大豆組培苗和轉化苗在無菌條件下培養結莢成熟技術的製作方法
2024-02-27 04:12:15 1
專利名稱：大豆組培苗和轉化苗在無菌條件下培養結莢成熟技術的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物組織培養與遺傳轉化技術領域，是一種大豆組培苗和轉化苗在無菌條件下培養結莢成熟的技術。
背景技術：
大豆原產於我國，是重要的經濟作物，也是我國居民食用油和植物蛋白的主要來源。大豆品種改良主要採用傳統育種方法，如雜交育種法，但在大豆抗不良環境(如病、蟲、 草害等)脅迫的育種方面使用雜交育種法因抗源匱乏有一定的局限性。隨著分子生物學和分子遺傳學的發展，利用轉基因技術將外源基因轉入植物中，以改良受體某些不良性狀的分子育種法，已展示出良好的應用前景。大豆轉基因常採用農桿菌介導法和基因槍轟擊法，這些遺傳轉化方法都是植物組織培養技術為基礎的，外植體(如胚尖、末成熟子葉等)在無菌條件下培養過程中將外源有益基因轉入受體，並經過抗性篩選得到抗性個體。不論是一般大豆組織培養得到的組培苗， 還是經過轉基因及抗性篩選得到的轉化苗，要完成生育周期得到種子常規方法都是經過練苗，將其從組織培養瓶中取出移栽到特殊配製的基質中，如蛭石、珍珠巖等，在具有調溫控溼的智能溫室中細心培養這些小植株，使其開花、結莢、成熟。因為經過組織培養得到的組培苗和轉化苗都比由種子萌發產生的苗小、生長也較弱。組織培養再生小植株從培養瓶轉到溫室中生長，因環境變化較大，很難適合溫室的生長環境，導致移栽成活率不高。採用本技術將再生小植株在無菌條件下培養得到成熟的大豆種子，為一些有大豆組織培養與轉化研究條件、但不具備智能溫室等配套設備的研究單位提供了一種從大豆組培苗和轉化苗得到種子的簡便技術。
發明內容
本發明描述以大豆為實驗材料，將經器官發生和體細胞胚胎發生途徑獲得組培苗、經轉基因及抗性篩選得到轉化苗轉接到40X250mm直形管中，在18 25°C、光照時間 14h、光照強度2500 11500LUX、相對溼度30 40 %的智能型人工氣候箱中培養，4 6 周在無菌條件下向直形管中添加1/2MS或MS液體培養基補充營養，培養30 50d時大豆開花，40 60d時結莢、90 120d得到成熟大豆種子，以此完成在無菌培養條件下從大豆組培苗和轉化苗到開花、結莢、成熟全過程。解決了大豆組培苗和轉化苗移栽到溫室時成活低、在溫室中生長高能耗、對環境條件要求較高等問題，是一種簡便易行由大豆組培苗和轉化苗獲得種子的技術。
具體實施例方式大豆組培苗和轉化苗在無菌條件下培養結莢成熟技術通過以下步驟實現方案一大豆成熟種子胚尖不定芽的組培苗和轉化苗在無菌條件下培養結莢成熟(一 )大豆成熟種子胚尖不定芽的組培苗和轉化苗的獲得
1大豆成熟種子誘導胚尖不定芽經器官發生途徑獲得組培苗挑選成熟無病蟲害的大豆種子，浸泡在75%乙醇溶液中3 5min，用0. 的 HgCl2溶液消毒15 20min，無菌水衝洗3 4次後，浸於無菌水25°C暗培養M 4 (期間換水)。取浸泡後萌動的大豆種子，在超淨工作檯中剝去種皮、去掉兩片子葉、兩片原葉和胚根，取胚尖接種於不定芽誘導培養基(MS+3 ^ig/L 6-BA，每升培養基中附加3%蔗糖， 0.7%瓊脂粉，pH調至5. 8 6. 2，下同)中，置於溫度25士 1°C、光照16h/d，強度2000 3000Lux的條件下誘導M 4 後，將大豆胚尖轉接到不定芽伸長培養基(MS+0. 05 Img/ L 6-BA+0. 1 0. 2mg/L IBA)培養，條件同不定芽誘導，2周更換一次培養基。 2大豆成熟種子胚尖農桿菌介導遺傳轉化獲得轉化苗將大豆胚尖在誘導培養基上培養M 48h，種子消毒、剝取胚尖與接種的方法，以及胚尖不定芽誘導培養基和培養條件等同大豆胚尖不定芽組培苗的誘導。挑取農桿菌一單菌落，接種於加有相應抗生素的YEP液體培養基中，在170 250r/min振蕩培養至對數生長期(OD6tltl 0. 5)，菌液在4000r/mir^4°C )離心lOmin，棄上清液，沉澱的菌體用等體積的重懸液(1/2MS，不加瓊脂，加lOOmmol/LAS，其他同胚尖不定芽誘導培養基)重懸，靜止30min，待侵染。將經誘導培養的大豆胚尖放到農桿菌液中浸泡10 30min，期間不斷搖晃使其充分接觸。取出後用濾紙吸掉胚尖周圍的農桿菌液，擺放在鋪有一層濾紙的共培養基(1/2MS， 加入lOOmmol/LAS，其他同胚尖不定芽誘導培養基)上，在25°C培養箱中暗培養3d，再轉接到含有抗性篩選劑和脫菌劑的不定芽伸長培養基培養，培養基與培養條件同不定芽的誘導，2周更換一次培養基。( 二)大豆胚尖不定芽的組培苗和轉化苗在無菌條件下培養結莢成熟大豆胚尖不定芽組培苗和轉化苗培養至苗高3 km時，切取不定芽組培苗轉接於含有生根培養基(MS+0. 1 0. 5mg/L IBA)的大直形管中；切取不定芽轉化苗轉接於含有抗性篩選劑和脫菌劑的生根培養基的大直形管中。大直形管為40 X 250mm，每管接種一棵胚尖不定芽，用12 X 12mm雙層封口膜封口， 大豆苗處於無菌條件放在智能型人工氣候箱中培養，溫度18 25°C、光照時間14h、光照強度2500 11500LUX、相對溼度30 40%，具體培養條件見表1。4 6周在無菌條件下向直形管中添加1/2MS或MS液體培養基補充營養，培養30 50d時大豆開花、40 60d時結莢、90 120d大豆種子成熟，以此完成在無菌培養條件下從大豆胚尖不定芽的組培苗和轉化苗到開花、結莢、成熟的全過程。表1大豆組培苗和轉化苗在無菌條件下培養結莢成熟的培養條件
權利要求
1. 一種大豆組培苗和轉化苗在無菌條件下培養結莢成熟技術的特徵在於將大豆經組織培養和遺傳轉化得到的組培苗和轉化苗轉接到40 X 250mm直形管中，在智能型人工氣候箱中設置以下條件培養完成大豆組培苗和轉化苗到開花、結莢、成熟的全過程。光照或黑暗時間(h)光照強度(Lux)溫度(°c)相對溼度22500204025400254051150025303870025402540025401001840
全文摘要
一種大豆組培苗和轉化苗在無菌條件下培養結莢成熟技術，涉及植物組織培養與遺傳轉化技術領域。本發明以栽培大豆為實驗材料，將經器官發生和體細胞胚胎發生途徑獲得的組培苗和經轉基因及抗性篩選得到的轉化苗轉接到40×250mm直形管中，在溫度18～25℃、光照時間14h、光照強度2500～11500Lux、相對溼度30～40％的智能型人工氣候箱中培養，4～6周向直形管中添加1/2MS或MS液體培養基補充營養，以此完成在無菌培養條件下從大豆組培苗和轉化苗到結莢成熟全過程。主要解決了大豆組織培養與遺傳轉化過程中組培苗和轉化苗移栽成活率低、移栽到溫室中生長需高能耗、對環境條件要求較高等問題。
文檔編號A01H4/00GK102283117SQ20111018424
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月28日 優先權日2011年6月28日
發明者季靜, 王罡, 王萍 申請人:淮海工學院