一種檢測山羊dqa1基因外顯子4的單核苷酸多態性的引物及方法
2024-01-19 12:25:15 5
一種檢測山羊dqa1基因外顯子4的單核苷酸多態性的引物及方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測山羊免疫相關基因DQA1基因的單核苷酸多態性的引物及方法，引物由上遊引物和下遊引物組成，檢測時以山羊基因組DNA為模板，利用上、下遊引物進行PCR反應擴增目的片段，用變性劑處理PCR產物，對變性後的擴增片段進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，應用銀染法染膠，根據聚丙烯醯胺凝膠電泳結果即可判定山羊DQA1基因外顯子4的等位基因。通過本發明設計的核苷酸引物以及建立的檢測體系，可較為準確、快捷的擴增群體中不同等位基因型，可以準確的分析得到山羊DQA1基因外顯子4的不同單核苷酸突變位點。
【專利說明】—種檢測山羊DQA1基因外顯子4的單核苷酸多態性的弓I物及方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於分子遺傳學領域，涉及山羊分子標記輔助育種技術，具體涉及一種檢測山羊免疫相關基因DQAl基因的單核苷酸多態性的引物及方法。
【背景技術】
[0002]山羊DQAl基因位於MHC II類基因的DQ亞區，具有豐富的多態性。MHC (主要組織相容性複合體，major histocompatibility complex),是脊椎動物中一個與免疫相關的多基因家族，具有共顯性、連鎖不平衡等遺傳特性，其主要功能是編碼細胞表面的轉膜蛋白，通過傳遞抗原給T淋巴細胞參與調節免疫反應。MHC基因由1、II和III類基因組成。山羊的MHC基因稱之為GOLA (Goat lymphocyte antigen),即山羊白細胞抗原。MHC基因多態性賦予動物極大的應變能力，長期自然選擇使動物具有應變多變的環境條件及各種病原體的侵襲的能力，若動物具有高的MHC多態性，則能夠識別更多的抗原，從而抵抗更多種類的病原體。因此，MHC可以作為抗病育種的遺傳標記輔助選擇的重要位點，以培育出高產、抗病力強的家畜品種。
[0003]單核苷酸多態性(SNP)指基因組DNA序列中由於單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態性，主要由單個鹼基的轉換或者顛換所引起。位於編碼區的SNPs的錯義突變可能對基因的功能有重要的影響，不僅如此，這些SNPs位點多為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。單核苷酸多態性具有數量多，分布廣和穩定遺傳等特點，是一種進行分子遺傳育種的優良手段。現在人們發展了許多用於探尋分子遺傳標記的方法，最常見的有單鏈構象多態技術(SSCP)、PCR-RFLP和直接測序技術等，SSCP它可以發現靶DNA片段中未知位置的鹼基突變。該方法具有簡單、快速、靈敏，操作簡單等優點。但對於像DQAl基因外顯子2這種呈高度多態性的基因，基因型的判定成為難點。
[0004]貴州白山羊是貴州省的優良地方山羊品種，具有適應性強、耐粗飼、繁殖力高、育肥性能好、肉質好、板皮質優等特點，宜於在山地丘陵等地勢放牧飼養。但國內對於貴州白山羊免疫性狀的研究還鮮見報導，所以如何利用分子生物學的技術快速高效的篩選培育出具有較高抗病能力的貴州白山羊成為改良我國優良地方山羊品種的重中之重。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種檢測山羊免疫相關基因DQAl基因的單核苷酸多態性的引物及方法，為不同品種山羊DQAl基因外顯子4多態性的PCR-SSCP篩選及判型提供一種方便、快捷、準確的方法，以克服現有技術的不足。
[0006]本發明採用的技術方案:
本發明檢測山羊免疫相關基因DQAl基因的單核苷酸多態性的檢測引物，由上遊引物和下遊引物組成，所述上遊引物和下遊引物的DNA序列為:
上遊引物:5』 -AGTCTGTAGAACCAACCCCTCT-3』 下遊引物:5』 -TGGGAACATAGTACAGACGAGG-3』。
[0007]本發明檢測山羊免疫相關基因DQAl基因的單核苷酸多態性的方法，包括以下步驟:以山羊基因組DNA為模板，利用權利要求1所述的上、下遊引物進行PCR反應擴增目的片段，用變性劑處理PCR產物，對變性後的擴增片段進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，應用銀染法染膠，根據聚丙烯醯胺凝膠電泳結果即可判定山羊DQAl基因外顯子4的等位基因。
[0008]更進一步，PCR反應條件為:在15μ L總體系中，2XEs Taq MasterMix為7.5 μ L，上下遊引物各為0.75 μ L，DQA模板為2 μ L，餘量為ddH20，PCR反應程序為:95°C預變性3min ;95°C變性 30s,58.5°C退火 30s、72°C延伸 lmin,30 個循環；72°C終延伸 5min，4°C保存。
[0009]上述的變性劑由98%去離子甲醯胺，0.025%溴酚藍，0.025% 二甲苯青，100 μ L5mol/L EDTA 組成。
[0010]具體的電泳檢測步驟為:採用8%非變性聚丙烯醯胺凝膠在250V電壓下預電泳30min ;點樣後，常溫下，250V電泳1min, IlOv電泳16h。
[0011]上述非變性聚丙烯醯胺凝膠由26.6 mL29%的丙烯醯胺_1%N，N-雙丙烯醯胺、20mL 的 5ΧΤΒΕ、720 μ L10% 的過硫酸銨、52.8 mL 的 ddH20、44 μ L 的 TEMED 組成。
[0012]本發明有益效果:本發明引物能夠特異性的結合到山羊基因組DNA目的片段的模板鏈上，可以擴增得到含有等位基因突變的目的基因。通過設計的核苷酸引物以及建立的檢測體系，可較為準確、快捷的擴增群體中不同等位基因型，可以準確的分析得到山羊DQAl基因外顯子4的不同單核苷酸突變位點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1是貴州白山羊DQAl基因第4外顯子G+87T位點的PCR-SSCP檢測凝膠圖；
圖2是貴州白山羊DQAl基因第4外顯子G+149A位點的PCR-SSCP檢測凝膠圖；
圖3是貴州白山羊DQAl Exon 4- G+87T位點的測序圖；
圖4是貴州白山羊DQAl Exon 4- G+149A位點的測序圖；
其中，附圖中標記
1DQAl Exon 4- G+87T
2DQAl Exon 4- G+87G
3DQAl Exon 4- Τ+87Τ
4DQAl Exon 4- G+149G
5DQAl Exon 4- Α+149Α
6DQAl Exon 4- G+149A。
【具體實施方式】
[0014]實施例:
下面結合具體實施方案對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實施方案只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。下面以貴州白山羊免疫性狀相關基因DQAl基因外顯子4的多態性分析為例，對本發明的內容進行詳細說明。
[0015]一種貴州白山羊DQAl Exon4等位基因PCR-SSCP檢測方法，其主要特點在於，具體的檢測步驟如下:
1、樣品的採集:採集健康狀況好的成年貴州白山羊，抗凝管進行頸靜脈採血8mL，冰盒帶回實驗室後_20°C保存；
2、基因組DNA的提取:應用血液基因組提取試劑盒(上海生工生物)提取基因組DNA；
3、引物設計與PCR反應:總體系為15yL，其中2XEsTaq MasterMix為7.5 μ L，上下遊引物各0.75 μ L，DQA模板2 μ L，ddH20補充體積至15 μ L ；PCR反應程序:95°C預變性3min ;95°C變性 30s,58.5°C退火 30s、72°C延伸 lmin,30 個循環；72°C終延伸 5min，4°C保存。I %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。
[0016]引物序列為:
上遊引物:5 』 -AGTCTGTAGAACCAACCCCTCT-3，
下遊引物:5』 -TGGGAACATAGTACAGACGAGG-3』
4PCR產物的SSCP檢測:
取8 μ LPCR產物加入10 μ L的上樣變性緩衝液，包括98%去離子甲醯胺，0.025%溴酚藍，0.025% 二甲苯青，100 μ L 5mol/L EDTA (PH=8.0)。98°C變性 15min，立即冰浴 15min ；8%非變性聚丙烯醯胺凝膠，250V電壓下預電泳30min ;點樣後，常溫下，250V電泳lOmin，IlOv電泳16h，銀染法顯色並拍照。
[0017](I)電泳使用凝膠配製:8%非變性聚丙烯醯胺凝膠
29%丙烯醯胺-1%N，N-雙丙烯醯胺26.6 mL
5X TBE20 mL 10%過硫酸銨 720 μ L ddH20 52.8 mL TEMED 44 μ L
(2)銀染方法及步驟
固定液:無水乙醇25 mL
冰乙酸12.5 mL
ddH20200 mL
銀染液:硝酸銀0.3g
ddH20200 mL
顯色液:氫氧化鈉3g
甲醛2.2 mL
ddH20200 mL
電泳結束後取下凝膠。用蒸餾水清洗凝膠，倒入固定液，固定10-12min ;用蒸餾水清洗凝膠一次，倒入銀染液，避光銀染10-12min ;蒸餾水清一次，倒入顯色液(現用現配)，搖床顯色，待條帶清晰後用蒸餾水清洗，拍照保存。
[0018](3)測序分析
這一過程是為了檢測獲得的結果的可靠性，在實際操作中可憑藉帶型來區分基因型，無需此過程。
[0019]在非變性聚丙烯醯胺凝膠帶型顯示如附圖所示，將不同基因型的PCR產物送測序公司進行測序。測序結果顯示與預期的結果相同。
[0020]以上所述的僅為本發明的較佳實施方案，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換，改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種檢測山羊免疫相關基因DQAl基因的單核苷酸多態性的檢測引物，由上遊引物和下遊引物組成，其特徵在於:所述上遊引物和下遊引物的DNA序列為: 上遊引物:5』 -AGTCTGTAGAACCAACCCCTCT-3』 下遊引物:5』 -TGGGAACATAGTACAGACGAGG-3』。
2.一種檢測山羊免疫相關基因DQAl基因的單核苷酸多態性的方法，其特徵在於:包括以下步驟:以山羊基因組DNA為模板，利用權利要求1所述的上、下遊引物進行PCR反應擴增目的片段，用變性劑處理PCR產物，對變性後的擴增片段進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測，應用銀染法染膠，根據聚丙烯醯胺凝膠電泳結果即可判定山羊DQAl基因外顯子4的等位基因。
3.如權利要求2所述的一種檢測山羊免疫相關基因DQAl基因的單核苷酸多態性的方法，其特徵在於:PCR反應條件為:在15 μ L總體系中，2 XEs Taq MasterMix為7.5 μ L，上下遊引物各為0.75 μ L，DQA模板為2 μ L，餘量為ddH20，PCR反應程序為:95°C預變性3min ；95°C變性 30s,58.5°C退火 30s、72°C延伸 lmin,30 個循環；72°C終延伸 5min，4°C保存。
4.如權利要求2所述的一種檢測山羊免疫相關基因DQAl基因的單核苷酸多態性的方法，其特徵在於:所述的變性劑由98%去離子甲醯胺，0.025%溴酚藍，0.025% 二甲苯青，100 μ L 5mol/L EDTA 組成。
5.如權利要求2所述的一種檢測山羊免疫相關基因DQAl基因的單核苷酸多態性的方法，其特徵在於:電泳檢測步驟為:採用8%非變性聚丙烯醯胺凝膠在250V電壓下預電泳30min ;點樣後，常溫下，250V電泳1min, IlOv電泳16h。
6.如權利要求2或5所述的一種檢測山羊免疫相關基因DQAl基因的單核苷酸多態性的方法，其特徵在於:非變性聚丙烯醯胺凝膠由26.6 mL29%的丙烯醯胺_1%N，N-雙丙烯醯胺、20 mL 的 5ΧΤΒΕ、720 μ L10% 的過硫酸銨、52.8 mL 的 ddH20、44 μ L 的 TEMED 組成。
【文檔編號】C12N15/11GK104450880SQ201410526748
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年10月9日 優先權日:2014年10月9日
【發明者】羅衛星, 劉彬, 蔡慧芬, 康建兵, 孫巖巖, 錢成 申請人:貴州大學