一種針對人opn基因用於腫瘤基因治療的短的幹擾核糖核酸的製作方法

2024-01-21 19:03:15

ctccctgtgtcagcagcagcttgcagccttEltttgCttttagttctg鄉cctgacccatgaaagccatgcaggactccatctgatgagtctgccagc朋ggtgatagtgcagtaccctgggtgcatacacgtgggaaggC3C33gC3gtgtgattgatatttcgtattttacaatttctaacatga犯ttaactaatgtaasgcttcagttaatatttgcccacttaaatgtat3tttttaagaatttgtggtggagg3agg鄉aggcCtC8gCC8朋gcctcctaggaaaagcagctctcagaagcattgactcg朋ctcaccattcccgaagtttttggtttatggaggccatcccacagttatgagtcaggaactstatgctggtCtC3tg犯ttcactttgcatgcttctttctgtttgataatggttstgtctttattctctcgttgtgstt已gtggtgtc犯tttttactgctgtctgcagcagagcscagccgccgacc肌catcacctgtttacaacaaag犯tctcctatgattgttggatcgactctgattgatgaatctcsctccagttactgaggtcEtcgaggacatccgttgcccagaacggigtcagt33gCgg333ttccaaagtctgtagacccc￡lg￡lt3gtgC3cagtttattgtagtttagttatgttcattcaacattt;tattctttttgtgttgcttatttagcatttaaa3tCgtCggg3gg朋aactcagccataccagtacccagatggccccacagagatga卿tggatgt柳tggatgaactgggtccccacaggacctgaacgctggatg獄gccaatgatgagccgtgaattcttctgaggggtaaaaatgcgttg組gtgtgtggcttcagtcactataagtgtg犯t犯gttttcccac狐記33鄉詔ttctggg鄉ccagactcgtctsccatgagttaaacaggcctgtggccaccccttccaagatg8tg3ccaacactgatgatc過ctgatttagtttcgcetgtgg,gcgacgccttctgaagagtgctgatccacagccatttatagcaiatatctatttgtggaaactccatgca朋cta犯gca^ieic犯tcttttgtttatctUtatxggttgt:ccaggcttggttgtctcaggccag幼ttgC3gtgtgattctggaatggct犯actaagtccaactgtggacagcttctcaccagtcccacggactgatggccgaacctgacatcttgggacagc^CCC3C3gCgcattccgattga3tttcm;;Hgtctgga^Ctgt犯3CUlt:cactgtattaatetcttttHttgaatgt肌針對OPN設計可能有效的siRNA靶點:tableseeoriginaldocumentpage13GTCAGGMCTTTCCAMGT274542.86%GCMTGAGCATTCCGATGT271847.62%TGCTGGTTGTAGACCCCAA280847.62%CCCTTCCMGTAAGTCCM217552.38%GATTATATMGCGG嵐GC1.568833.33%TGTAGATGACACTGATGAT1.528738.腦AAGCTAATGATGAGAGCAA1.570338.應ATGATGAGAGCAATGAGCA1.570938.10%ACGACTCTGATGATGTAGA1.527442.86%ACCGMGTTTTCACTCCAG1.538442.86%AGGACAGTTATGAAACGAG1.562242.86%ATGAGCATTCCGATGTGAT1.572142.86%TTGACTCGMCGACTCTGA1.526547.62%CACTGATGATTCTCACCAG1.529647.62%CTGATGATTCTCACCAGTC1.529847.62%TTCTCACCAGTCTGATGAG1.530547.62%GTCTGATGAGTCTCACCAT1.531447.62%CATATGATGGCCGAGGTGA1.542147.62%CTCCATTGACTCGMCGAC1.526052.38%CCTGCCAGCMCCGMGTT1.537452.38%CACATGGMAGCGAGGAGT1.553152.38%GATGCTGTGGCCACATGGC1.511157.14%CAGCCAGGACTCCATTGAC1.525157.14%GACCTGACATCCAGTACCC1.548457.14%CCTGAACGCGCCTTCTGAT1.558757.14%CAGCCGTGGGAAGGACAGT1.561157.14%GCCGTGGGMGGACAGTTA1.561357.14%GCCGTGAATTCCACAGCCA1.576657.14%GATAMCACCTG織TTTC1.584033.33%GTAAGGAAGMGAT総CA1.582938.10%GGMGAAGATAAACACCTG1.583338.應TTAGATAGTGCATCTTCTG1.587338.10%TGATATCGATGATGMGAT1.521533.33%TATGGATGATGAAGATGAT1.521833.33%TTCTGATGMTCTGATGAA1.533233.33%合成12對siRNA;耙序列為5，GCAGCTTTACAACMATACCC3，5'TCTCCTTGCGCCACAGAAT3'5，GGACAGTTATGAAACGAGT3，5'GCATTCCGATGTGATTGAT3，5'CCATTCTGATGMTCTGAT3，5，GCCTTATATCGTGATCTGC3，5，GATGCCAACGATTCCTCCT3'5，CTCTTCGGGATTGTTTCCA3，5，ACACCTG嵐TTTCGTATT3'5，Tcaggccagttgcagccttct3，5，GTTGTCCAGCMTTAATM3，5，GCATCTTCTGAGGTCMTTA3，轉染293細胞；活細胞計數用無血清培養基把細胞懸液稀釋到2002000個/毫升(一般稀釋倍數為100倍)，在0.1毫升的細胞懸液中加入0.1毫升的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數分鐘後，用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。細胞株的凍存取培養23天生長旺盛的細胞，用細胞培養液將細胞配成2X1062X107/ml。在lml細胞凍存管中加入0.5ml細胞懸液，0.4ral小牛血清和0.lml二甲基亞碸(或甘油)，混勻後密封。置4-Cl小時，一2(TC2小時，然後直接放入液氮中或置液氮蒸汽上過夜後浸入液氮中。細胞復甦從液氮罐中取出細胞凍存管，應帶有防護眼睛和手套。迅速放入盛有5(TC水的水浴中，並不時搖動，儘快解凍。用70%酒精擦拭消毒後，移至淨化臺上，吸出細胞懸液至培養瓶中，補加3ml含10%胎牛血清的DMEM培養基，置溫箱培養。次日更換一次培養液後再繼續培養。細胞傳代棄去舊培養液，加入5mL滅菌PBS溶液，輕輕晃動，洗滌細胞生長面，然後棄去PBS溶液。加入2mL胰酶消化液，消化l-2min直到細胞完全消化下來。加入含10%胎牛血清和100U/ml雙抗的DMEM培養基5ml，用刻度吸管吹打數次，將瓶壁上的細胞衝洗下來。混勻細胞後分至兩個新的培養瓶中，繼續培養。裝染棄去細胞液，加5mlPBS洗一次。加2ml胰酶消化1-2分鐘。棄去胰酶，加3-4mlMEM(不含血清)吹打均勻。將細胞滴加於6孔培養板中(每孔2ml)，使培養24小時後，細胞融合度控制在4050%。對於6孔板的每個孔，用2ug質粒DNA與245plDMEM混合。將LipofectAMINE2000試劑輕柔搖勻，取5jxiLipofect層INE2000試劑在另一管中與245ji1DMEM混合，在室溫下溫育5分鐘。把稀釋後的shRNA與稀釋後的LipofectAMINE2000進行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。必須在5分鐘之內混合。混合後，在室溫下溫育20分鐘，以便形成shRNA與LipofectAMINE2000稀釋液的轉染複合物。把shRNA與LipofectAMINE2000的混合液加入培養細胞，輕柔前後推搖培養板以混勻液體。然後將培養板送入細胞培養箱。在檢測RNAi效果(即檢測靶基因的mRNA和蛋白質水平)之前，一般無需換培養液。但如果以上轉染試劑用量時有明顯細胞毒性(如黏附細胞在轉染4小時後出現明顯較多細胞死亡)，那麼可以在轉染滿3小時但不滿4小時，將培養板中所有培養基棄去，並加入新鮮培養基(可以使用含血清的培養基)。RT-PCR檢測0PN的mRNA轉錄水平；RT1HiOligodT(O.5ug/ul)+2TotalRNA(lug/ul)+6PiDEPC-H20(mixwell470°C,lOmin4立即插入(TC冰水浴中4addllMlmixture4W5XRTbuffer2Wl關d證s0.5RNasin1PiMLV-RTase3.514DEPCH20I42°C，lhr470°C,lOmini0°C42ul用於PCR，其餘jC:存在-20°CPCRPCR引物退火溫度55°CPCR循環數目28cycles目的片斷大小400bpWestern檢測0PN的蛋白表達水平；1.加入適量預冷的6XLysisBuffer。2.用預冷的刮刀將細胞刮下，冰上裂解細胞10—15miri。3.超聲破碎儀破碎細胞(200W共4次，每次5秒，間隔2秒)4.4。C，12000g，離心15min。5.取上清，測蛋白濃度後，調整為2Pg/W的蛋白終濃度，取20-40Pg蛋白，加入6Xloading上樣緩衝液，10(TC煮5-10min。6.SDS-PAGE:根據目的蛋白大小及表達豐度，取一定量蛋臺總樣品進行相應分離膠濃度的SDS-PAGE。採用Bio-Rad電泳裝置將總蛋白進行分離。7.電轉移電泳結束後，使用轉移電泳裝置(Bio-Rad，Richraoad，CA)，在4°C，400mA恆流條件下電轉移120分鐘，將蛋白樣品轉移到PVDF膜上。8.封閉用TBST(TBS+0.05%Tween20)加5%牛奶配製成封閉液。室溫封閉PVDF膜1小時或4'C過夜。9.一抗孵育用含5X牛奶的TBST分別稀釋目的蛋白或者內參Actin—抗。室溫下與封閉好的PVDF膜孵育2小時或4"C過夜。10.洗膜TBST洗膜3次，每次10分鐘。11.二抗孵育用含5X牛奶的TBST稀釋與一抗相應的辣根過氧化物酶驢抗兔/小鼠二抗。於室溫下孵育2小時。12.洗膜TBST洗膜3次，每次10分鐘。TBS洗膜一次，10分鐘。13.ECL:採用Amersh柳公司ECL+plusTMWesternblottingsystem試劑盒進行顯色反應，於暗房中曝光、顯影、過水、定影。X光片(柯達)晾千待分析。有效的siRNA使用LNA修飾；修飾後的siLNA轉染293細胞(流程描述同前)；RT-PCR檢測0PN的mRNA轉錄水平(流程描述同前)；Western檢測OPN的蛋白表達水平(流程描述同前)；保留在mRNA水平和western水平抑制效率均達到90%的siLNA;進行動物實驗。權利要求1.一種針對人OPN基因用於腫瘤基因治療的短的幹擾核糖核酸(shortinterferingRNA，siRNA)。製備方法包括如下步驟A.從genebank中調取humanOPN基因序列；B.利用GeneChem軟體預測有效的siRNA位點；C.合成12個針對OPN基因的siRNA；D.12個siRNA轉染293T細胞；E.RT-PCR檢測這些siRNA對OPN基因的mRNA的抑制作用；F.Western檢測這些siRNA對OPN基因的蛋白表達水平的抑制作用；G.篩選mRNA水平和蛋白質水平抑制作用超過90％的siRNA。H.該siRNA是本權利要求書要求的專利材料。I.對該siRNA進行LNA化學修飾，增加其穩定性。J.將該siRNA構建入病毒載體，進行細胞學和動物水平實驗研究。2、根據權利要求1所述的用於腫瘤基因治療的siRNA(針對h咖anOPN基因)，其特徵在於所述的用於腫瘤基因治療的siRNA(針對humanOPN基因)是化學合成的RNA幹擾製品，針對OPN基因。3、根據權利要求1所述的用於腫瘤基因治療的siRNA(針對humanOPN基因)，其特徵在於其序列為5,GCAGCTTTACMCMATACCC3'5'TCTCCTTGCGCCACAGMT3'5'GGACAGTTATGAAACGAGT3，5'GCATTCCGATGTGATTGAT3'5，CCATTCTGATGAATCTGAT3:5'GCCTTATATCGTGATCTGC3，5，GATGCCMCGA竹CCTCCT3，5，CTCTTCGGGATTGTTTCCA3,5，ACACCTG嵐TTTCGTATT3，5，Tcaggccagttgcagccttct3，5,GTTGTCCAGCMTTMTM3,5，GCATCTTCTGAGGTCMTTA3，4、siRNA結構為,5，pNN麵ll,繼國誦國TT3，5、根據權利要求1所述的用於腫瘤基因治療的siRNA(針對human0PN基因),其特徵在於所述siRNA在mRNA水平的抑制效率大於90%。6、根據權利要求1所述的用於腫瘤基因治療的siRNA(針對human0PN基因)，其特徵在於所述siRNA在蛋白質水平的抑制效率大於90%。7、根據權利要求1所述的用於腫瘤基因治療的siRNA(針對h咖anOPN基因)，其特徵在於所述siRNA對腫瘤細胞的生長有明顯抑制作用。全文摘要本發明公開了一種針對人OPN基因用於腫瘤基因治療的短的幹擾核糖核酸(shortinterferingRNA，siRNA)。該siRNA使用RNA幹擾技術，通過利用短片斷的雙鏈RNA促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷特定基因的表達，誘使細胞表現出特定基因沉默的表型，被研究人員應用到疾病治療領域。OPN基因表達一種多功能蛋白質，參與人腫瘤發生和轉移。它廣泛存在於正常成人組織和體液中。我們通過實驗證明，抑制OPN基因表達之後，腫瘤細胞生長受到明顯抑制。文檔編號C07H21/02GK101210037SQ20061014796公開日2008年7月2日申請日期2006年12月26日優先權日2006年12月26日發明者曹躍瓊申請人:上海吉凱基因化學技術有限公司