架tableseeoriginaldocumentpage536-細胞外基質tableseeoriginaldocumentpage537-蛋白酶tableseeoriginaldocumentpage538-離子通道和轉運蛋白tableseeoriginaldocumentpage539-其它tableseeoriginaldocumentpage53tableseeoriginaldocumentpage54tableseeoriginaldocumentpage55tableseeoriginaldocumentpage56表6CL中其餘的上調5倍的基因Tag序列AAACATCCTAAAGGGCGCGGACAGCGCTGAACAGTGCTTGACATTTCCAAACCCCTAACAACCCGATGGCACTGTGGCGGACTTTCCAAAAGAAGACAGAAGCACGACCCAGCAGTCCCCAGGCATTGAAAGGCCTTGGTATCTTGAAAGATGGTGGGGGCAAGACGGTCCACTACTTCACL單基因(Unigene)簇中的上調基因無相配標記膜聯蛋白A3Hs.442733主要組織相容複合物II型，DRbeta3Hs.308026蛋白磷酸酶2(以前的2A)催化亞單位，0異構Hs.80350公認的淋巴細胞G0/G1轉化基因Hs.432132無相配標記無相配標記食道特異的正常黏膜lHs.112242無相配標記無相配標記聯腦蛋白1HS.89434無相配標記核轉移因子2HS.356630CMP-NeuAC:(e)-N-半乳糖乙醯基(a)2，6-唾液酸轉移酶VI成員Hs.109672類核小體組裝蛋白11Hs.419776鋅指蛋白36，C3H型，同源(小鼠)Hs.343586無相配標記無相配標記CAGGCTCCTG原纖維蛋白2(先天性攣縮性細長指(趾))Hs.79432假定蛋白LOC283680Hs.356494層粘連蛋白，P3HS.436983羥基類固醇(17-e)脫氫酶2Hs.155109膜相關蛋白17HS.431099細胞球蛋白Hs.95120序列相似性20的家族，膜CHs.134742villin2(埃茲蛋白)Hs.403997PNAS-123Hs.40092無相配標記RhoGDP分離抑制子(GDI)PHS.292738CCAAGGGTCCCCATTGAAACCCCAGAGCTCCCGGCCCTACCCTGGGTCTCCGCCCGTCGTCGGAACACCGCTAATGCAAACTCCCCAGGCCTGGCCCGAGCTGGCGCGAGCTGTGAGACCCTGTGCCAATCTTCTGCTGGGACCTGCGGCGAGCTTTTGAGAGGCAGCTGGAGGCCTCAGGATGCGAGGAGCAGTTCTGAGCCCCTCAGCGGAAGGCCCCGGATCCCAACGGATTTCATCGGCGCCGGGGGCGGGACCAGGGGAAGCGAGGGGGCGCCRhoGDP分;l制子(GDI)13HS.292738IgG的Fc片段，受體，運送子，aHs.111903接頭相關蛋白複合物2，P1亞單位，Hs.370123脫氫酶/還原酶(SDR家族)成員3HS.17144ARP1激動蛋白相關蛋白1同源物A，中心體肌動蛋白a(酵母)Hs.153961假定的蛋白FLJ13081HS.180638類鳥嘌吟核苷酸結合蛋白1Hs.83147泛素結合酶E2R2.Hs.11184sema結構域、免疫球蛋白結構域(lg)，短基結構域，分泌的，(信號素)3FHs.32981II型主要組織相容複合物，DR!33Hs.308026泛素結合酶E2R2.HS.11184無相配標記無相配標記睪丸特異的轉錄因子，丫-連接Hs.412918激酶(PRKA)瞄定蛋白(gravin)12Hs.197081無相配標記無相配標記溶解載體家族25(線粒體載體；腺苷酸GGTGACCACCGTACCTGTAGGTCGAAGGACGTCTGGGGGAGTCTTAAAGTGTGCGAAGGAGTGGAGGTGGGTGGCTTCATGTTGGGAAGAGTTTCAGGAGTAGGAAACACTAGTTGTAGGTATGAATACTTCATTCATCTTCCGCTTCGGTCGCTTGCTTTCTGGCAGTATGCCCTCAGATGGCTTGCTCTGGTGTATGCTGTATGCCGTTTCAGTGCCCTTGCTGCCAGTTGGGGGTT酪〗TTGTGTTGAG移位子)，成員6Hs.350927人cDNA:FLJ21545fis，克隆COL06195Hs.83623無相配標記無相配標記單甘油酯脂酶Hs.409826過氧岐化酶2，線粒體Hs.384944無相配標記含有1的葡萄球菌核酸酶結構域Hs.511400含3的Rho相關的BTB結構域Hs.31653前列腺的六個跨膜抗原Hs.61635l酸蛋白磷酸酶，非受體型底物1Hs.156"4DEAD(Asp-Glu-Ala—Asp)盒多肽42Hs.8765假定的蛋白CL25022Hs.5324軟骨素硫酸鹽蛋白多糖2(versican)Hs.434488人cDNAFU44489fis，克隆UTERU2035114Hs.307962無相配標記無相配標記karyopherin(importin)]33Hs."3503lipocalin2(致癌基因24p3)Hs.204238順鉑抗性相關過度表達蛋白Hs.130293無相配標記類核因子(紅細胞衍生的2)1Hs.83469葡萄糖6磷酸酶催化亞單位3Hs.294005脂多糖誘導的具錨蛋白(ankyrin)重複的分子(MAIL),小鼠同源Hs.390476與蛋白sp:P02794(人)FRIH—HUMAN鐵蛋重鏈非常類似的人轉錄序列(鐵蛋白H亞單位Hs.446345無相配標記CCCTCCTGGGGCACTGAATAGGAGTGTGCGGTGCCGGAGGCATTTGTAATACTTTCCAAAGCAATACCCCGCCCTTTCTCGTCTTAAAGTTATGAATGCTTGGATATCAGGAAAAATGGGGAAAAGTTTCGTACGGAGATGTGTCAGATATATGTGCCACGCTTGCAAAACACGCGATAGCCTCAGCCTGGGGATTAAAGGTAAGTGTACTACCGCCCGTTCACCGGTCATCTGTCAAGAAAAGTTCGTAACCAGCCAGA染色體9開放閱讀框16Hs.409585澱粉樣蛋白P(A4)類前體蛋白2Hs.279518離子鈣結合配體分子2Hs.4944無相配標記與蛋白ref:NP—060312.1假定的蛋白FLJ20489稍類似的人轉錄序列Hs.467256無相配標記無相配標記甘露糖受體，C型2Hs.7835過氧化岐化酶2，線粒體Hs.384944軟骨素硫酸鹽蛋白多糖2多功能蛋白聚糖(versican)Hs.434488daudin1Hs.7327過氧化岐化酶2，線粒體Hs.384944趨化因子(C-X-C基序)配體5Hs.89714血管細胞粘附分子1Hs.109225纖維連接蛋白1Hs.418138上皮細胞轉化序列2癌基因Hs.293257過氧化岐化酶2，線粒體Hs.384944無相配標記無相配標記黑素瘤細胞黏附分子Hs.511397無相配標記染色體7開放閱讀框21Hs.238513(肌動蛋白)凝溶膠蛋白(gelsolin)(澱粉樣變性病，芬蘭型)Hs.446537ATP合成酶，H+轉運，線粒體F1複合物，〇亞單位(寡黴素敏感比照(conferring)蛋白質)Hs.409140destrin(激動蛋白解聚因子)Hs.408576無相配標記AGTAGGTGGCCAGTCTGTGACCTGCCCCGCCTGGTGGGCCGAGCAAATCTGAGTCATTGAGTCGGAGGACGTGCTATTCTTCTGTTCTGGTTGGGGGTTTTTTGAAATGATTTGCTGTAGAATGC丁TGATACAAATCCTTACGGAAAGGAAGAGGTGTAGCAAAGCAACGCACACCCCTGCCACTCCTCCCCAGGGGAGACCTAATGTGTCTAAGACTTTC丁GATGCCCAGAAAGAGCTGGAAGAACAAG無相配標記令醜蛋白Hs.75350溶解載體家族34(磷酸納)，成員2Hs.441716碳酸酐酶XIIHs.279916無相配標記人cDNAFLJ37644fis，克隆BRHIP2000239.Hs掘582無相配標記B7同源3Hs.77873細胞分裂周期34Hs.423615與蛋白sp:P02794(人)FRIH—HUMAN鐵蛋白重鏈非常類似的人轉錄序列(鐵蛋白H亞單位)Hs.446345亞精胺/精胺N1-醯基轉移酶Hs.28491腫瘤壞死因子(配體)超家族，成員10Hs.387871視網膜母細胞瘤結合蛋白7Hs.406078FK506結合蛋白1A，12kDaHs.374638纖維蛋白原，B3多肽Hs.300774無相配標記絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制劑，cladeE(連接蛋白(nexin)，纖溶酶原激活物抑制劑1型)成員2Hs.21858孕酮受體成員成分1Hs.90061細胞死亡防禦劑1Hs.8289Q幹擾素，a誘導蛋白27Hs.278613IaminB2Hs.76084無相配標記KIAA0063基因產物Hs.3094H2A組蛋白家族，成員XHs.147097亞精胺/精胺N1-醯基轉移酶Hs.28491GAGAAGGGCAGCCGAGCCAGGGCCGAGGAATCGCTGCTTTTGCCCTCAGA丁GGCCCGACGTTGACTCCGAAGGTGGCAAGCGCCCGTCGTHs,134742GACCCCTGTCGCGATTCCGGAAGAGGCAAGAAGCCAG丁TTACGATTGATGACTTATTATGACTTGCGCTAAGATCTCGTTATCACTTGGGATGAGTGATAATGCCCAATGCCGGGCGCGCCTACCAAGCCCTCTGGAGGCCTGAGGAAT鞘氨醇激酶1Hs.68061無相配標記原纖維蛋白1(Marfan綜合病症)Hs.750無相配標記lipocalin2(癌基因24p3)Hs.204238nudix(核苷酸二磷酸連接部分X)型基序1Hs.413078TEA結構域家族成員1(SV40轉錄增強因子)Hs.153408人轉錄序列Hs.526560具有序列相似性20的家族，成員C跨膜運輸蛋白Hs.74137CTD(碳端結構域，RNA聚合酶II，多肽A)小磷酸酶1Hs.444468無相配標記腫瘤壞死因子(配體)超家族，成員10Hs.387871載脂蛋白A-I結合蛋白Hs.446535核心蛋白聚糖Hs.156316無相配標記POU結構域，族3，轉錄因子3Hs.248158染色體3開框區6HS.55098假定的蛋白FLJ12448Hs.432996類核因子(紅細胞衍生的2)2HS.155396酪氨酸3-單氧化酶/色氨酸5-單氧化酶激活蛋白，theta多肽Hs.74405無相配標記P450(細胞色素)氧化還原酶Hs.354056脂多糖誘導的具錨蛋白重複的分子(MAIL),小鼠同源Hs.390476CGACCCCACGCGCGGCGGCCGGCTAGGAACTACTTTTAGCTCATAAGGGGGCCCAGCGGTCGAAGGACGTTTCTCTGGTAGCAGCAATTCAATCAAGATCTGCAAATTTGTGACCTCTTTGATTGCGATTGGGGCTTC載脂蛋白EHs.110675C1q相關因子Hs.134012人cDNA克隆MGC:16614IMAGE:4111344，完整的cdsHs.406882KIAA1363蛋白Hs.22941無相配標記高爾基體(Agolgi)相關，含Y銜接蛋白耳結構(gammaadaptinearcontaining)的ARF結合蛋白1HS.405689無相配標記假定的蛋白MGC14288Hs.388645溶解的載體家族39(鋅運載體)，成員8Hs.284205酪氨酸3-單氧化酶/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白，eta多肽Hs.226755微管蛋白PMGC4083Hs.274398長祐基磷酸甘露糖基轉移酶-多肽2，調節亞單位Hs.108973與蛋白ref:NP_055131.1稍微相似的人轉錄序歹ij，鈣調熱穩定蛋白(24kDa)Hs.513334促進細胞分裂後期複合物亞單位7Hs.27084權利要求1.在適當的組織中抑制囊腫疾病或異常的方法，該方法通過使組織與有效量的調節表2-6中的基因或多聚核苷酸的生物活性的試劑接觸，從而抑制囊腫異常。2.根據權利要求1所述的方法，其中該適當的組織選自管狀腎組織、肝組織或胰腺組織。3.根據權利要求2所述的方法，其中該適當的組織從患ADPKD的受試者中分離。4.根據權利要求l所述的方法，其中該調節試劑是調節表2-6中列出的多聚核苷酸或基因的活性或表達的多聚核苷酸。5.根據權利要求4所述的方法，其中該試劑是特異性結合基因或多聚核苷酸表達產物的抗體或配體。6.根據權利要求4所述的方法，其中該試劑選自反義多聚核苷酸、核酶或多價RNA核酸適體。7.根據權利要求5所述的方法，其中該試劑是抗體或抗體衍生物。8.根據權利要求5所述的方法，其中該試劑是多克隆抗體或單克隆抗體。9.根據權利要求7所述的方法，其中該抗體衍生物選自抗體片段、人源抗體或嵌合型抗體。10.根據權利要求1所述的方法，其中該試劑是調節、阻斷或增強該基因或多聚核苷酸的表達產物的翻譯後修飾的小分子。11.根據權利要求1所述的方法，其中該試劑是調節該多聚核苷酸或基因表達產物的前體的活性的小分子。12.抑制受試者中多發囊腫損傷的形成的方法，包括向受試者投遞有效劑量的調節表2-6中列出的基因的生物活性的試劑，從而抑制多發囊腫損傷的形成。13.根據權利要求12所述的方法，其中該調節試劑是抑制或增強TGF-ct多聚核苷酸的活性或表達的多聚核苷酸。14.根據權利要求12所述的方法，其中該試劑是特異性結合該棊因或該多聚核苷酸的表達產物的抗體或配體。15.根據權利要求13所述的方法，其中該試劑逸自反義多聚核苷酸、核酶或多價RNA核酸適體。16.根據權利要求14所述的方法，其中該試劑是抗體或抗體衍生物。17.根據權利要求14所述的方法，其中該試劑是多克隆抗體或單克隆抗體。18.根據權利要求17所述的方法，其中該抗體衍生物選自抗體片段、人源抗體或嵌合型抗體。19.根據權利要求12所述的方法，其中該試劑是調節、阻斷或增強表2-6中列出的多聚核苷酸或基因的翻譯後修飾的小分子。20.根據權利要求12所述的方法，其中該試劑是調節表2-6列出的該多聚核苷酸或基因的表達產物的前體活性的分子。21.預防或治療適當的受試者的常染色體顯性多囊腎疾病(ADPKD)的方法，包括向需要的受試者投遞有效量的調節表2-6中列出的基因或其表達產物的多囊性生物活性的分離的分子。22.根據權利要求21所述的方法，其中該分離的分子是調節TGF-d多聚核苷酸的活性或表達的多聚核苷酸。23.根據權利要求21所述的方法，其中該分子是特異性結合該基因或該多聚核苷酸的表達產物的抗體。24.根據權利要求22所述的方法，其中分子選自反義多聚核苷酸、小分子、核酶或多價RNA核酸適體。25.根據權利要求22所述的方法，其中該分子是抗體或抗體衍生物。26.根據權利要求22所述的方法，其中該試劑是多克隆抗體或單克隆抗體。27.根據權利要求26所述的方法，其中該抗體衍生物是選自抗體片段、人源抗體或嵌合型抗體、28.根據權利要求22所述的方法，其中該分子是調節、抑制或增強表2-6中列出的基因或多聚核苷酸或基因的表達產物的翻譯後修飾的小分子。29.根據權利要求22所述的方法，其中該分子是調節表2-6中列出的多聚核苷酸或基因的表達產物的前體的活性的分子。全文摘要本發明涉及通過抑制目前與多囊病表現相關的基因來診斷和治療該疾病的組合物和方法。僅作為舉例說明，組織生長因子α基因(TGF-α)即為這樣的基因之一。本發明還涉及治療或改善異常囊腫機能障礙和與組織中囊腫形成相關的疾病的方法和組合物。所述方法和組合物通過抑制或增加基因表達或該基因表達產物或其受體的生物活性來治療和改善組織中病態囊腫形成。文檔編號A61K48/00GK101443046SQ200580027619公開日2009年5月27日申請日期2005年6月23日優先權日2004年6月23日發明者J·M·麥克弗森,O·別斯克羅夫那婭申請人:建新公司