一種改進的茚三酮對固相多肽合成的檢測方法
2024-01-30 07:51:15 2
專利名稱：一種改進的茚三酮對固相多肽合成的檢測方法
技術領域：
本發明涉及對茚三酮檢測法的改進，既對固相合成中的多肽進行游離氨基的定量測定，與傳統方法相比較，該判定結果直接反應可縮合的程度及產率。
背景技術：
在多肽合成領域對肽樹脂合成過程是否完全的判定，直接影響到合成產率的多少，常規方法是對縮合完成後的肽樹脂直接進行檢測，從而粗略的判定合成完成度。但由於合成中存在著一些可能會造成合成反應不能繼續的情況，如樹脂和胺基酸的保護基去除不全，合成後為避免錯誤序列的出現而進行的加保護處理等，這些若使用常規方式都會被 判定為合成完全，而實際操作中正是由於這種誤判，造成了我們沒能及時作出有效的不就措施，致使最終產品中的完整肽鏈數量相對減少。文獻檢索披露原茚三酮檢測法是針對於多肽合成領域的縮合完整度的定性實驗，主要靠縮合後的樹脂與茚三酮試劑發生反應，通過顏色的變化來對縮合完成度進行判定。這種方法使用2種試劑,試劑A :取0. 66mg/ml氰化鉀水溶液2ml加入到98ml批唳溶液中，再加入4g/ml苯酹乙醇溶液IOml,混勻；試劑B :稱取500mg卻三酮溶於IOml無水乙醇中。進行合成完成度檢測時，取縮合反應完成後的肽樹脂3mg，使用無水乙醇清洗3次，真空乾燥後，加入試劑A 0. 15ml，試劑B 0. 05ml, 100°C加熱10分鐘，看顏色變化來判定縮合完成度，顏色如果為藍色或綠色就判定為縮合不完全，顯黃色判定為縮合完全。本發明構思是對合成完成的肽樹脂，先經去除保護基以後再進行檢測，來確定可用來進行下一步縮合的-NH2數量，從而可以得到一個對合成產率比較精確的預估，而且進行了試劑配方的改進，在不需要添加氰化鉀的情況下依舊可以保持顏色變化的穩定性，其應用價值在於通過對合成產率的預估，儘早發現合成中可能出現的影響合成產率的因素。
發明內容
本發明的目的在於改進的茚三酮對固相多肽合成檢測法，替代了傳統茚三酮檢測法判定縮合完成度，結果即準確又便於操作。本發明的目的是這樣實現的一種改進的茚三酮對固相多肽合成的檢測方法，採用新的茚三酮法，對固相多肽合成的產率得到準確的判定，步驟如下其I試劑配製還原型茚三酮的配製取茚三酮500mg，用12. 5ml沸蒸餾水溶解，得黃色溶液；在攪拌下加入維生素C溶液，其中該溶液用500mg維生素C用25ml溫蒸餾水溶解製得；出現沉澱繼續攪拌15min，移至冰箱中冷卻到4°C，取出過濾得沉澱物，將沉澱物用純淨水洗滌2_3次，經真空乾燥機，在溫度45°C，真空度93. 3 98. 6KPa下處置，置於五氧化二磷真空乾燥器中保存；Buffer A的配製:5ml卩比唳+1. 185g苯酌 +5ml乙醇混勻；Buffer B的配製487. 5mg卻三酮+12. 5mg還原型卻三酮+IOml乙醇；
25%哌啶溶液的配製25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混勻；其2樣品處理稱取適量的Rink_Amide_MBHA樹脂2g，並根據樹脂摩爾數的計算公式算出所需的樹脂摩爾數A，選用帶Fmoc保護基的胺基酸，每種胺基酸取2A摩爾，使用IA摩爾的Rink_Amide_MBHA樹脂與2A摩爾的帶Fmoc保護基的胺基酸，在含8%碳化二亞胺的氮甲基吡咯烷酮溶液作用下反應2小時，可以得到肽樹脂，再經25%哌啶溶液處理30分鐘，其中每摩爾肽樹脂加入25%的哌啶溶液26ml，得去除保護基後的肽樹脂；樹脂摩爾數的計算公式
權利要求
1.一種改進的茚三酮對固相多肽合成的檢測方法，其特徵在於採用新的茚三酮法，對固相多肽合成的產率得到準確的判定，步驟如下 其I試劑配製 還原型茚三酮的配製取茚三酮500mg，用12. 5ml沸蒸餾水溶解，得黃色溶液；在攪拌下加入維生素C溶液，其中該溶液用500mg維生素C用25ml溫蒸餾水溶解製得；出現沉澱繼續攪拌15min，移至冰箱中冷卻到4°C，取出過濾得沉澱物，將沉澱物用純淨水洗滌2_3次，經真空乾燥機，在溫度45°C，真空度93. 3 98. 6KPa下處置，置於五氧化二磷真空乾燥器中保存； Buffer A的配製:5ml卩比唳+1. 185g苯酹+5ml乙醇混勻； Buffer B的配製487. 5mg卻三酮+12. 5mg還原型卻三酮+IOml乙醇； 25%哌啶溶液的配製25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混勻； 其2樣品處理 稱取Rink_Amide_MBHA樹脂2g，並根據樹脂摩爾數的計算公式算出所需的樹脂摩爾數A,選用帶Fmoc保護基的胺基酸，每種胺基酸取2A摩爾，使用IA摩爾的Rink_Amide_MBHA樹脂與2A摩爾的帶Fmoc保護基的胺基酸，在含8%碳化二亞胺的氮甲基吡咯烷酮溶液作用下反應2小時，得到肽樹脂，再經25%哌啶溶液處理30分鐘，其中每摩爾肽樹脂加入25%的哌啶溶液26ml，得去除保護基後的肽樹脂； 樹脂摩爾數的計算公式
2.按照權利要求I所述的檢驗方法，其特徵在於選用的合成用樹脂為RinkAmide-MBHA Resin,購自天津南開合成有限公司；哌卩定、卻三酮購自Sigma;氮甲基批咯烷酮購自張家港合泰化工有限公司；吡啶購自天津市風船化學試劑科技有限公司；FmoC保護基的胺基酸，購自吉爾生化有限公司。
全文摘要
本發明提供的一種改進的茚三酮對固相多肽合成的檢測方法，1)取茚三酮500mg，用12.5ml沸蒸餾水溶解，得黃色溶液；在攪拌下加入維生素C溶液，出現沉澱繼續攪拌15min，移至冰箱中冷卻到4℃，用純淨水洗滌2-3次，經真空乾燥機處置，得還原型茚三酮；2)稱取Rink_Amide_MBHA樹脂2g,計算摩爾數，選用帶Fmoc保護基的胺基酸，在含8%碳化二亞胺的氮甲基吡咯烷酮溶液作用下反應2小時，可以得到肽樹脂，再經25%哌啶溶液處理30分鐘，得去除保護基後的肽樹脂；3)取去除保護基後的肽樹脂5-10mg，用無水甲醇溶液15ml對其清洗3次，經真空乾燥機處置；稱取肽樹脂2-5mg，加入300ulBufferA和75ulBufferB，混和均勻，用100℃水浴加熱15min，並置於15-20℃水中冷卻至室溫；加1.2ml的60%乙醇溶液，混合均勻後，測定吸光值並讀取。
文檔編號G01N21/78GK102680463SQ20121015412
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月17日 優先權日2012年5月17日
發明者唐磊, 朱長動, 李延濤, 肖璐恆, 謝仁軍, 趙毅, 鄭先強, 黃炯 申請人:新疆天康畜牧生物技術股份有限公司