腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)及腺苷脫氨酶活性濃度測定方法
2024-02-03 09:09:15
專利名稱：腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)及腺苷脫氨酶活性濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，同時本發明還涉及測定腺苷脫氨酶
活性濃度的方法，屬於醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
醫學研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機體細胞免疫活性有重要關係的核酸代謝 酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測定被作為良惡性胸腹水，腦脊液鑑別診斷，重症聯合免疫缺 陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鑑別的重要診斷標誌。 腺苷脫氨酶的活性測定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。據申請人了 解，目前國際上普遍採用紫外光法，其測定原理是腺苷(白色結晶粉末)+水(H。0)腺苷脫 fiS肌苷(Inosine) +氨離子(NH4+)，此反映過程生成的肌苷會在波長為265nm處顯現，因 此可以通過測定此波長處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無 法用一般醫院的可見光分析儀測定，而需要使用專門的紫外光分析儀，因此難以切實推廣 應用。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出 一 種利用酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，連續監測還原型煙醯胺輔 酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，同 時，本發明還將給出用以實現該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，採用該試劑(盒)不僅 可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行腺苷脫氨酶活性濃度測定，而 且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發明腺苷脫氨酶活性濃度測定方法如下
腺苷+水腺苷脫,氡酶肌苷+氡 氨+ 二氧化碳+2腺苷三磷酸+水氨甲醯磷酸合成酶 2腺苷二磷酸+磷酸根+氨甲醯磷酸 磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶甘油醛-3-磷酸脫氨酶 甘油酸-l，3-雙磷酸+還原型輔酶 這種方法應用腺苷脫氨酶(Adenosine Deaminase ;EC 3. 5. 4. 4)酶(偶)聯胺甲
醯磷酸合成酶(carbamyl phosphate synthetase ;EC 6. 3. 4. 16)、甘油醛_3_磷酸脫氫酶
(Glyceraldehyde_3_phosphate dehydrogenase ;EC 1. 2. 1. 59)酶促反應連續監測法。腺
苷脫氨酶酶解腺苷反應產生氨，再通過(偶)聯合胺甲醯磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫
酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸
收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度
上升的速度，可以測算腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
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實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明腺苷脫氨酶診斷試劑較為理想
緩衝液100,1/L穩定劑500,1/L輔酶3mmol/L胺甲醯磷酸合成酶6000U/L甘油醛_3-磷酸脫氫酶8000U/L腺苷4mmol/L碳酸氫鈉5mmol/L腺苷三磷酸5mmol/L甘油醛_3-磷酸6mmol/L本發明的腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)可以是單劑，包括
緩衝液、穩定劑、輔酶、胺甲醯磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷、碳酸氫鈉(二二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸。試劑(盒)可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩衝液、穩定劑、輔酶、腺苷、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸。
試劑2 緩衝液、穩定劑、甘油醛_3-磷酸脫氫酶。
試劑3 緩衝液、穩定劑、胺甲醯磷酸合成酶。 輔酶、胺甲醯磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺 苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以 是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，其輔酶可以 是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為單試劑，包括 [OO43]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 100mmol/L
穩定劑 500mmol/L
輔酶 3,1/L
胺甲醯磷酸合成酶 6000U/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶 8000U/L
腺苷 4mmol/L
碳酸氫鈉 5mmol/L
腺苷三磷酸 5mmol/L
甘油醛-3-磷酸 6mmol/L 試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑；使用前，加入純淨 水，復溶後使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. 1， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反 應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值 4180。 加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
實施例二 本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為雙試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 lOOmmol/L
穩定劑 50mmol/L
輔酶 3,1/L
腺苷 4,1/L
碳酸氫鈉 5mmol/L
腺苷三磷酸 5mmol/L
甘油醛-3-磷酸 6mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 lOOmmol/L 穩定劑 500mmol/L 胺甲醯磷酸合成酶 6000U/L 甘油醛-3-磷酸脫氫酶 8000U/L 試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. l，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為
2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，
理論K值2170。
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加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢效 主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
實施例三
本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為三試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 lOOmmol/L 穩定劑 輔酶 腺苷
腺苷三磷酸 甘油醛-3-試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩定劑
甘油醛_3-磷酸脫氫酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷 穩定劑
胺甲醯磷酸合成酶
鹽酸緩衝液
IOO,I, 50mmol/L 3mmol/L 4mmol/L 5mmol/L 5mmol/L 6mmol/L
100,1, 500,1/L 8000U/L
鹽酸緩衝液
1
100,1/ 500,1/L 6000U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。 測定腺苷脫氨酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間 10分鐘，起始吸光度《0. l，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測腺苷脫氨酶樣品與 試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間 大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值2170。 加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
申請人:經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達到本發明 的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0006 ;吸光度時間反應曲線應呈直 線下降；試劑可測有效(R > 0. 99)線形範圍可達700U/L ;試劑測試的不準確度，其相對偏 差不超過±4% ;試劑測試的精密度(重複性)的變異係數(CV)《2% ;試劑的靈敏度可 達0. 00046±0. 00023 AA/min/U/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩定一年；——本發明 靈敏度高、精確度好，線形範圍寬廣，穩定期長，足以便於推廣應用。
權利要求
一種利用酶比色法及酶聯法技術的腺苷脫氨酶活性濃度測定方法，其方法如下腺苷+水 腺苷脫氨酶 肌苷+氨氨+二氧化碳+2腺苷三磷酸+水 氨甲醯磷酸合成酶 2腺苷二磷酸+磷酸根+氨甲醯磷酸磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶 甘油醛-3-磷酸脫氫酶 甘油酸-1，3-雙磷酸+還原型輔酶將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小測定結果。
2. —種腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，主要成分包括緩衝液穩定劑輔酶胺甲醯磷酸合成酶甘油醛_3-腺苷20-1—1——500,1/L-4000mmol/L-6mmol/L10001000-1-50mmol/L1-50mmol/L1-50mmol/L1--50mmol/L腺苷三磷酸甘油醛-3-試劑成分的濃度不一定只限於上述範圍；在此範圍內效果較好，在此範圍外，試劑仍會反應作用。其特徵在於試劑(盒)可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、輔酶、胺甲醯磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、輔酶、胺甲醯磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛_3-磷酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩衝液、穩定劑、輔酶、腺苷、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、胺甲醯磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成。輔酶、胺甲醯磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛_3-磷酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、輔酶、胺甲醯磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛_3-磷酸組成多劑試劑；試劑1，由緩衝液、穩定劑、輔酶、腺苷、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成；試劑3，由緩衝液、穩定劑、胺甲醯磷酸合成酶組成。輔酶、胺甲醯磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，其特徵在於還包括穩定劑l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，同時本發明還涉及測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法、試劑的組成及成分，屬於醫學檢驗測定技術領域。本發明的試劑(盒)主要成分包括緩衝液、輔酶、腺苷、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸、胺甲醯磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
文檔編號G01N21/17GK101750378SQ200810244270
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月10日 優先權日2008年12月10日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司