一種有效的蛇足石杉愈傷組織培養方法與流程
2024-02-27 16:01:15
本發明屬於農業技術領域，具體地說，涉及一種有效的蛇足石杉愈傷組織培養方法。
背景技術：
蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb)Trev.)為蕨類植物，屬石杉(Huperiaceae)，石杉屬(Huperzia Bernh)，又名救命王、千層塔、金不換。民間用於治療癰癤腫毒，跌打損傷等。分布於全國各地，也廣布於亞洲其他地區、大洋洲以及中美洲的古巴、墨西哥等地[1]。多生於山地密林下或溝谷陰溼土中,海拔400m～1600m.群落上層喬木樹種主要有毛竹(Phyllostachys heterocyc la)、三尖杉(Cephalotaxus fortunei),灌木樹種有木斷木(Loropetalum chinense)、金銀花(Lonicera japonica)、映山紅(Rhododendron mariesii)、紫金牛(Maesa japonica)、格藥柃(Eurya muricata),草本植物有蕨、多花黃精(Polygonatum cyrtonema)、三脈紫菀(Aster geratoides)、澤蘭(Eupatorium japonicum)及浙皖粗筒苣苔(Briggsia chienii),蛇足石杉伴生植物有金髮蘚(Polytrichum commune)及暖地大葉蘚(Rhodobryum giganteum)等蘚類。植株為叢生的草本植物,高10cm～24cm,莖上部為紅色或綠色.不定根生於主莖基部,伸入土中或基質.主莖直立,或下部斜升,圓柱形,單一或一至數回二叉分枝,春季其頂端常生有芽胞,外被1個～3個綠褐色卵狀披針形芽鱗片,芽胞落地成新苗.葉螺旋狀著生,橢圓狀披針形,有明顯的短柄,葉長1cm～3cm,寬2mm～4mm,頂端銳尖,基部漸狹成楔形,邊緣有不規則的尖鋸齒；中脈明顯；葉薄紙質,兩面光滑.孢子葉與營養葉同形或異形,綠色；孢子囊腎形,單生於葉腋間,不集成穗,多生於植株的上部,淡黃色,光滑,成熟時橫裂；孢子一型,圓球狀四面體[2]。
蛇足石杉是一種珍貴的藥用植物,自1972年國內首次報導該植物的生物鹼在動物試驗上有橫紋肌松馳作用後,已從中分得13個生物鹼單體.藥理實驗證明,石杉鹼甲和乙具有很強的抑制膽鹼酯酶的活性、提高學習記憶和改善老年人記憶功能的效果,並能用於治療重症肌無力.鑑於其重要的藥用價值,對它的研究已被廣泛重視[2]。
近年來，由於人們認識到：蛇足石杉含有的石杉鹼甲具有高抗膽鹼脂酶活性，對於改善記憶力，治療中老年痴呆及重症肌無力具有良好的療效且毒副作用小，潛在的市場前景廣闊，因此，該植物越來越受到人們的重視。但由於蛇足石杉資源分散，而且許多相對集中的產地均位於自然保護區和風景區範圍內，同時，蛇足石杉是一種多年生、生長緩慢的小草本，年淨生物量的增長速率極為有限，長成一顆高12cm的成苗，在自然條件下大約需要6～7年的時間，資源更新周期較長，不可大規模開採，現有技術中急需一種有效的蛇足石杉愈傷組織培養方法。
技術實現要素：
本發明的目的在於克服上述技術存在的缺陷，提供一種有效的蛇足石杉愈傷組織培養方法。
其具體技術方案為：
一種有效的蛇足石杉愈傷組織培養方法，包括以下步驟：
步驟1、蛇足石杉莖尖採用洗潔精清洗2次，無菌水清洗4次，採取0.15％升汞液滅菌5min，無菌水清洗4-6次；
步驟2、將步驟1中清洗好的蛇足石杉莖尖在解剖鏡下取0.1-0.2mm長的微莖尖；
步驟3、將微莖尖進行蛇足石杉愈傷組織培養，採用MS培養基，加入0.1μM IBA和1.5μM KT以及3mg/L穀氨醯胺，培養條件為25度恆溫，14h光周期培養。
進一步，步驟3中培養過程中加入抑制內生菌的方案為：青黴素50000IU/L，鏈黴素50mg/L，兩性黴素B 750μg/L，孔雀石綠1.5-1.8mg/L。
與現有技術相比，本發明的有益效果：
本發明提供了迄今為止蛇足石杉人工組織培養的有效方法與技術，出愈率可達25％以上，採用多次滅菌和添加內生菌抑制劑AAS的方法，解決了蛇足石杉愈傷組織培養過程中產生的內生真菌汙染問題，有望實現蛇足石杉愈傷組織培養方法上的突破。
具體實施方式
下面結合具體實施方案對本發明的技術方案作進一步詳細地說明。
1.1材料
實驗材料採自於江西省廬山，由胡頌平老師2014年12月引種於江西農大溫室內。
1.2培養基
1.2.1培養基類型
四種培養基：(1)MS+0.1μM IBA+1.5μM KT+3mg/L穀氨醯胺；(2)1/2MS+0.1μMIBA+1.5μM KT+3mg/L穀氨醯胺；(3)1/2MS+3mg/L穀氨醯胺/無激素；(4)MS+3mg/L穀氨醯胺/無激素
2.2.2培養基滅菌
高壓滅菌，滅菌時間為15min，滅菌溫度為121℃
1.3方法
1.3.1外植體的選取及消毒
兩種消毒方法：
(1).洗潔精清洗2次→無菌水清洗4次→0.15％升汞液滅菌5』→無菌水衝洗4-6次。(2)洗潔精清洗2次→無菌水清洗4次→0.01M HCl浸泡1min→5％NaOCl浸泡1min→2.4mM檸檬酸浸泡1min→75％酒精浸泡30秒→5％NaOCl浸泡2min→8％H2O2浸泡8min；
1.3.2培養方法
將消毒好的蛇足石杉莖尖在解剖鏡下取0.1-0.2mm長的微莖尖，然後設置兩種培養條件：(1)25度恆溫，14h光周期。(2)25度恆溫,暗培養。
2結果分析
2.1不同消毒方法對愈傷組織誘導的影響
本發明採用(1).洗潔精清洗2次→無菌水清洗4次→0.15％升汞液滅菌5min→無菌水衝洗4-6次。(2)洗潔精清洗2次→無菌水清洗4次→0.01M HCl浸泡1min→5％NaOCl浸泡1min→2.4mM檸檬酸浸泡1min→75％酒精浸泡30秒→5％NaOCl浸泡2min→8％H2O2浸泡8min→無菌水衝洗4-6次；結果是採用第一種方法消毒的外植體在真菌感染程度上比第二種輕，因此，第一種消毒方法更好。
2.2不同培養基對愈傷組織誘導的影響
本發明採用四種培養基見表1，由於有內生真菌的感染，16瓶1號培養基有4瓶成功誘導出愈傷組織，而且正常生長6個月至愈傷組織顯淡綠色；該培養方案的愈傷組織誘導率為25％。
(1)MS+0.1μM IBA+1.5μM KT+3mg/L穀氨醯胺；(2)1/2MS+0.1μM IBA+1.5μM KT+3mg/L穀氨醯胺；(3)1/2MS+3mg/L穀氨醯胺/無激素；(4)MS+3mg/L穀氨醯胺/無激素
表1蛇足石杉微莖尖在不同培養基上的愈傷組織發生率
2.3培養條件對愈傷組織誘導的影響
影響愈傷組織誘導最主要的環境條件是溫度和光照。誘導愈傷組織的溫度一般以25度左右為宜。光照可用全暗、周期性光照、全日光照。本發明中，得出對蛇足石杉的愈傷組織誘導，周期性光照培養比暗培養好，這與一般植物組織培養表現相一致[3]。
2.4AAS及孔雀石綠對內生真菌的抑制效果
AAS是由青黴素、鏈黴素和兩性制黴素B等抗生素按不同比例混合組成，抗生素在很低濃度時就能抑制殺滅病原微生物。孔雀石綠易溶於水和乙醇，具有抗菌、殺蟲等藥效,可用作驅蟲劑和殺菌劑,以殺滅水產動物體外的寄生蟲、原生動物和魚卵中的黴菌等,是抗菌效力較強的一類。
表2不同濃度AAS和孔雀石綠抑制內生真菌的效果
本發明採用了如表2所示的不同濃度AAS，開展了對蛇足石杉內生真菌抑制效果的研究，結果表明，兩性制黴素B等對內生真菌並無明顯抑制效果，而當孔雀綠濃度達1.5毫克/升時大部分真菌被抑制，但黑色的黴菌仍有少量生長，所以採用AAS並不能如Wojciech[4]所說可以解決內生真菌汙染的問題；建議培養過程中AAS最佳抑制內生菌的方案為：青黴素50000(IU/L)，鏈黴素50(mg/L)，兩性黴素B 750(μg/L)，孔雀石綠1.5-1.8(mg/L)。
以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，本發明的保護範圍不限於此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明披露的技術範圍內，可顯而易見地得到的技術方案的簡單變化或等效替換均落入本發明的保護範圍內。