定性檢測tpmt基因亞型的測序引物對及其試劑盒的製作方法
2024-01-26 04:42:15
專利名稱：定性檢測tpmt基因亞型的測序引物對及其試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及體外核酸檢測領域，尤其涉及一種在臨床樣本中區分TPMT基因中的*3A/3B/3C基因亞型的測序引物對及其試劑盒。
背景技術：
疏嘌呤甲基轉移酶TPMT (thiopurine S-methyltransferase, TPMT),是一種胞眾酶，廣泛分布於肝、腎、心、腦、肺、骨骼肌及血細胞組織中，主要催化芳香及雜環類巰基化合物的S-甲基化反應。巰嘌呤類藥物，如6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤和硫唑嘌呤，在臨床上作為抗腫瘤藥用於急性白血病的治療，或作為免疫抑制劑廣泛應用於器官移植、炎性腸病等的治療。TPMT在這類藥物的代謝過程中起著關鍵作用。巰嘌呤類藥物的療效和毒性均與患者體內的TPMT的酶活性有關。TPMT酶活性高的患者長期服用這類藥會產生耐受性而且復發率很高，而TPMT酶活性低的患者服用常規劑量的巰嘌呤類藥物後會發生嚴重的造血系 統毒性。TPMT的酶活性與其基因多態性相關，突變導致基因編碼的蛋白水解增強、穩定性，迄今已發現20餘種導致酶活性降低的突變。TPMT基因突變類型在不同種族間存在顯著性差異。白種人最常見的突變類型是TPMT*3A，其次是TPMT*2和TPMT*3C，其中TPMT*2在其他人種中非常罕見。黑人中最常見的TPMT基因突變類型是TPMT*3C，其次是TPMT*3A。而亞洲人多為TPMT*3C，也檢測到TPMT*3A。據文獻顯示，在漢族人群中，TPMT*3C是目前唯一被發現的突變型等位基因，且均為雜合子，突變頻率約為I. 3%，這與日本人分布特徵相似(亦僅發現TPMT*3C，等位基因頻率I. 60%)。通過對患者基因分型檢測，判定患者的TPMT酶活性，從而幫助醫生正確選擇藥物併合理調整藥物劑量，提高藥物使用有效性，並降低毒副作用。焦磷酸測序技術是近年來發展起來的新一代DNA序列分析技術，它通過核苷酸和模板結合後釋放的焦磷酸引發酶級聯反應，促使螢光素髮光並進行檢測，既可進行DNA序列分析，又可進行基於序列分析的單核苷酸多態性檢測及等位基因頻率測定，突變檢測，缺失和插入分析，CpG島甲基化分析，細菌、病毒鑑定和分型，耐藥性分析等，是一個理想的遺傳分析技術平臺。焦磷酸測序技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應。其技術原理是引物與模板DNA退火後，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurytase).突光素酶(Iuciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase) 4種酶的協同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次螢光信號的釋放偶聯起來，通過檢測螢光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。目前市場上還沒有利用焦磷酸技術進行TPMT基因分型的產品。
發明內容
本發明的目的是提供一種特異性高、準確性好、能夠定性檢測TPMT*3A/3B/3C基因亞型的測序引物對及其試劑盒。為了達到上述目的，本發明採用如下技術方案一種檢測TPMT基因亞型的測序引物對，所述引物對為如下引物TPMT 460 正向擴增引物5' -CAGCAGAGGGGACATGAAAT-3' (SEQ ID NO. I)；TPMT 460 反向擴增引物5' -CTTTGGAATGGCACAGGGTAC-3' (SEQ ID NO. 2)TPMT 460 測序引物5' -CTTCAAGGTGTAAAATGC-3' (SEQ ID NO. 3)TPMT 719 正向擴增引物5' -TGAAAGTGAACTCCCTGCTACC-3' (SEQ ID NO. 4)TPMT 719 反向擴增引物5' -TCCACTGGGATCAACAGTATCTT-3' (SEQ ID NO. 5) TPMT 719 測序引物5' -CGCCCTCTCCTACTTA-3' (SEQ IDN0. 6)其中，TPMT460 反向擴增引物(SEQ ID NO. 2)和 TPMT 719 (SEQ ID NO. 6)反向擴增引物的5'端分別進行生物素標記。一種定性檢測TPMT基因亞型的測序試劑盒，所述試劑盒包括含有SEQ ID NO. I所示正向擴增引物的PCR反應液1，含有SEQ IDN0. 4所示正向擴增引物的PCR反應液2，SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示的反向擴增引物，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 6所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示引物的5』端進行生物素標記。進一步地，所述試劑盒中還包括質控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 7) (controloligo)和作為空白對照品的超純水；質控序列是由QIAGEN設計合成的一段寡聚核苷酸鏈，用於檢測PyroMark Q24測序儀的各項性能指標。進一步地，所述試劑盒還包括TPMT 460陽性對照品1，TPMT 460陽性對照品2，TPMT 460陽性對照品3 ；TPMT 719陽性對照品I，TPMT 719陽性對照品2，TPMT 719陽性對照品3 ;所述TPMT 460陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的TPMT460野生純合子質粒；所述TPMT 460陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列的TPMT460突變純合子質粒；TPMT 460陽性對照品3為由所述TPMT 460突變純合子質粒和所述TPMT 460野生純合子質粒組成的TPMT 460質粒混合物；所述TPMT 719陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的TPMT719野生純合子質粒；TPMT 719陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的TPMT 719突變純合子質粒；TPMT 719陽性對照品3為由所述TPMT 719突變純合子質粒和所述TPMT719野生純合子質粒組成的TPMT 719質粒混合物；其中，質粒載體為pMD18-T質粒；所述TPMT 460質粒混合物中TPMT 460突變純合子質粒和所述TPMT 460野生純合子質粒的數量比為I: I ;所述TPMT719質粒混合物中TPMT719突變純合子質粒和所述TPMT 719野生純合子質粒的數量比為1:1。所述的PCR反應液I和PCR反應液2中其他組分為常規的IOxPCR Buffer、dNTP和H2O,各組分按常規體積比配置(IOxPCR Buffer、dNTP、H2O和反應液中引物的體積比為5:3:37. 5:1)。試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規試劑，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、螢光素酶和雙磷酸酶組成的酶混合物，由5』-磷醯硫酸和螢光素組成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。本發明的優點及有益效果
I)本發明提供的定量檢測TPMT基因亞型的焦磷酸測序試劑盒定性準確，具有靈敏性高、特異性強的優點，樣品處理簡單，測序速度快，高通量，半個小時完成一次上機反應，直接給出檢測位點頻率分析，結果直觀。2)本發明提供的定量檢測TPMT基因亞型的焦磷酸測序試劑盒靈敏度和特異性聞;3)本發明提供的定量檢測TPMT基因亞型的焦磷酸測序試劑盒檢測速度快；4)本發明提供的定量檢測TPMT基因亞型的焦磷酸測序試劑盒步驟簡單；5)本發明提供的定量檢測TPMT基因亞型的焦磷酸測序試劑盒可同時進行高通量的樣本檢測。6)本發明的試劑盒中設置了空白對照和陽性對照，能更好的確保檢測結果的準確·性。由於設計了靈敏度高，特異性好的引物，並且選擇了合適的方法，本發明的試劑盒能夠對TPMT基因亞型進行快速檢測。本發明的試劑盒可實時監測反應進程，反應時間短，PCR產物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應時間短，高通量，比金標準——毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用於突變分析。
圖I為臨床TPMT 460野生純合子的焦磷酸測序圖；圖2為臨床TPMT 719雜合子的焦磷酸測序圖；圖3為臨床質控品control oligo的焦磷酸測序圖；圖4為臨床空白對照的焦磷酸測序圖。圖5多組設計引物的凝膠電泳圖；圖中①、②表明非特異性條帶，③表明特異性和片段大小均比較合適，④表明目的帶片段大小不對。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本發明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。實施例I :試劑盒的製備I.引物和探針的設計與合成使用PyroMark Assay Design2. O軟體，針對TPMT的7號外顯子和10號外顯子以及中間的內含子區域，研究表明漢族人中目前針對TPMT基因分型主要集中在*3A/3B/3C中(William ZF et al. J Gastrointestin Liver Dis. 2011;20(3). 247-253. Shuta U etal. Pharmacogenetics and Genomics. 2008;18. 887-893. William EE et al. Journal ofClinical Oncology. 2001;19(8). 2293-2301. Oreste E et al. Pharmacogenetics and
Genomics. 2005; 15. 801-815.)，選擇特異的突變位點-TPMT G460A、A719G，其中擴增引
物和測序引物先經過PAGE純化，再經HPLC純化，其中擴增引物其中一條在5』端加上生物
^己O擴增序列如表I :
表I.特異性擴增引物與測序引物序列
權利要求
1.一種定性檢測TPMT基因分型的測序引物對，其特徵在於，所述引物對為SEQ IDNO. I和SEQ ID NO. 4所示的正向擴增引物，SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示的反向擴增引物，SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 6 所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 5 PJf示引物的5』端進行生物素標記。
2.一種定性檢測TPMT基因分型的測序試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括含有SEQID NO. I所示正向擴增引物的PCR反應液1，含有SEQ ID NO. 4所示正向擴增引物的PCR反應液2，SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示的反向擴增引物，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 6所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示引物的5』端進行生物素標記。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒中還包括SEQID NO. 7所示的質控品和空白對照品。
4 權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於，所述空白對照品為水。
5.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括TPMT460陽性對照品1，TPMT 460陽性對照品2，TPMT 460陽性對照品3 ；TPMT 719陽性對照品1，TPMT719陽性對照品2，TPMT 719陽性對照品3 ； 所述TPMT 460陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的TPMT 460野生純合子質粒；所述TPMT 460陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列的TPMT460突變純合子質粒；TPMT 460陽性對照品3為由所述TPMT 460突變純合子質粒和所述TPMT460野生純合子質粒組成的TPMT 460質粒混合物； 所述TPMT 719陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的TPMT 719野生純合子質粒；TPMT 719陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的TPMT 719突變純合子質粒；TPMT 719陽性對照品3為由所述TPMT 719突變純合子質粒和所述TPMT 719野生純合子質粒組成的TPMT 719質粒混合物； 其中，質粒載體為PMD18-T質粒。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述TPMT460質粒混合物中TPMT 460突變純合子質粒和所述TPMT 460野生純合子質粒的數量比為1:1。
7.如權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述TPMT719質粒混合物中TPMT 719突變純合子質粒和所述TPMT 719野生純合子質粒的數量比為1:1。
全文摘要
本發明提供一種定性檢測TPMT基因亞型的測序引物對及其試劑盒，屬於體外核酸檢測領域，所述試劑盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR反應液、PCR擴增引物、焦磷酸測序引物、以及對照品；本發明提供的試劑盒靈敏度高，特異性好，PCR產物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應時間短，比金標準——毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用於SNP分析。
文檔編號C12Q1/68GK102899407SQ20121034832
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者陳豔 申請人:長沙三濟生物科技有限公司