一種動物細胞融合基礎培養基的使用方法與流程
2024-02-05 06:41:15
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種動物細胞融合基礎培養基的使用方法。
背景技術：
細胞培養技術始於20世紀初，是指從體內組織取出細胞，在無菌、適當溫度及酸鹼度和一定營養條件下，使其生長繁殖，並維持其結構和功能的一種培養技術。經過幾十年的發展，細胞培養技術現廣泛應用於生物、醫療技術、藥品等領域，形成了龐大的產業。同時，為了滿足市場的不同需求，通過細胞培養技術獲得的產品種類也更加多元化。
細胞融合是細胞培養技術的一種應用，其在自發或人工誘導下，將兩個不同基因型的細胞或原生質體融合形成一個雜種細胞。目前，細胞融合技術多用於獲取雜交瘤，並用於單克隆抗體的科研和生產。
培養基是維持體外細胞生存和生長的溶液，分為天然培養基和合成培養基。其中，合成培養基是根據細胞生存所需物質的種類和數量，用人工方法合成的。目前，關於細胞融合培養基進行了很多改造和研究，但通常都忽略了細胞培養基組分的改造所帶來的影響，使得細胞融合效率通常偏低。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種動物細胞融合基礎培養基的使用方法，以解決現有技術中細胞融合培養基的細胞融合效率低的問題，從而通過提高細胞融合效率，達到高效獲取雜交瘤的目的，使得獲取單克隆抗體的機率顯著增加。
本發明通過下述技術方案實現：
一種動物細胞融合基礎培養基的使用方法，包括以下步驟：
(a)準備小鼠骨髓瘤細胞、免疫小白鼠脾細胞、基礎培養基、滅菌後4℃保存的聚乙二醇4000、飼養細胞四板，每個板上有96個孔，每孔的體積為100μl；
(b)用基礎培養基吹洗小鼠骨髓瘤細胞後，將小鼠骨髓瘤細胞加入至50ml離心管中，並同時加入復甦的免疫小白鼠脾細胞，混勻後離心；
(c)離心完成後除去離心管中的上清液，將細胞沉澱輕輕混勻後，沿著管壁在60秒內加入緩慢加入800μl的peg4000，加完後靜置90秒；
(d)加入50ml培養基後離心；
(e)離心完成後除去上清液，加入基礎培養基混勻後，用加樣槍將其轉入板中；
(f)放入5％co2的孵箱培養七天後，全換液；上述步驟中，基礎培養基的組分包括：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬醯氨、胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、羥脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸二鈉、纈氨酸、氯化鈣、硫酸鎂、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、生物素、氯化膽鹼、肌醇、尼克醯胺、d-泛酸、吡哆醛、硫胺素、核黃素、抗壞血酸、維生素b-12、對氨基苯甲酸、葉酸、d-葡萄糖、酚紅、丙酮酸鈉、胸苷、還原型穀胱甘肽、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸。現有技術中，如hyclone1640培養基，忽略了細胞培養基組分的改造所帶來的影響，導致其細胞融合效率較低，為了解決上述問題，本發明通過系統組織工程技術(ztso)進行實驗設計和分析，從系統的角度而非理化層面去分析各組分和細胞生長之間的協同性，相較於傳統的doe設計和分析，僅通過少量的實驗即可確定和細胞培養相關的所有配方組成，並能準確確定每個組分準確的量。經過ztso實驗設計和分析，開發出了上述用於動物細胞融合的基礎培養基。
為了對比本發明所提供的培養基與現有的hyclone1640培養基的融合效果，進行免疫小白鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合實驗。在實驗的不同階段，即融合前、進樣補充、融合中使用本發明的培養基和hyclone1640培養基，通過最後孔板上每12個孔中細胞融合的孔的個數，判斷細胞融合。實驗發現，相比於hyclone1640培養基，本發明提供的培養基能夠大幅提升細胞融合效率，若在實驗的三個階段全部採用本發明提供的培養基，細胞融合效率的提升最高，獲得陽性雜交瘤的可能性大大增加，具有廣泛的應用價值。
進一步地，所述各組分的含量為：丙氨酸10-50mg/l，精氨酸100-300mg/l，天冬氨酸10-50mg/l，天冬醯氨10-50mg/l，胱氨酸10-50mg/l，穀氨醯胺100-500mg/l，穀氨酸10-50mg/l，甘氨酸10-50mg/l，組氨酸10-50mg/l，羥脯氨酸10-50mg/l，異亮氨酸10-50mg/l，亮氨酸10-50mg/l，賴氨酸10-50mg/l，蛋氨酸10-50mg/l，苯丙氨酸10-50mg/l，脯氨酸10-50mg/l，絲氨酸10-50mg/l，蘇氨酸10-50mg/l，色氨酸1-10mg/l，酪氨酸二鈉10-50mg/l，纈氨酸10-50mg/l，氯化鈣10-50mg/l，硫酸鎂10-50mg/l，氯化鉀200-400mg/l，磷酸二氫鉀10-50mg/l，磷酸氫二鈉500-1000mg/l，生物素0.1-5mg/l，氯化膽鹼0.1-5mg/l，肌醇10-50mg/l，尼克醯胺0.1-5mg/l，d-泛酸0.1-5mg/l，吡哆醛0.1-5mg/l，硫胺素0.1-5mg/l，核黃素0.1-5mg/l，抗壞血酸10-50mg/l，維生素b120.001-0.01mg/l，對氨基苯甲酸0.1-5mg/l，葉酸0.1-5mg/l，d-葡萄糖1000-3000mg/l，酚紅1-5mg/l，丙酮酸鈉10-50mg/l，胸苷10-50mg/l，還原型穀胱甘肽0.1-5mg/l，碳酸氫鈉0.1-3g/l，氫氧化鈉0.1-3g/l，氯化鈉5-8g/l，4-羥乙基哌嗪乙磺酸3-8g/l。
進一步地，所述步驟(a)中的飼養細胞來自於無菌收集的bablc小鼠腹腔，與基礎培養基混合後，均勻加入板的孔中，每孔100μl。
進一步地，小鼠骨髓瘤細胞與免疫小白鼠脾細胞數量比為1：20。
進一步地，所述步驟(b)中的離心時間為4～10分鐘。
進一步地，所述碳酸氫鈉0.8-3g/l，氫氧化鈉1.2-3g/l，氯化鈉6.5-8g/l，氯化鈣30-50mg/l，硫酸鎂30-50mg/l，氯化鉀300-400mg/l，d-泛酸3-5mg/l，吡哆醛2.5-5mg/l，硫胺素1.8-5mg/l。
本發明與現有技術相比，具有如下的優點和有益效果：
1、本發明能夠大幅提升細胞融合效率，若在細胞融合的各個階段均採用本發明提供的培養基，細胞融合效率的提升最高，獲得陽性雜交瘤的可能性大大增加；
2、本發明組分搭配良好，相比於市面上銷售的培養基，成本更低、融合效率更高。
附圖說明
此處所說明的附圖用來提供對本發明實施例的進一步理解，構成本申請的一部分，並不構成對本發明實施例的限定。在附圖中：
圖1為細胞融合全過程採用不同本發明培養基和hyclonerpmi1640培養基進行細胞融合獲得陽性雜交瘤檢測孔。
具體實施方式
為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，下面結合實施例和附圖，對本發明作進一步的詳細說明，本發明的示意性實施方式及其說明僅用於解釋本發明，並不作為對本發明的限定。
實施例1：
配製的基礎培養基的各組分含量為：丙氨酸50mg/l，精氨酸100mg/l，天冬氨酸50mg/l，天冬醯氨50mg/l，胱氨酸10mg/l，穀氨醯胺100mg/l，穀氨酸40mg/l，甘氨酸50mg/l，組氨酸50mg/l，羥脯氨酸10mg/l，異亮氨酸10mg/l，亮氨酸50mg/l，賴氨酸10mg/l，蛋氨酸10mg/l，苯丙氨酸50mg/l，脯氨酸50mg/l，絲氨酸50mg/l，蘇氨酸50mg/l，色氨酸10mg/l，酪氨酸二鈉10mg/l，纈氨酸10-50mg/l，氯化鈣30mg/l，硫酸鎂30mg/l，氯化鉀300mg/l，磷酸二氫鉀10mg/l，磷酸氫二鈉1000mg/l，生物素0.1mg/l，氯化膽鹼0.1mg/l，肌醇10mg/l，尼克醯胺0.5mg/l，d-泛酸3mg/l，吡哆醛2.5mg/l，硫胺素1.8mg/l，核黃素0.1mg/l，抗壞血酸25mg/l，維生素b120.01mg/l，對氨基苯甲酸0.1mg/l，葉酸0.1mg/l，d-葡萄糖1000mg/l，酚紅5mg/l，丙酮酸鈉10mg/l，胸苷50mg/l，還原型穀胱甘肽5mg/l，碳酸氫鈉0.8g/l，氫氧化鈉1.2g/l，氯化鈉6.5g/l，4-羥乙基哌嗪乙磺酸3-8g/l。
免疫小白鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合實驗：
(a)準備小鼠骨髓瘤細胞、免疫小白鼠脾細胞、基礎培養基、滅菌後4℃保存的聚乙二醇4000、飼養細胞四板，每個板上有96個孔，每孔的體積為100μl；
(b)用基礎培養基吹洗小鼠骨髓瘤細胞後，將小鼠骨髓瘤細胞加入至50ml離心管中，並同時加入復甦的免疫小白鼠脾細胞，混勻後離心；
(c)離心完成後除去離心管中的上清液，將細胞沉澱輕輕混勻後，沿著管壁在60秒內加入緩慢加入800μl的peg4000，加完後靜置90秒；
(d)加入50ml培養基後離心；
(e)離心完成後除去上清液，加入基礎培養基混勻後，用加樣槍將其轉入板中；
(f)放入5％co2的孵箱培養七天後，全換液。
通過在不同階段添加按上述配方製成的基礎培養基，得到的細胞融合率如表1所示：
表1
如表1所示，在各個階段添加本發明的基礎培養基均能提高細胞融合率，其中，在三個階段均使用本發明的基礎培養基能達到83.3％的融合率。相比於現有技術，大幅地提高了細胞融合效率，達到高效獲取雜交瘤的目的，使得獲取單克隆抗體的機率顯著增加，具有廣泛地應用價值。
如圖1所示，圖中第一、二行為hyclonerpmi1640獲得的雜交瘤檢測孔；第三、四行為本發明的基礎培養基獲得的雜交瘤檢測孔情況。由於無法提供彩色圖片，僅能從顏色黑白作出判斷，圖1中黑色的孔為陽性雜交瘤檢測孔，因此，可以看出，採用本發明基礎培養基所獲得的細胞融合率較現有的hyclonerpmi1640培養基大幅提高。
實施例2
實施例2的操作步驟與實施例1相同，其不同點在於，所使用的基礎培養基的各組分含量為：丙氨酸50mg/l，精氨酸100mg/l，天冬氨酸50mg/l，天冬醯氨10mg/l，胱氨酸10mg/l，穀氨醯胺500mg/l，穀氨酸10mg/l，甘氨酸50mg/l，組氨酸10mg/l，羥脯氨酸50mg/l，異亮氨酸10mg/l，亮氨酸10mg/l，賴氨酸10mg/l，蛋氨酸10mg/l，苯丙氨酸10mg/l，脯氨酸10mg/l，絲氨酸10mg/l，蘇氨酸10mg/l，色氨酸10mg/l，酪氨酸二鈉50mg/l，纈氨酸50mg/l，氯化鈣10mg/l，硫酸鎂10mg/l，氯化鉀400mg/l，磷酸二氫鉀50mg/l，磷酸氫二鈉500mg/l，生物素0.1mg/l，氯化膽鹼0.1mg/l，肌醇10mg/l，尼克醯胺0.1mg/l，d-泛酸0.1mg/l，吡哆醛0.1mg/l，硫胺素0.1mg/l，核黃素0.1mg/l，抗壞血酸10mg/l，維生素b120.01mg/l，對氨基苯甲酸0.1mg/l，葉酸0.1mg/l，d-葡萄糖3000mg/l，酚紅5mg/l，丙酮酸鈉10mg/l，胸苷10mg/l，還原型穀胱甘肽5mg/l，碳酸氫鈉3g/l，氫氧化鈉3g/l，氯化鈉5g/l，4-羥乙基哌嗪乙磺酸3g/l。
實施例3
實施例3的操作步驟與實施例1相同，其不同點在於，所使用的基礎培養基的各組分含量為：丙氨酸10mg/l，精氨酸100mg/l，天冬氨酸10mg/l，天冬醯氨10mg/l，胱氨酸10mg/l，穀氨醯胺100mg/l，穀氨酸10mg/l，甘氨酸10mg/l，組氨酸10mg/l，羥脯氨酸10mg/l，異亮氨酸10mg/l，亮氨酸10mg/l，賴氨酸10mg/l，蛋氨酸10mg/l，苯丙氨酸10mg/l，脯氨酸10mg/l，絲氨酸10mg/l，蘇氨酸10mg/l，色氨酸1mg/l，酪氨酸二鈉10mg/l，纈氨酸10mg/l，氯化鈣10mg/l，硫酸鎂10mg/l，氯化鉀200mg/l，磷酸二氫鉀10mg/l，磷酸氫二鈉500mg/l，生物素0.1mg/l，氯化膽鹼0.1mg/l，肌醇10mg/l，尼克醯胺0.1mg/l，d-泛酸0.1mg/l，吡哆醛0.1mg/l，硫胺素0.1mg/l，核黃素0.1mg/l，抗壞血酸10mg/l，維生素b120.001mg/l，對氨基苯甲酸0.1mg/l，葉酸0.1mg/l，d-葡萄糖1000mg/l，酚紅1mg/l，丙酮酸鈉10mg/l，胸苷10mg/l，還原型穀胱甘肽0.1mg/l，碳酸氫鈉0.1g/l，氫氧化鈉0.1g/l，氯化鈉5g/l，4-羥乙基哌嗪乙磺酸3g/l。
以上所述的具體實施方式，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明，所應理解的是，以上所述僅為本發明的具體實施方式而已，並不用於限定本發明的保護範圍，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。