海參膠原蛋白活性肽的製備方法和應用的製作方法

2023-06-03 19:42:06 2

專利名稱：：海參膠原蛋白活性肽的製備方法和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種海參加工技術，尤其是涉及一種海參膠原蛋白活性肽的製備方法和在製備美容功能食品、美容飲料或化妝品中的應用。
背景技術：
：水產動物膠原蛋白的丌發和應用已引起了廣泛重視，從魚皮、魚鱗中製備膠原蛋白及其製品已申請了多項發明專利(CN1749296A;CN1629192A;CN1749275A;CN1814782A;CN1629191A;CN1560270A;CN1582771A;CN101061827A)。另外，中國發明專利CN1740199A和CN101003827A還公開了利用海星殼和魷魚皮製備膠原蛋白肽的方法。通過蛋白酶定向水解得到的膠原蛋白活性肽，具有特殊的生理功效，主要體現在免疫調節、抗氧化、降血壓、降血脂、抑制腫瘤、促進皮膚代謝和膠原蛋白合成等方面。海參是重要的海洋食物和藥物資源。全世界有1000多種海參，其中40多種可供食用。近年來，我國海參養殖業發展極快，海參年產量已超過6萬噸。因此，亟待進一步開發海參的高值化加工技術。海參體壁含有結構獨特的活性物質如海參膠原蛋白、海參多糖、海參皂苷等。藥理實驗證明，海參具有抗腫瘤、提高免疫功能、降血脂、抗凝血、抗動脈粥樣硬化等多種生理活性。目前，國內外對海參活性成分的研究和開發主要集中在海參多糖和海參皂苷等方面。海參膠原蛋白含量佔海參體壁粗蛋白的60%以上，有關海參膠原蛋白類型和理化性質的研究已有報導(CompBiochemPhysiol,1995,112A:463—478;FoodChemistryandToxicology,2002,67(4):1319-132:水產學報，2006,4:549—553),中國發明專利CN101215315A也公開了一種在低溫下(0-25'C)利用胃蛋白酶促溶提取海參膠原蛋白的方法。與膠原蛋，相比，膠原蛋白肽具有更易吸收和高生理活性等特點。有關海參多肽的研究已有報導，目前已公開的發明專利有CN1858222A和CN101191139A。這些研究中所述的海參多肽是一種至少包括海參皂苷、蛋白多肽和膠原多肽等活性物質的混合物。有關海參膠原蛋白活性肽尚未見報導。
發明內容本發明的目的在於提供一種海參膠原蛋白活性肽的製備方法及其在製備美容功能食品、美容飲料或化妝品中的應用，以填補已有海參加工技術的上述不足。一種海參膠原蛋白活性肽的製備方法，其特徵在於將海參去除內臟和內壁肌肉層，洗淨，粉碎；在室溫下，加入體積百分數為40-80%酒精水溶液浸提3-7d;離心，所得沉澱物用清水反覆洗滌；加入0.05-0.3MNaOH水溶液浸泡10-48h;離心，所得沉澱物用清水反覆洗滌至pH中性；向沉澱物中加入去離子水，在攪拌下，加入複合風味蛋白酶酶解2-6h,酶解溫度為45-55。C，pH為7-8;然後，在90-IOO'C下滅酶4-10min;酶解液經過離心後，上清液採用超濾膜分離；收集分子量《6KDa的組分進行脫色，脫鹽，真空濃縮，冷凍乾燥，得到海參膠原蛋白活性肽粉末。上述的海參膠原蛋白活性肽在製備美容功能食品、美容飲料或化妝品中的應用。本發明的海參膠原蛋白活性肽製備方法的優點在於利用乙醇和強鹼溶液處理海參，有效地去除了海參脂質和雜蛋白，製得的海參膠原蛋白活性肽純度高；採用兼具內切酶和外切酶作用特點的複合風味蛋白酶酶解海參體壁，操作簡單，製得的海參膠原蛋白活性肽中3-15肽為90-98%(重量百分數)，具有顯著的抗氧化性，且可溶性好，吸收性高，無異味和苦味。另外，本發明還提供了一種可供綜合提取海參生物活性物質的途徑海參的酒精浸提液可用於製備海參皂苷；利用超濾膜得到的分子量大於6kDa的酶解液可用於製備海參多糖。同時，提取完生物活性物質後的海參也可用於製備海參膠原蛋白活性肽，可使海參得到充分的高值化加工利用。附圖1為本發明製得的海參膠原蛋白活性肽分子量分布的HPLC圖譜。附圖2為光老化模型對照小鼠皮膚的組織學結構圖。附圖3為使用本發明製得的海參膠原蛋白活性肽的光老化模型小鼠皮膚的組織學結構圖。具體實施例方式將lKg新鮮海參除去內臟和內壁肌肉層，並洗淨泥沙，粉碎。在室溫條件下，加入5L80M(體積百分數，下同)的酒精水溶液浸泡5d，浸泡期間每天換液l次，以除去包括海參皂苷在內的脂質成分。5000轉/min離心30min，除去上清液，將所得沉澱物用清水反覆洗滌。加入6倍體積的0.1MNaOH水溶液攪拌24h，以除去雜蛋白。5000轉/min離心30min，除去上清液,將所得沉澱物用清水反覆洗滌至pU中性。向沉澱物中加入20倍體積的去離子水，並預熱至5(TC，在恆溫攪拌下，加入10g複合風味蛋白酶酶解4h。然後，加熱反應體系，在95°C下滅酶5min。將酶解液冷卻至室溫，8000轉/min離心30min，收集上清液。將上清液通過截留分子量為6KDa的超濾膜超濾，收集分子量《6KDa的組分進行脫色、脫鹽、真空濃縮、冷凍乾燥，得到16.6g海參膠原蛋白活性肽粉末。經分析，本海參膠原蛋白活性肽的分子量為200-1700Da(見附圖l)，胺基酸組成中疏水性胺基酸總量佔總胺基酸量的56%。本實施例中，所述的新鮮海參可改為幹海參、提取完生物活性物質後的海參，均能得到類似的效果。通過本發明製備的海參膠原蛋白活性肽得率為1-25%，分子量為200-1800Da，胺基酸組成中疏水性胺基酸含量為55-70%(重量百分數)。本發明中所述的80%的酒精水溶液浸泡5d可改用40-80%的酒精水溶液浸泡3-7d;所述加入6倍體積的0.1MNa0H水溶液攪拌24h,可改用加入5-40倍0.05-0.3MNa0H水溶液或0.05-0.3MK0H水溶液攪拌10-48h;所述向沉澱物中加入20倍體積的去離子水，可改為加入6-30倍體積的去離子水；所述的複合風味蛋白酶用量為海參重量的1-5%，酶解時間為2-6h，酶解溫度均為45—50。C，pH為7.0_8.0，在90-10(TC下滅酶4-10rain;所述的離心速度為5000_10000轉/min,離心時間為20-60min。本發明製得的海參膠原蛋白活性肽可作為美容活性成份，與其他輔料製成美容功能食品、美容飲料或化妝品。一.海參膠原蛋白活性肽的美容和護膚作用皮膚衰老是由內源性和外源性等多種因素引起的複雜過程。其中紫外線的作用是最主要和最突出的，稱為光老化。紫外線輻照可在皮膚內產生多種自由基，自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發脂質過氧化作用，並形成脂質過氧化物。脂質過氧化物使膠原蛋白多肽鏈間共價交聯程度增加，透明質酸解聚，導致膠原蛋白溶解度降低，膠原蛋白含量減少，皮膚出現鬆弛、皺縮、粗糙、無光澤衰老現象。因此，減少自由基的生成能延緩皮膚衰老，起到美容護膚作用。黑色素在防禦紫外線對皮膚損傷的過程中起了重要作用。但細胞中黑色素生成過度或大量累積，將引起皮膚出現雀斑、老年斑和其他色素沉著。黑色素的生成過程與自由基途徑相偶聯。因此，清除自由基可下調紫外線對黑色素生成的誘導作用，起到美白作用。1.海參膠原蛋白活性肽對光老化模型小鼠皮膚的保護作用將昆明小鼠頸背部脫毛處理後，隨機分為4組，第1一2組分別為正常和模型對照組，給予生理鹽水；第3-4組為本發明製得的海參膠原蛋白活性肽組，灌胃作為美容功能食品使用的海參膠原蛋白活性肽、澱粉和水的混合液(重量比為l:1:10)，其中含有的海參膠原蛋白活性肽的劑量分別為25和100mg/kg體重。1天灌胃1次，連續8周。同時，第2-4組小鼠照射紫外光(UVA+UVB)，每周隔R照射3次，共8周。UVA總劑量為ll.7J/cm2，UVB總劑量為156mJ/cm2。於末次灌胃或塗抹後24h，脫頸椎處死小鼠，取背部皮膚，製備皮膚勻漿。分別測定皮膚過氧化物歧化酶(S0D)、穀胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)和羥脯氨酸含量。另取第2、4組小鼠背部皮膚0.5cm2,經過4%中性甲醛固定、冰凍切片、蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察皮膚的組織結構。結果表明，本海參膠原蛋白活性肽能顯著降低光老化小鼠皮膚MDA含量，提高抗氧化酶SOD、GSH-PX、CAT活性，提高羥脯氨酸含量(見表l)。皮膚組織學觀察結果表明，模型對照組小鼠皮膚的表皮層增厚，並伴有角質化過度，真皮層因纖維發生變性或破壞，纖維排列紊亂，分布不均(見附圖2)。使用本海參膠原蛋白活性肽能顯著改善紫外線導致的小鼠皮膚結構的紊亂現象(見附圖3)。以上結果說明本海參膠原蛋白活性肽具有顯著的延緩皮膚衰老、促進真皮內膠原蛋白合成的作用，起到了美容和護膚效果。_表l海參膠原蛋白活性肽對光老化模型小鼠的保護作用_組另Uii^i55gsh-px羥脯氨酸mg/kgnmol/mg.prot.U/mg.prot,U/mg.protU/mg.prot.ug/mg.prot正常對照:=6.07±0.65252.02±37.2823.44±1.0211.38±0.7413.46±1.42模型對照—1U9士0.79加145.03士24.05胖9.10士1.00'"7.92±0.66*#10.38±0.75*海參膠原259.25±1.13166.10±36.40*11.06±1,3010.09±0.83**11.71±1.26蛋白活性1005.92±1.79**180.81±36.19**12.93土1.09"13.09±0.38**14.03±2.00*"屍<0.05，，<0.05，，<0.01與模型對照組比較本實施例中，所述的灌胃作為美容功能食品使用的海參膠原蛋白活性肽、澱粉和水的混合液可改為作為美容飲料使用的海參膠原蛋白活性肽和水的混合液(重量比為l:10)，或者塗抹作為化妝品使用的海參膠原蛋白活性肽和水的混合液(重量比分別為l:10和1:5)，均能得到類似的效果。將上述的美容功能食品、美容飲料或化妝品應用到人體，也能得到類似效果。2.海參膠原蛋白活性肽抑制細胞黑色素合成的作用小鼠B16黑色素瘤細胞己成為定量評價黑色素合成的模型系統。取對數生長期的B16細胞，經0.25%(重量百分數)胰酶消化，以RPMI-1640完全培養基配成密度為5X105/mL細胞懸液，接種於細胞培養板，置於37°C、5%(體積百分數)c02的培養箱內培養。貼壁24h後，棄培養液，分別加入含不同濃度海參膠原蛋白活性肽的完全培養液，對照組加入等體積的完全培養基，繼續培養48h。分別測定細胞內黑色素含量、酪氨酸酶活性和還原型穀胱甘肽含量。結果表明，不同濃度海參膠原蛋白活性肽均能顯著降低B16細胞黑色素含量，抑制酪氨酸酶活性，提高還原型穀胱甘肽含量，且劑量-效應關係明顯(見表2)。酪氨酸酶是調控黑色素合成的關鍵限速酶，還原型穀胱甘肽是生物體內重要的抗氧化劑，在抑制黑色素合成過程中起了重要作用，它主要通過巰基和酪氨酸酶的作用位點結合而抑制酪氨酸酶的活性。以上分析說明，海參膠原蛋白活性肽具有顯著抑制細胞黑色素合成的作用。將本海參膠原蛋白活性肽製備成作為美容功能食品使用的海參膠原蛋白活性肽和澱粉混合物(重量比為l:1)、作為美容飲料使用的海參膠原蛋白活性肽和水的混合液(重量比為l:IO)或作為化妝品使用的海參膠原蛋白活性肽和水的混合液(重量比分別為1:5)應用於人體，均能得到類似效果。說明本海參膠原蛋白活性肽具有美白作用。表2海參膠原蛋白活性肽對B16細胞黑色素合成的影響tableseeoriginaldocumentpage7*屍<0.05，**屍<0.01與對照組比較二.海參膠原蛋白活性肽的安全性實驗ICR小鼠一次性灌服不同劑量的海參膠原蛋白活性肽水溶液(O.464、1.00、2.15、4.64g/kg體重)，14d後，各劑量組動物均無死亡，且無任何行為異常，體重無明顯增長，血常規、肝、腎功各項檢査無明顯差別，動物臟器的病理組織學檢査無異常，表明本海參膠原蛋白活性肽無毒副作用和無累積毒性。三.海參膠原蛋白活性肽的穩定性本發明製得的海參膠原蛋白活性肽在常溫下保存6-8個月或在-20'C保存12-24個月，其生物活性無明顯降低。權利要求1.一種海參膠原蛋白活性肽的製備方法，其特徵在於將海參去除內臟和內壁肌肉層，洗淨，粉碎；在室溫下，加入體積百分數為40-80％酒精水溶液浸提3-7d；離心，所得沉澱物用清水反覆洗滌；加入0.05-0.3MNaOH水溶液浸泡10-48h；離心，所得沉澱物用清水反覆洗滌至pH中性；向沉澱物中加入去離子水，在攪拌下，加入複合風味蛋白酶酶解2-6h，酶解溫度為45-55℃，pH為7-8；然後，在90-100℃下滅酶4-10min；酶解液經過離心後，上清液採用超濾膜分離；收集分子量≤6KDa的組分進行脫色，脫鹽，真空濃縮，冷凍乾燥，得到海參膠原蛋白活性肽粉末。2.按權利要求1所述海參膠原蛋白活性肽的製備方法，其特徵在於所述的海參為鮮海參或幹海參。3.按權利要求1所述海參膠原蛋白活性肽的製備方法，其特徵在於所述海參膠原蛋白活性肽的分子量範圍為200-1800Da。4.權利要求1所述的海參膠原蛋白活性肽在製備美容功能食品、美容飲料或化妝品中的應用。全文摘要一種海參膠原蛋白活性肽的製備方法，其特徵在於將海參去除內臟和內壁肌肉層，洗淨，粉碎；加入40-80％酒精水溶液浸提3-7d；離心，所得沉澱物用清水反覆洗滌；加入0.05-0.3MNaOH水溶液浸泡10-48h；離心，所得沉澱物用清水反覆洗滌至pH中性；向沉澱物中加入去離子水，在攪拌下，加入複合風味蛋白酶酶解2-6h，酶解溫度為45-55℃，pH為7-8，然後滅酶；酶解液經過離心後，上清液採用超濾膜分離；收集分子量≤6KDa的組分進行脫色，脫鹽，真空濃縮，冷凍乾燥。本發明的工藝步驟簡單，所述海參膠原蛋白活性肽具有強抗氧化活性，可用於製備美容功能食品、美容飲料或化妝品。文檔編號A23L2/66GK101343653SQ200810139279公開日2009年1月14日申請日期2008年8月22日優先權日2008年8月22日發明者李兆傑,奕王,王玉明,王靜鳳,勇薛,薛長湖申請人:中國海洋大學