用於控制蟲害的組合物和方法與流程

2024-02-26 16:20:15 3

本申請要求2014年4月1日提交的美國臨時專利申請號61/973,484的權益，其全文通過引用併入本文。文件「40-21_70001_0000_US_ST25.txt」中所含的序列表(49千字節，於2014年4月1日創建，2014年4月1日與美國臨時專利申請號61/973,484一起提交)，和文件「40-21_70001_0000_US_ST25.txt」中所含的替換序列表(49千字節，於2014年4月4日創建，2014年4月4日作為替換序列表提交以更正發明人的序列表)的全文併入本文。文件「40-21_70001_0000_WO_ST25.txt」中所含的序列表(70千字節，於2015年3月13日創建)在此提交並通過引用將其全文併入本文。
技術領域：
：本文公開的是用於控制尤其是植物中無脊椎害蟲侵擾的方法，和在這種方法中有用的組合物和多核苷酸。更具體地，本發明涉及用於尤其通過RNA幹擾改變無脊椎害蟲中基因表達的多核苷酸及其使用方法。目標害蟲物種包括侵擾作物植物的昆蟲，例如，小菜蛾(Plutellaxylostella，菜蛾)、草地夜蛾(Spodopterafrugiperda，草地粘蟲)、豆莢草盲蝽(Lygushesperus，西部無澤盲蝽)和Euschistusheros(新熱帶區褐臭蝽)。
背景技術：
：：經濟作物經常是無脊椎害蟲例如昆蟲攻擊的目標。用於控制植物中昆蟲侵擾的組合物通常是化學殺蟲劑的形式。然而，使用化學殺蟲劑存在若干缺點。例如，化學殺蟲劑通常是非選擇性的，且應用旨在控制作物植物中蟲害的化學殺蟲劑可以在非目標昆蟲和其他無脊椎動物上發揮它們的效果。化學殺蟲劑通常持續存在於環境中且降解緩慢，因此可能在食物鏈中累積。此外，使用持續的化學殺蟲劑可能導致目標昆蟲物種產生抗性。因此對於對環境更友好的用於控制或消除植物上或植物中的昆蟲侵擾的方法存在長期需求，即物種選擇性、環境惰性、非持續性和生物可降解且良好適合抗蟲性管理方案的方法。包括蘇芸金桿菌(「Bt」)細菌的殺蟲組合物是可商購的且用作環境安全和可接受的殺蟲劑已超過三十年。這些組合物的功效歸因於僅由Bt菌產生的殺蟲蛋白。殺蟲Bt蛋白不會持續存在於環境中，對於受影響的目標物種具有高度選擇性，僅通過目標昆蟲的攝取發揮它們的效果，且已經證明對植物和其他非目標生物(包括人和其他脊椎動物)無害。包含一種或多種編碼殺蟲Bt蛋白的重組基因的轉基因植物也是本領域可獲得的，且對害蟲侵擾有抗性。使用表達Bt蛋白的轉基因植物的一個積極的環境結果是減少了在這種轉基因作物田地中施用以控制害蟲侵擾的化學殺蟲劑的量，從而降低由非降解或過量化學殺蟲劑導致的土壤和水的汙染。此外，由於減少使用非選擇性的化學殺蟲劑，其中種植表達Bt蛋白的轉基因作物植物的田地中的益蟲的數量顯著增加。RNA幹擾(RNAi，RNA-介導的基因抑制)是另一種用於害蟲控制的方法。在無脊椎動物中，基於RNAi的基因抑制最初在線蟲中被證實(Fire等,(1998)Nature,391:806-811；Timmons&Fire(1998)Nature,395:854)。隨後，在大量物種中報導了利用重組核酸技術的基於RNAi的無脊椎動物基因的抑制，包括來自各種昆蟲和線蟲分類的農學或經濟上重要的害蟲，例如根瘤線蟲(根結線蟲屬)，參見Huang等(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:14302-14306,doi:10.1073/pnas.0604698103)；棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)，參見Mao等(2007)NatureBiotechnol.,25:1307-1313,doi:10.1038/nbt1352；西部玉米根蟲(DiabroticavirgiferaLeConte)，參見Baum等(2007)NatureBiotechnol.,25:1322-1326,doi:10.1038/nbt1359；甜菜孢囊線蟲(粟根線蟲，Heteroderaschachtii)，參見Sindhu等(2008)J.Exp.Botany,60:315-324,doi:10.1093/jxb/ern289；蚊子(埃及伊蚊，Aedesaegypti)，參見Pridgeon等(2008)J.Med.Entomol.,45:414-420,doi:full/10.1603/0022-2585％282008％2945％5B414％3ATAADRK％5D2.0.CO％3B2；果蠅(Drosophilamelanogaster)、面象蟲(Triboliumcastaneum)、豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)、菸草天蛾(Manducasexta)，參見Whyard等(2009)InsectBiochem.Mol.Biol.,39:824-832,doi:10.1016/j.ibmb.2009.09.00；菜蛾(Plutellaxylostella)，參見Gong等(2011)PestManag.Sci.,67:514-520,doi:10.1002/ps.2086；桃蚜(Myzuspersicae)，參見Pitino等(2011)PLoSONE,6:e25709,doi:10.1371/journal.pone.0025709；褐飛蝨(Nilaparvatalugens)，參見Li等(2011)PestManag.Sci.,67:852-859,doi:10.1002/ps.2124和白粉蝨(煙粉蝨，Bemisiatabaci)，參見Upadhyay等(2011)J.Biosci.,36:153-161,doi:10.1007/s12038-011-9009-1。本發明涉及控制蟲害、尤其是侵擾作物植物且之前已經發現對RNA介導的基因抑制方法有抗性的昆蟲的方法，例如，小菜蛾(菜蛾)、草地夜蛾(草地粘蟲)、豆莢草盲蝽(西部無澤盲蝽)和Euschistusheros(新熱帶區褐臭蝽)。已經鑑別用於測試抗性昆蟲物種小菜蛾(菜蛾)、草地夜蛾(草地粘蟲)、豆莢草盲蝽(西部無澤盲蝽)和Euschistusheros(新熱帶區褐臭蝽)的雙鏈RNA(dsRNA)引發序列。這些引發劑被設計用於抑制新的靶基因，所述新的靶基因是之前被證實對西部玉米根蟲(Diabroticavirgifera)中的RNAi-介導的死亡率是有效目標的基因的推定的同源基因。本發明進一步涉及在控制蟲害的方法中有用的多核苷酸和重組DNA分子和構建體。本發明進一步涉及殺蟲組合物，和抗蟲害侵擾的轉基因植物。本發明還涉及用於鑑定對於控制蟲害有效的雙鏈RNA引發劑的方法，和用於鑑定可能代表實質功能的靶基因、使得這些基因成為RNAi-介導的沉默和控制蟲害的優選目標的方法。發明簡述本發明涉及控制昆蟲物種，尤其是經濟上或農學上重要的害蟲。本發明的組合物和方法包括重組多核苷酸分子，例如用於製備抗昆蟲物種侵擾的轉基因植物的重組DNA構建體和例如作為局部應用試劑以引起昆蟲物種中RNAi-介導的靶基因抑制且因此控制或預防那些昆蟲物種侵擾的RNA「引發劑」。本發明的另一種應用是包含多核苷酸的組合物(例如，包含用於抑制靶基因的dsRNA引發劑的組合物)，其局部施用於昆蟲物種或待保護以免受昆蟲物種侵擾的植物、植物部分、或種子。本發明進一步涉及用於選擇優選昆蟲靶基因的方法，所述靶基因很可能是RNAi-介導的控制昆蟲物種的有效目標。一方面，本發明提供用於控制植物的昆蟲侵擾的方法，包括用dsRNA接觸侵擾植物的昆蟲，其中所述dsRNA包括至少一個18個或更多個連續核苷酸的片斷，所述核苷酸的序列與所述昆蟲的靶基因的片段具有約95％到約100％的互補性，和其中所述靶基因的DNA序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44。在實施方式中，所述dsRNA包括具有與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補性的序列的RNA鏈。在實施方式中，所述dsRNA包括具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的RNA鏈。在實施方式中，所述dsRNA引發劑抑制昆蟲中的基因並且抑制或殺死昆蟲。另一方面，本發明提供在昆蟲中引起死亡或發育障礙的方法，包括在昆蟲的飲食中提供至少一種重組RNA，其包括至少一種與昆蟲的靶基因序列的片段基本上同一或基本上互補的沉默元件，其中所述靶基因序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44，和其中通過昆蟲攝取重組RNA導致昆蟲的死亡或發育障礙。在實施方式中，所述沉默元件包括具有與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補性的序列的RNA鏈。在實施方式中，所述沉默元件包括具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的RNA鏈。另一方面，本發明提供包括殺蟲有效量的重組RNA分子的殺蟲組合物，其中所述重組RNA分子包括至少一個18個或更多個連續核苷酸的片斷，所述核苷酸的序列與侵擾植物的昆蟲的靶基因的片段具有約95％到約100％的互補性，和其中所述靶基因的DNA序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44。在實施方式中，所述重組RNA分子是dsRNA。在實施方式中，所述重組RNA分子包括至少一個片斷(例如RNA鏈或RNA鏈的片斷)，其具有與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補性的序列。在實施方式中，所述重組RNA分子包括至少一個片斷(例如RNA鏈或RNA鏈的片斷)，其具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列。另一方面，本發明提供一種具有改進的抗蟲性的植物，包括在植物中表達重組DNA構建體，所述重組DNA構建體包括編碼至少一種與昆蟲的靶基因序列的片段基本上同一或基本上互補的沉默元件的DNA，其中所述靶基因序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44，和其中通過昆蟲攝取重組RNA導致昆蟲的死亡或發育障礙。在實施方式中，所述沉默元件是ssRNA。在其他實施方式中，所述沉默元件是dsRNA。在實施方式中，所述沉默元件包括RNA(例如RNA鏈或RNA鏈的片斷)，其具有與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補性的序列。在實施方式中，所述沉默元件包括RNA(例如RNA鏈或RNA鏈的片斷)，其具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列。另一方面，本發明提供包括異源啟動子的重組DNA構建體，例如在細菌細胞或真核細胞(例如植物細胞或昆蟲細胞)中具有功能的異源啟動子，其可操作地與編碼RNA轉錄物的DNA連接，其中所述RNA轉錄物包括具有與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補性的序列。在實施方式中，所述RNA轉錄物是ssRNA。在其他實施方式中，所述RNA轉錄物是dsRNA。在實施方式中，所述沉默元件包括RNA(例如RNA鏈或RNA鏈的片斷)，其具有與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補性的序列。在實施方式中，所述沉默元件包括RNA(例如RNA鏈或RNA鏈的片斷)，其具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列。在相關方面，本發明提供包括本發明多核苷酸或引發劑的人造組合物，例如用於局部施用至需要保護以免受昆蟲侵擾的植物或物質的dsRNA製劑、用於製備轉基因植物細胞和轉基因植物的重組構建體和載體、用於處理植物(包括植物種子或可繁殖部分例如塊莖)的製劑和塗層、用本發明多核苷酸處理或包含本發明多核苷酸的植物種子或可繁殖部分例如塊莖以及從這種植物、種子或可繁殖部分產生的商品和食物(尤其是具有可檢測含量的本發明多核苷酸的商品和食物)。本發明的進一步方面是結合肽或蛋白質的多克隆或單克隆抗體，所述肽或蛋白質由選自SEQIDNOs:1-12和43-44的序列或序列片段編碼；本發明的另一方面是結合肽或蛋白質的多克隆或單克隆抗體，所述肽或蛋白質由選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46或其補體的序列或序列片段編碼。這種抗體通過如本領域技術人員已知的常規方法來製備。本發明的其他方面和具體實施方式在以下發明詳述和工作實施例中公開。附圖說明圖1描繪了實施例2所述的在草地夜蛾(草地粘蟲，FAW)SF9細胞中dsRNA引發劑(TOPPANEL)T34640(SEQIDNO:17，靶向V-ATPaseA亞基)、(MIDDLEPANEL)T34642(SEQIDNO:18，靶向COPIcoatomerbeta亞基)或(BOTTOMPANEL)T34644(SEQIDNO:19，靶向COPIcoatomerbeta主要亞基)的轉染實驗的結果。圖2描繪了實施例2所述的在小菜蛾(菜蛾，DBM)細胞中dsRNA引發劑(TOPPANEL)T42017(SEQIDNO:21，靶向V-ATPase亞基A)、(TOPPANEL)T33310(SEQIDNO:29，靶向V-ATPase亞基A)、(MIDDLEPANEL)T32938(SEQIDNO:28，靶向COPIcoatomerbeta亞基)和(BOTTOMPANEL)T32937(SEQIDNO:13，靶向COPIcoatomerbeta主要亞基)的轉染實驗的結果。發明詳述除非另有定義，所使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬
技術領域：
：的普通技術人員所通常理解的相同含義。通常，所使用的命名法和如下所述的製備或實驗程序是本領域眾所周知和通常使用的。這些程序使用常規方法，例如本領域和各種一般文獻所提供的那些。當術語以單數形式提供時，本發明人也預期由該術語的複數形式所描述的本發明方面。當通過引用併入的參考文獻中使用的術語和定義中存在矛盾時，本申請中使用的術語具有給定的定義。所使用的其他技術術語具有其中使用它們的領域的普通含義，如各種領域-具體的詞典所示，例如「TheAmericanScienceDictionary」(EditorsoftheAmericanHeritageDictionaries,2011,HoughtonMifflinHarcourt,BostonandNewYork)、「McGraw-HillDictionaryofScientificandTechnicalTerms」(6thedition,2002,McGraw-Hill,NewYork)或「OxfordDictionaryofBiology」(6thedition,2008,OxfordUniversityPress,OxfordandNewYork)。發明人不意欲限制於機制或作用方式。其參考文獻僅為說明性目的而提供。除非另有說明，在本說明書文本中的核酸序列當從左到右閱讀時以5'到3'方向給出。本領域技術人員將了解給定的DNA序列理解為定義除了用尿嘧啶(U)核苷酸替換DNA的胸腺嘧啶(T)核苷酸之外與DNA序列相同的對應的RNA序列。因此，提供具體的DNA序列理解為定義準確的RNA等效物。給定的第一多核苷酸序列，不管DNA或RNA，進一步定義了其準確的補體(其可以是DNA或RNA)的序列，即通過形成Watson-Crick鹼基配對與第一多核苷酸完美雜交的第二多核苷酸。與靶基因或靶基因片段「基本上同一」或「基本上互補」是指設計多核苷酸鏈(或雙鏈多核苷酸的至少一條鏈)以使其與靶基因或靶基因片段或靶基因或靶基因片段的轉錄物雜交(通常在生理條件下，例如在活的植物或動物細胞中發現的那些)；本領域技術人員將理解這種雜交不一定需要100％的序列同一性或互補性。當第一核酸序列與第二核酸序列具有功能上的關係時，第一核酸序列「可操作地」與第二核酸序列連接或聯接。例如，如果啟動子提供DNA的轉錄或表達，則啟動子序列與DNA「可操作地連接」。通常，可操作地連接的DNA序列是連續的。術語「多核苷酸」通常是指包含多個核苷酸的DNA或RNA分子且通常是指「寡核苷酸」(長度為18-25個核苷酸的多核苷酸分子)和26個或更多個核苷酸的較長多核苷酸兩者。如本領域通常實踐的，多核苷酸也包括含有多個核苷酸(包括非規範核苷酸或化學修飾的核苷酸)的分子，例如參見技術手冊「RNAInterference(RNAi)andDsiRNAs」,2011(IntegratedDNATechnologiesCoralville,IA)中公開的化學修飾。通常，本發明的多核苷酸或引發劑，不管DNA或RNA或兩者，不管單鏈或雙鏈，包括至少一個與靶基因DNA或靶基因的RNA轉錄物的同等大小的片段基本上同一或互補的18個或更多個連續核苷酸(或，在雙鏈多核苷酸情況下，至少18個連續鹼基對)的片斷。在本公開中，「至少18個連續的」是指「從約18個到約10,000個，包括之間的每個整數點」。因此，本發明的實施方式包括包含長度為18-25個核苷酸(18聚體、19聚體、20聚體、21聚體、22聚體、23聚體、24聚體或25聚體)的寡核苷酸、或長度為26個或更多個核苷酸的中等長度的多核苷酸(26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約260、約270、約280、約290或約300個核苷酸的多核苷酸)、或長度超過約300個核苷酸的長多核苷酸(例如長度為約300-約400個核苷酸、約400-約500個核苷酸、約500-約600個核苷酸、約600-約700個核苷酸、約700-約800個核苷酸、約800-約900個核苷酸、約900-約1000個核苷酸、約300-約500個核苷酸、約300-約600個核苷酸、約300-約700個核苷酸、約300-約800個核苷酸、約300-約900個核苷酸或約1000個核苷酸、或甚至長度超過約1000個核苷酸，例如等於包括靶基因的編碼或非編碼或編碼和非編碼部分兩者的靶基因的完整長度的多核苷酸)的組合物。當多核苷酸是雙鏈，例如工作實施例中描述的dsRNA引發劑時，其長度可以類似地根據鹼基對來描述。雙鏈多核苷酸，例如工作實施例中描述的dsRNA引發劑，可以進一步根據一個或多個單鏈組分來描述。通常設計本發明的多核苷酸或引發劑以抑制或沉默一種或多種基因(「靶基因」)。術語「基因」是指提供轉錄物的表達或編碼轉錄物的核酸的任何部分。「基因」可以包括但不限於啟動子區域、5'非翻譯區、可以包括內含子區域的轉錄物編碼區、3'非翻譯區或這些區域的組合。在實施方式中，靶基因可以包括編碼或非編碼序列或兩者。在其他實施方式中，靶基因的序列與信使RNA同一或互補，例如，在實施方式中，靶基因是cDNA。通過用dsRNA接觸控制植物的昆蟲侵擾本發明的第一方面提供用於控制植物的昆蟲侵擾的方法，包括用雙鏈RNA(dsRNA)接觸侵擾植物的昆蟲，其中所述dsRNA包括至少一個18個或更多個連續核苷酸的片斷，所述核苷酸的序列與所述昆蟲的靶基因的片段具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的互補性，和其中所述靶基因的DNA序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44。在本上下文中，「控制」包括誘導昆蟲(成蟲或幼蟲或蛹)的生理或行為的變化，例如，但不限於，生長遲緩、死亡率增加、生殖能力降低、進食行為或運動降低或停止、或變形階段發育降低或停止。「雙鏈」是指通常在生理學相關的條件下在充分互補的、反平行核酸鏈之間發生的鹼基配對以形成雙鏈核酸結構。在各種實施方式中，昆蟲選自夜蛾屬、草盲蝽屬、美洲蝽屬和菜蛾屬。特別感興趣的昆蟲包括草地夜蛾(Spodopterafrugiperda，草地粘蟲)、豆莢草盲蝽(Lygushesperus，西部無澤盲蝽)、Euschistusheros(新熱帶區褐臭蝽)和小菜蛾(Plutellaxylostella，菜蛾)。所述方法的各種實施方式包括其中昆蟲是草地夜蛾(草地粘蟲)和靶基因包括選自SEQIDNOs:1-3的DNA序列；其中昆蟲是豆莢草盲蝽(西部無澤盲蝽)和靶基因包括選自SEQIDNOs:4-7、43和44的DNA序列；其中昆蟲是Euschistusheros(新熱帶區褐臭蝽)和靶基因包括選自SEQIDNOs:8-9的DNA序列；和其中昆蟲是小菜蛾(菜蛾)和靶基因包括選自SEQIDNOs:10-12的DNA序列的那些。所述方法的其他實施方式包括其中昆蟲是草地夜蛾(草地粘蟲)和dsRNA包括選自SEQIDNOs:17-19的序列；其中昆蟲是豆莢草盲蝽(西部無澤盲蝽)和dsRNA包括選自SEQIDNOs:14-16、22、26、45和46的序列；其中昆蟲是Euschistusheros(新熱帶區褐臭蝽)和dsRNA包括選自SEQIDNOs:23-25的序列；和其中昆蟲是小菜蛾(菜蛾)和dsRNA包括選自SEQIDNOs:13、20-21和28-29的序列。其他實施方式包括其中dsRNA具有如實施例5所述修飾的序列以消除與非靶標生物，例如表6所公開的修飾序列(SEQIDNOs:30-42)匹配的那些。植物可以是經歷昆蟲侵擾的任何植物，所述昆蟲侵擾可以通過本文公開的多核苷酸控制。特別感興趣的植物包括商業重要的植物，包括中耕作物植物、蔬菜和水果，和其他農學或裝飾性用途的植物。適合植物的實例提供於標題「植物」下。在方法的實施方式中，dsRNA包括多個片段，每一個為18個或更多個連續核苷酸且其序列與所述昆蟲的靶基因的片段具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的互補性。例如，dsRNA可以包括對應於靶基因的不同區域的片斷，或可以包括片斷的多個拷貝。在方法的其他實施方式中，dsRNA包括多個片斷，每一個為18或更多個連續核苷酸且其序列與不同靶基因的片段具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的互補性；以這種方法可以抑制多個靶基因或多個昆蟲物種。在方法的實施方式中，dsRNA是平端。在其他實施方式中，dsRNA在一端或兩端(末端)具有懸垂；懸垂可以是單個核苷酸或2、3、4、5、6或更多個核苷酸，且可以位於鏈的5'端或3'端上。dsRNA可以是化學合成的，或可以通過在微生物中表達、通過在植物細胞中表達、或通過微生物發酵來製備。dsRNA可以是化學修飾的，例如以改進穩定性或功效。在所述方法的一些實施方式中，接觸包括向昆蟲表面或被昆蟲侵擾的植物表面施用含有dsRNA的組合物。組合物可以包括或為固體、液體、粉末、懸浮液、乳劑、噴霧、包封劑、微珠、載體微粒、薄膜、基質或種子處理的形式。在實施方式中，例如可以通過在包括dsRNA的液體組合物中浸泡種子向種子施用組合物，其中種子將有效量dsRNA吸取或攝入種子內部或種子胚乳，以通過種子或植物或由種子生長的幼苗提供改進的抗蟲性。在實施方式中，接觸包括在組合物中提供dsRNA，所述組合物進一步包括一種或多種選自載體試劑、表面活性劑、有機矽酮化合物、多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸殺蟲劑、安全劑、誘蟲劑和昆蟲生長調節劑的組分。在實施方式中，接觸包括在組合物中提供dsRNA，所述組合物進一步包括至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇芸金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發光桿菌屬殺蟲蛋白、側孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑。在所述方法的一些實施方式中，接觸包括在昆蟲攝取的組合物中提供dsRNA，例如向昆蟲進食的植物施用的液體、乳劑或粉末，或以誘餌形式。這種組合物可以進一步包括一種或多種選自載體試劑、表面活性劑、有機矽酮化合物、多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸殺蟲劑、安全劑、誘蟲劑和昆蟲生長調節劑的組分。這種組合物可以進一步包括至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇芸金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發光桿菌屬殺蟲蛋白、側孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑。在實施方式中，dsRNA和殺蟲劑的組合提供協同作用的昆蟲控制水平，即大於如果單獨測試的dsRNA和殺蟲劑組分的效果之和。引起昆蟲死亡或發育障礙的方法本發明的另一方面提供引起昆蟲死亡或發育障礙的方法，包括在昆蟲的飲食中提供至少一種重組RNA，所述重組RNA包括至少一種與昆蟲的靶基因序列的片段基本上同一或基本上互補的沉默元件，其中所述靶基因序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44，和其中通過昆蟲攝取重組RNA導致昆蟲的死亡或發育障礙。所述方法應用於各種生命階段的昆蟲。在實施方式中，所述方法引起昆蟲幼蟲或蛹的死亡或發育障礙。在其他實施方式中，所述方法引起成蟲死亡。在所述方法的實施方式中，所述重組RNA包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的同一性或互補性。方法的實施方式包括其中昆蟲是草地夜蛾(草地粘蟲)和靶基因包括選自SEQIDNOs:1-3的DNA序列；其中昆蟲是豆莢草盲蝽(西部無澤盲蝽)和靶基因包括選自SEQIDNOs:4-7、43和44的DNA序列；其中昆蟲是Euschistusheros(新熱帶區褐臭蝽)和靶基因包括選自SEQIDNOs:8-9的DNA序列；和其中昆蟲是小菜蛾(菜蛾)和靶基因包括選自SEQIDNOs:10-12的DNA序列的那些。所述方法的其他實施方式包括其中昆蟲是草地夜蛾(草地粘蟲)和沉默元件包括選自SEQIDNOs:17-19的序列；其中昆蟲是豆莢草盲蝽(西部無澤盲蝽)和沉默元件包括選自SEQIDNOs:14-16、22、26、45和46的序列；其中昆蟲是Euschistusheros(新熱帶區褐臭蝽)和沉默元件包括選自SEQIDNOs:23-25的序列；和其中昆蟲是小菜蛾(菜蛾)和沉默元件包括選自SEQIDNOs:13、20-21和28-29的序列。其他的實施方式包括其中重組RNA具有如實施例5所述修飾的序列以消除與非靶標生物，例如表6所公開的修飾序列(SEQIDNOs:30-42)相匹配的那些。在方法的實施方式中，所述重組RNA是dsRNA。在這些實施方式中，dsRNA可以是平端dsRNA，或可以是在一端或兩端(末端)具有懸垂的dsRNA；懸垂可以是單個核苷酸或2、3、4、5、6或更多個核苷酸，且可以位於鏈的5'端或3'端上。dsRNA可以是化學合成的，或可以通過在微生物中表達、通過在植物細胞中表達、或通過微生物發酵來製備。dsRNA可以是化學修飾的，例如以改進穩定性或功效。在其中所述重組RNA是dsRNA的方法的實施方式中，dsRNA包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％的同一性或互補性。在所述方法的一些實施方式中，重組RNA以可攝取組合物的形式提供於昆蟲的飲食中，例如提供於向昆蟲進食的植物施用的液體、乳劑或粉末中，或以誘餌形式。這種組合物可以進一步包括一種或多種選自載體試劑、表面活性劑、有機矽酮化合物、多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸殺蟲劑、安全劑、誘蟲劑和昆蟲生長調節劑的組分。這種組合物可以進一步包括至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇芸金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發光桿菌屬殺蟲蛋白、側孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑。在實施方式中，重組RNA和殺蟲劑的組合提供協同作用的昆蟲控制水平，即大於如果單獨測試的重組RNA和殺蟲劑的效果之和。殺蟲組合物本發明的另一方面提供包括殺蟲有效量的重組RNA分子的殺蟲組合物，其中所述重組RNA分子包括至少一個18個或更多個連續核苷酸的片斷，所述核苷酸具有與侵擾植物的昆蟲的靶基因片段具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)互補性的序列，和其中所述靶基因的DNA序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44。「殺蟲有效」是指有效誘導侵擾植物的昆蟲(成蟲或幼蟲或蛹)的生理或行為的變化，例如，但不限於，生長遲緩、死亡率增加、生殖能力降低或繁殖力降低、進食行為或運動降低或停止、或變形階段發育降低或停止；在實施方式中，向植物施用殺蟲有效量的重組RNA分子改進植物對昆蟲侵擾的抗性。在殺蟲組合物的實施方式中，重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的同一性或互補性。在具體的實施方式中，重組RNA分子是包括具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的RNA鏈的dsRNA。在實施方式中，重組RNA分子是長度為至少50個鹼基對的dsRNA。在方法的實施方式中，重組RNA分子是dsRNA。在實施方式中，重組RNA分子是dsRNA，其可以是平端dsRNA，或可以是在一端或兩端(末端)具有懸垂的dsRNA；懸垂可以是單個核苷酸或2、3、4、5、6或更多個核苷酸，且可以位於鏈的5'端或3'端上。在實施方式中，重組RNA分子是可以是化學合成的dsRNA，或可以通過在微生物中表達、通過在植物細胞中表達、或通過微生物發酵來製備。在實施方式中，重組RNA分子是長度大於典型的天然存在的調控小RNA(例如內源產生的siRNA和成熟miRNA)的長度的dsRNA，即多核苷酸是長度為至少約30個連續鹼基對的雙鏈RNA。在實施方式中，重組RNA分子是長度為約50到約500個鹼基對的dsRNA。殺蟲組合物的實施方式包括其中昆蟲是草地夜蛾(草地粘蟲)和靶基因包括選自SEQIDNOs:1-3的DNA序列；其中昆蟲是豆莢草盲蝽(西部無澤盲蝽)和靶基因包括選自SEQIDNOs:4-7、43和44的DNA序列；其中昆蟲是Euschistusheros(新熱帶區褐臭蝽)和靶基因包括選自SEQIDNOs:8-9的DNA序列；和其中昆蟲是小菜蛾(菜蛾)和靶基因包括選自SEQIDNOs:10-12的DNA序列的那些。殺蟲組合物的其他實施方式包括其中昆蟲是草地夜蛾(草地粘蟲)和重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:17-19的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的同一性或互補性；其中昆蟲是豆莢草盲蝽(西部無澤盲蝽)和重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:14-16、22、26、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的同一性或互補性；其中昆蟲是Euschistusheros(新熱帶區褐臭蝽)和重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:23-25的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的同一性或互補性；和其中昆蟲是小菜蛾(菜蛾)和重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:13、20-21和28-29的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的同一性或互補性的那些。殺蟲組合物的具體實施方式包括其中昆蟲是草地夜蛾(草地粘蟲)和重組RNA分子是包括具有選自SEQIDNOs:17-19的序列的RNA鏈的dsRNA；其中昆蟲是豆莢草盲蝽(西部無澤盲蝽)和重組RNA分子是包括具有選自SEQIDNOs:14-16、22、26、45和46的序列的RNA鏈的dsRNA；其中昆蟲是Euschistusheros(新熱帶區褐臭蝽)和重組RNA分子是包括具有選自SEQIDNOs:23-25的序列的RNA鏈的dsRNA；和其中昆蟲是小菜蛾(菜蛾)和重組RNA分子是包括具有選自SEQIDNOs:13、20-21和28-29的序列的RNA鏈的dsRNA的那些。殺蟲組合物的其他實施方式包括其中重組RNA分子具有如實施例5所述修飾的序列以消除與非靶標生物，例如表6所公開的修飾序列(SEQIDNOs:30-42)相匹配的那些。0037在各種實施方式中，殺蟲組合物包括殺蟲有效量的由天然存在的核糖核苷酸(例如在天然存在的RNA中發現的那些)組成的重組RNA分子。在某些實施方式中，多核苷酸是核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合，例如，合成多核苷酸主要由核糖核苷酸組成但具有一個或多個末端脫氧核糖核苷酸或一個或多個末端雙脫氧核糖核苷酸。在某些實施方式中，多核苷酸包括非規範核苷酸例如次黃嘌呤核苷、硫尿核苷或假尿嘧啶核苷。在某些實施方式中，多核苷酸包括化學修飾的核苷酸。化學修飾的寡核苷酸或多核苷酸的實例是本領域眾所周知的；參見例如美國專利公開2011/0171287、美國專利公開2011/0171176、美國專利公開2011/0152353、美國專利公開2011/0152346和美國專利公開2011/0160082，其通過引用併入本文。說明性實例包括但不限於，可以用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵合修飾來部分或完全修飾的天然存在的寡核苷酸或多核苷酸的磷酸二脂主鏈，修飾的核苷鹼基或修飾的糖可用於寡核苷酸或多核苷酸合成，且寡核苷酸或多核苷酸可以用螢光性部分(例如螢光素或若丹明)或其他標記(例如生物素)標記。重組RNA分子通過本領域已知的合適手段提供。實施方式包括其中重組RNA分子是化學合成的(例如通過體外轉錄、例如利用T7聚合酶或其他聚合酶的轉錄)、通過在微生物中或在細胞培養物(例如在培養物中生長的植物或昆蟲細胞)中表達產生、通過在植物細胞中表達產生或通過微生物發酵產生。在實施方式中，在該方法中使用的重組RNA分子作為分離的RNA片段(不是表達構建體的一部分，即，缺少額外元件例如啟動子或終止子序列)提供。這種重組RNA分子可以較短，例如約18到約300或約50到約500個核苷酸(對於單鏈多核苷酸)或約18到約300或約50到約500個鹼基對(對於雙鏈多核苷酸)的單鏈或雙鏈RNA分子。實施方式包括其中多核苷酸是包括具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的片斷的dsRNA。在實施方式中，殺蟲組合物可以為選自固體、液體、粉末、懸浮液、乳劑、噴霧、包封劑、微珠、載體微粒、薄膜、基質、土壤澆灌、昆蟲飲食或昆蟲誘餌和種子處理的形式。在實施方式中，例如可以通過在包括dsRNA的液體殺蟲組合物中浸泡種子來向種子施用殺蟲組合物，其中種子將有效量的dsRNA吸取或攝入種子內部或種子胚乳內，以通過種子或植物或由種子生長的幼苗提供對改進的抗蟲性。在一些實施方式中，殺蟲組合物以被昆蟲攝取的形式提供，例如提供於向昆蟲進食的植物施用的液體、乳劑或粉末中，或以誘餌形式。所述殺蟲組合物可以進一步包括一種或多種選自載體試劑、表面活性劑、有機矽酮化合物、多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸殺蟲劑、安全劑、誘蟲劑和昆蟲生長調節劑的組分。殺蟲組合物可以進一步包括至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇芸金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發光桿菌屬殺蟲蛋白、側孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑。在實施方式中，重組RNA分子和殺蟲劑的組合提供協同作用的昆蟲控制水平，即大於如果單獨測試的重組RNA分子和殺蟲劑組分的效果之和。本發明的相關方面是用本文所述的殺蟲組合物處理的植物或處理植物的種子，其中所述植物顯示改進的抗蟲性。在實施方式中，與沒有用殺蟲組合物處理的植物相比，所述顯示改進的抗蟲性的植物的特徵在於提高的產量。提供具有改進的抗蟲性的植物的方法本發明的另一方面提供一種提供具有改進的抗蟲性的植物的方法，包括在植物中表達包括編碼RNA的DNA的重組DNA構建體，所述RNA包括至少一個與昆蟲的靶基因序列的片段基本上同一或基本上互補的沉默元件，其中所述靶基因序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44，和其中通過昆蟲攝取RNA導致昆蟲的死亡或發育障礙。在方法的實施方式中，沉默元件的序列與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)的同一性或互補性。在具體的實施方式中，沉默元件是由兩條分離的、基本上互補的鏈形成雙鏈RNA的RNA，其中至少一條RNA鏈包括與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)同一性或互補性的序列。在其他實施方式中，沉默元件是由單個自雜交髮夾轉錄物形成雙鏈RNA的RNA，其中髮夾的一條「臂」包括與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)同一性或互補性的序列。其他實施方式包括其中沉默元件具有如實施例5所述修飾的序列以消除與非靶標生物，例如表6所公開的修飾序列(SEQIDNOs:30-42)相匹配的那些。在方法的實施方式中，重組DNA構建體進一步包括與編碼RNA的DNA可操作地連接的異源啟動子，所述RNA包括至少一個沉默元件，其中所述異源啟動子在植物細胞中具有功能。在植物細胞中具有功能的啟動子包括標題「啟動子」下所列的那些。在方法的實施方式中，重組DNA構建體通過轉基因表達或瞬時表達在植物中表達。在一些實施方式中，所述方法進一步包括在植物中表達至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇芸金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發光桿菌屬殺蟲蛋白、側孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑。殺蟲劑可以由包括編碼至少一個沉默元件的DNA的相同的重組DNA構建體表達，或由不同的重組DNA構建體表達。本發明的相關方面是具有改進的抗蟲性的植物，或這種植物的種子，其中所述植物通過包括在植物中表達重組DNA構建體的方法來提供，所述重組DNA構建體包括編碼RNA的DNA，所述RNA包括至少一個與昆蟲的靶基因序列片段基本上同一或基本上互補的沉默元件，其中所述靶基因序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44，和其中通過昆蟲攝取RNA導致昆蟲的死亡或發育障礙。在實施方式中，與沒有用殺蟲組合物處理的植物相比，顯示改進的抗蟲性的植物的特徵在於提高的產量。本發明也涵蓋通過這種方法提供並顯示改進的抗蟲性的植物的果實、種子或可繁殖部分。本發明的相關方面是具有改進的抗蟲性的植物或幼苗，其中所述植物或幼苗由用重組DNA構建體處理的種子生長，所述重組DNA構建體包括編碼RNA的DNA，所述RNA包括至少一個與昆蟲的靶基因序列片段基本上同一或基本上互補的沉默元件，其中所述靶基因序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44；或者所述植物由用RNA直接處理的種子生長，所述RNA包括至少一個與昆蟲的靶基因序列片段基本上同一或基本上互補的沉默元件，其中所述靶基因序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44。在實施方式中，通過在包括重組DNA構建體(或包括至少一個沉默元件的編碼的RNA)的液體組合物中浸泡種子來施用重組DNA構建體(或包括至少一個沉默元件的編碼的RNA)，其中種子將有效量DNA或編碼的RNA吸取或攝入種子內部或種子胚乳內，以通過由種子生長的植物或幼苗提供改進的抗蟲性。用於昆蟲控制的編碼RNA的重組DNA構建體本發明的另一方面提供包括與編碼RNA轉錄物的DNA可操作連接的異源啟動子的重組DNA構建體，所述RNA轉錄物包括與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)同一性或互補性的序列。在具體的實施方式中，RNA轉錄物由分離的、基本上互補的鏈(例如其中一條鏈在分離的DNA構建體上編碼或其中兩條鏈在編碼RNA轉錄物的DNA的分離部分上編碼，和其是單獨轉錄或單獨製備，例如在重組酶或核酸酶的作用下)形成雙鏈RNA，其中至少一條RNA鏈包括與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)同一性或互補性的序列。在其他實施方式中，RNA轉錄物由單個自雜交髮夾轉錄物形成雙鏈RNA，其中髮夾的一條「臂」包括與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％(例如約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％)同一性或互補性的序列。重組DNA構建體的實施方式包括其中異源啟動子對於在細菌中表達RNA轉錄物具有功能的那些。在其中重組DNA構建體將在細菌中表達的實施方式中，所述細菌選自大腸桿菌(Escherichiacoli)、桿菌屬(Bacillusspecies)、假單胞細菌屬(Pseudomonasspecies)、致病桿菌屬(Xenorhabdusspecies)或發光桿菌屬(Photorhabdusspecies)。在其他實施方式中，重組DNA構建體包括在植物細胞中具有功能的異源啟動子。在實施方式中，將重組DNA構建體包含於重組載體，例如重組植物病毒載體或重組杆狀病毒載體中。在實施方式中，將重組DNA構建體例如通過穩定轉化整合入植物染色體或質體中。本發明的相關方面包括其基因組中包含重組DNA構建體的轉基因植物細胞，和包括這種轉基因植物細胞的轉基因植物。轉基因植物細胞和植物通過本領域已知的方法製備，例如在標題「製備和使用轉基因植物細胞和轉基因植物」下描述的那些。本發明的進一步方面包括由這種轉基因植物製備的商品，和轉基因植物的轉基因後代種子或可繁殖植物部分。相關的信息和技術植物用於處理和保護植物免受昆蟲侵擾的本文描述的方法和組合物可用於大量植物。其中可使用本文公開的方法和組合物的適合的植物包括但不限於穀物和飼草(水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、高粱、珍珠稷、龍爪稷、冷季型飼草和百喜草)、油籽作物(大豆、包括加拿大油菜和油籽油菜的油籽芸苔、向日葵、花生、亞麻、芝麻和紅花)、豆類顆粒和飼料(菜豆、豇豆、豌豆、蠶豆、小扁豆、寬葉菜豆、亞洲豆、木豆、野豌豆、鷹嘴豆、羽扇豆、紫花苜蓿和苜蓿)、溫帶水果和堅果(蘋果、梨、桃、李、漿果作物、櫻桃、葡萄、橄欖、杏仁和胡桃)、熱帶和亞熱帶水果和堅果(柑橘屬果樹，包括酸橙、桔子和葡萄柚；香蕉和車前草、菠蘿、木瓜、芒果、鱷梨、奇異果、百香果和柿)、蔬菜作物(茄科植物，包括番茄、茄子和胡椒；蔬菜芸苔；蘿蔔、胡蘿蔔、葫蘆、蔥屬、蘆筍和葉菜)、糖、塊莖和纖維作物(甘蔗、甜菜、甜菊、馬鈴薯、甘薯、木薯和棉花)、種植作物、觀賞植物和草皮草(菸草、咖啡、可可、茶、橡膠樹、藥用植物、觀賞植物和草皮草)和森林樹種。額外的構建體元件本發明的多核苷酸和核酸分子的實施方式可以包括額外元件，例如啟動子、小RNA識別位點、適配子或核酶、額外和額外的用於表達編碼序列(例如，為表達轉基因如殺蟲蛋白或選擇標記)或非編碼序列(例如，為表達額外的抑制元件)的表達盒。例如，本發明的一方面提供包括與編碼RNA轉錄物的DNA可操作連接的異源啟動子的重組DNA構建體，所述RNA轉錄物包括與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補性的序列。在其他實施方式中，將包括與DNA可操作連接的啟動子的重組DNA構建體整合入植物基因組，所述DNA編碼：(a)包括與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補性的序列的RNA轉錄物，和(b)適配子，其中包括RNA適配子和RNA沉默元件的RNA轉錄物在植物細胞中表達；適配子用於將RNA沉默元件引導到細胞的期望位置。在另一個實施方式中，包括小RNA(例如通過僅在特定細胞或組織中表達的miRNA或siRNA)結合和切割的一個或多個識別位點允許植物中更精確的表達模式，其中當小RNA表達時，重組DNA構建體的表達被抑制。這種額外元件描述如下。啟動子本發明使用的啟動子在其中構建體意欲轉錄的細胞中具有功能。通常這些啟動子是異源啟動子，如重組構建體中所使用，即，它們本質上不被認為是可操作地與本發明構建體中所使用的其他核酸元件連接。在各種實施方式中，啟動子選自組成型啟動子、空間特異性啟動子、時間特異性啟動子、發育特異性啟動子和誘導型啟動子。在許多實施方式中，啟動子是在植物中具有功能的啟動子，例如polII啟動子、polIII啟動子、polIV啟動子或polV啟動子。適用於本發明重組DNA構建體的非組成型啟動子包括空間特異性啟動子、時間特異性啟動子和誘導型啟動子。空間特異性啟動子可以包括細胞器-、細胞-、組織-或器官-特異性啟動子(例如用於分別在質體、根、花粉或種子中表達的質體特異性、根特異性、花粉特異性或種子特異性啟動子)。在許多情況下種子-特異性、胚胎-特異性、糊粉-特異性或胚乳-特異性啟動子特別有用。時間特異性啟動子可以包括傾向於在植物生長周期中某些發育階段期間、或在白天或夜晚的不同時間期間、或在一年的不同季節促進表達的啟動子。誘導型啟動子包括通過化學品或通過環境條件例如但不限於生物或非生物脅迫(例如水分不足或乾旱、熱、冷、高或低的營養或鹽水平、高或低的光照水平、或害蟲或病原體侵染)誘導的啟動子。MicroRNA啟動子是有用的，尤其是具有時間特異性、空間特異性或誘導型表達模式的那些；miRNA啟動子的實例以及鑑別具有特異性表達模式的miRNA啟動子的方法提供於美國專利申請公開2006/0200878、2007/0199095和2007/0300329中，其特別通過引用併入本文。表達特異性啟動子也可以包括一般通過組成型表達但以不同程度或「強度」表達的啟動子，包括通常認為是「強啟動子」或「弱啟動子」的啟動子。特別感興趣的啟動子包括以下實例：從農桿菌的T-DNA分離的蛋白石合酶啟動子；花椰菜花葉病毒35S啟動子；增強的啟動子元件或嵌合的啟動子元件例如與增強子元件(來自玉米的熱休克蛋白70的內含子)連接的增強的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子；根特異性啟動子例如美國專利5,837,848；6,437,217和6,426,446中公開的那些；美國專利6,433,252公開的玉米L3油質蛋白啟動子；美國專利申請公開2004/0216189中公開的編碼位於質體的醛縮酶的植物核基因的啟動子；美國專利6,084,089公開的冷誘導型啟動子；美國專利6,140,078公開的鹽誘導型啟動子；美國專利6,294,714公開的光誘導型啟動子；美國專利6,252,138公開的病原體誘導型啟動子；和美國專利申請公布2004/0123347A1公開的水分不足-誘導型啟動子。公開了啟動子及其使用，尤其是在植物中具有功能的重組DNA構建體的所有以上描述的專利和專利公開通過引用併入本文。感興趣的植物導管或韌皮部特異性啟動子包括髮根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的rolC或rolA啟動子、根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)T-DNA基因5的啟動子、水稻蔗糖合酶RSs1基因啟動子、鴨蹠草黃斑駁病毒啟動子、椰子葉腐病毒啟動子、水稻東格魯杆狀病毒啟動子、豌豆穀氨醯胺合酶GS3A基因啟動子、馬鈴薯轉化酶基因的invCD111和invCD141啟動子、Kertbundit等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,88:5212-5216的從擬南芥分離的在菸草中顯示具有韌皮部特異性表達的啟動子、VAHOX1啟動子區域、豌豆細胞壁轉化酶基因啟動子、來自胡蘿蔔的酸轉化酶基因啟動子、硫酸鹽轉運基因Sultr1；3的啟動子、植物蔗糖合酶基因的啟動子和植物蔗糖轉運基因的啟動子。適合與本發明重組DNA構建體或多核苷酸一起使用的啟動子包括聚合酶II(「polII」)啟動子和聚合酶III(「polIII」)啟動子。RNA聚合酶II轉錄長度通常短於400個核苷酸的結構或催化性RNA，並將T殘餘物的簡單運行識別為終止信號；它已經用於轉錄siRNA雙鏈體(參見例如Lu等.(2004)NucleicAcidsRes.,32:e171)。因此PolII啟動子在其中將由本發明重組DNA構建體來製備短RNA轉錄物的一些實施方式中是優選的。在一個實施方式中，重組DNA構建體包括PolII啟動子以表達側翼為自切割核酶序列(例如自切割錘頭核酶)的RNA轉錄物，產生經加工的RNA，例如結合Leptinotarsa靶基因的轉錄物的單鏈RNA，其具有確定的5'和3'端，不含潛在的幹擾側翼序列。另一種方法使用polIII啟動子以生成具有相對確定的5'和3'端的轉錄物，即轉錄具有最少5'和3'側翼序列的RNA。在一些實施方式中，PolIII啟動子(例如U6或H1啟動子)對於增加導致轉錄RNA中2個鹼基對懸垂(UU)的短的富含AT的轉錄終止位點而言是優選的；這可例如用於表達siRNA型構建體。已經報導使用polIII啟動子來驅動siRNA構建體的表達；參見vandeWetering等.(2003)EMBORep.,4:609-615,和Tuschl(2002)NatureBiotechnol.,20:446-448。杆狀病毒啟動子例如杆狀病毒多角體蛋白和p10啟動子是本領域已知且可商購的；例如參見Invitrogen的「GuidetoBaculovirusExpressionVectorSystems(BEVS)andInsectCellCultureTechniques」,2002(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)和F.J.Haines等「BaculovirusExpressionVectors」,未標註日期的(OxfordExpressionTechnologies,Oxford,UK)。啟動子元件可以包括非天然存在的啟動子或啟動子元件或其同源物但可以調節基因表達的核酸序列。這種「與基因無關的」調控序列的實例包括包含配體結合區域或適配子(參見下文「適配子」)和調控區域(其可以是順式作用)的天然存在或人工設計的RNA序列。參見例如Isaacs等(2004)Nat.Biotechnol.,22:841-847,BayerandSmolke(2005)NatureBiotechnol.,23:337-343,MandalandBreaker(2004)NatureRev.Mol.CellBiol.,5:451-463,DavidsonandEllington(2005)TrendsBiotechnol.,23:109-112,Winkler等(2002)Nature,419:952-956,Sudarsan等(2003)RNA,9:644-647,andMandalandBreaker(2004)NatureStruct.Mol.Biol.,11:29-35。可以為具體的空間或時間特異性選擇或設計這種「核糖調節子」，例如，僅在存在(或不存在)合適配體的給定濃度的情況下調控DNA的翻譯，所述DNA編碼用於抑制靶基因的沉默元件。一個實例是在脅迫下(例如非生物脅迫例如水、溫度或營養脅迫、或生物脅迫例如粘附害蟲或病原體)植物產生的對內源性配體(例如茉莉酮酸或水楊酸)起反應的核糖調節子；在脅迫下，內源性配體的水平增加到足以使核糖調節子開始轉錄DNA的水平，所述DNA編碼用於抑制靶基因的沉默元件。重組酶位點在一些實施方式中，本發明重組DNA構建體或多核苷酸包括編碼一個或個位點特異性重組酶識別位點的DNA。在一個實施方式中，重組DNA構建體包括至少一對loxP位點，其中loxP位點之間的DNA的位點特異性重組通過Cre重組酶介導。選擇loxP位點的位置和相對方向以實現期望的重組；例如，當loxP位點處於相同方向時，loxP位點之間的DNA以環形切除。在另一個實施方式中，重組DNA構建體包括編碼一個loxP位點的DNA；在Cre重組酶和另一個具有loxP位點的DNA存在下，兩個DNA重組。適配子在一些實施方式中，本發明重組DNA構建體或多核苷酸包括加工至RNA適配子的DNA，即通過並非主要基於Watson-Crick鹼基配對的結合機制結合配體的RNA(例如，與互補的反平行核酸鏈之間發生的以形成雙鏈核酸結構的鹼基配對相反)。例如參見EllingtonandSzostak(1990)Nature,346:818-822。適配子的實例可以例如發現於公眾適配子資料庫，於aptamer.icmb.utexas.edu在線可得(Lee等.(2004)NucleicAcidsRes.,32(1):D95-100)。然而，本發明中可用的適配子可以是單價的(結合單個配體)或多價的(結合超過一個單獨配體，例如結合兩個或更多個不同配體的一個單元)。可用於本發明的配體包括核酸次級結構通過並非主要基於Watson-Crick鹼基配對的機制可以識別並結合的任何分子(或分子部分)。以這種方法，配體和適配子的識別和結合類似於抗原和抗體那樣，或生物效應子和受體那樣。配體可以包括單個分子(或分子部分)、或兩個或更多個分子(或分子部分)的組合，且可以包括一個或多個高分子絡合物(例如聚合物、脂質雙層、脂質體、細胞膜或其他的細胞結構或細胞表面)。具體的配體實例包括維生素例如輔酶B12和焦磷酸硫胺素、黃素單核苷酸、鳥嘌呤、腺苷、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷高半胱氨酸、輔酶A、賴氨酸、酪氨酸、多巴胺、葡糖胺-6-磷酸酯、咖啡因、茶鹼、抗生素例如氯黴素和新黴素、除草劑例如草甘磷和麥草畏；蛋白質，包括病毒或噬菌體外殼蛋白和無脊椎動物表皮或消化道表面蛋白質；和RNA，包括病毒RNA、轉運RNA(t-RNA)、核糖體RNA(rRNA)和RNA聚合酶例如RNA依賴性的RNA聚合酶(RdRP)。可用於本發明的一類RNA適配子是不結合配體但熱響應的「熱開關」，即適配子的構象由溫度決定；參見例如Box3inMandalandBreaker(2004)NatureRev.Mol.CellBiol.,5:451-463。轉基因轉錄單位在一些實施方式中，本發明的重組DNA構建體或多核苷酸包括轉基因轉錄單位。轉基因轉錄單位包括編碼目的基因例如天然蛋白質或異源蛋白質的DNA序列。目的基因可以是來自任何物種(包括但不限於非真核生物例如細菌和病毒；真菌、原生生物、植物、無脊椎動物和脊椎動物)的任何編碼或非編碼序列。特定的目的基因是編碼至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇芸金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發光桿菌屬殺蟲蛋白、側孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑的基因。根據轉基因的轉錄需要，轉基因轉錄單位可以進一步包括5'或3'序列或兩者。內含子在一些實施方式中，本發明的重組DNA構建體或多核苷酸包括編碼可剪切內含子的DNA。「內含子」通常是指位於外顯子(DNA的蛋白質編碼片斷或相應的轉錄RNA)之間的DNA片斷(或由這種片斷轉錄的RNA)，其中，在信使RNA成熟期間，所存在的內含子通過在真核生物的核中發生的切割/連接過程從RNA鏈酶促「剪切出去」或去除。術語「內含子」也適用於非編碼DNA序列，其轉錄為可以從成熟RNA轉錄物剪切出去但不是在蛋白質編碼的外顯子之間發現的內含子的RNA片斷。這樣的一個實例是植物中能夠增強下遊編碼序列表達(有時，尤其在單子葉植物中)的可剪切序列；這些可剪切序列天然位於一些植物基因的5'非翻譯區，以及一些病毒基因中(例如菸草花葉病毒5'前導序列或由GallieandWalbot(1992)NucleicAcidsRes.,20:4631-4638描述為增強植物基因表達的「Ω」前導序列)。這些可剪切序列或「增強表達的內含子」可以人工插入啟動子和任何蛋白質編碼外顯子之間的植物基因的5'非翻譯區。這種增強表達的內含子的實例包括但不限於玉米乙醇脫氫酶(Zm-Adh1)、玉米Bronze-1增強表達的內含子、水稻肌動蛋白1(Os-Act1)內含子、Shrunken-1(Sh-1)內含子、玉米蔗糖合酶內含子、熱休克蛋白18(hsp18)內含子和82千道爾頓熱休克蛋白(hsp82)內含子。通過引用特別引入本文的美國專利5,593,874和5,859,347描述了通過在位於基因啟動子的3'和第一個蛋白質編碼外顯子的5'的非翻譯前導序列中引入源自70千道爾頓玉米熱休克蛋白(hsp70)的增強表達的內含子來改進用於植物的重組DNA構建體的方法。核酶在一些實施方式中，本發明的重組DNA構建體或多核苷酸包括編碼一種或多種核酶的DNA。特別感興趣的核酶包括自切割核酶、錘頭核酶、或髮夾核酶。在一個實施方式中，重組DNA構建體包括編碼一種或多種用來切割轉錄RNA以提供確定的RNA片斷(例如用於抑制Leptinotarsa靶基因的沉默元件)的核酶的DNA。基因抑制元件在一些實施方式中，本發明的重組DNA構建體或多核苷酸包括編碼額外的基因抑制元件的DNA，所述額外的基因抑制元件用於抑制除Leptinotarsa靶基因以外的靶基因。待抑制的靶基因可以包括編碼或非編碼序列或兩者。適合的基因抑制元件詳細描述於美國專利申請公開2006/0200878，其公開通過引用特別引入本文，且包括一個或多個：(a)包括至少一個反義DNA片斷(即對至少一個待抑制的基因片斷是反義的)的DNA；(b)包括至少一個反義DNA片斷(即對至少一個待抑制的基因片斷是反義的)的多個拷貝的DNA；(c)包括至少一個有義DNA片斷(即至少一個待抑制的基因片斷)的DNA；(d)包括至少一個有義DNA片斷(即至少一個待抑制的基因片斷)的多個拷貝的DNA；(e)轉錄為通過形成雙鏈RNA來抑制待抑制的基因的RNA且包括至少一個反義DNA片斷(即對至少一個待抑制的基因片斷是反義的)和至少一個有義DNA片斷(即至少一個待抑制的基因片斷)的DNA；(f)轉錄為通過形成單個雙鏈RN來抑制待抑制的基因的RNA且包括多個串聯的反義DNA片斷(即對至少一個待抑制的基因片斷是反義的)和多個串聯的有義DNA片斷(即至少一個待抑制的基因片斷)的DNA；(g)轉錄為通過形成多個雙鏈RNA來抑制待抑制的基因的RNA且包括多個反義DNA片斷(即對至少一個待抑制的基因片斷是反義的)和多個有義DNA片斷(即至少一個待抑制的基因片斷)的DNA，其中所述多個反義DNA片斷和多個有義DNA片斷排列在一系列反向重複序列中；(h)包括源自植物miRNA的核苷酸的DNA；(i)包括siRNA核苷酸的DNA；(j)轉錄為能夠結合配體的RNA適配子的DNA；和(k)轉錄為能夠結合配體的RNA適配子的DNA，和轉錄為能夠調控待抑制基因的表達的調控RNA的DNA，其中所述調控依賴於調控RNA的構象，調控RNA的構象受RNA適配子的結合狀態的變構影響。在一些實施方式中，內含子用於在缺少任何蛋白編碼外顯子(編碼序列)的情況下遞送基因抑制元件。在一個實施例中，通過將基因抑制元件埋入內含子來中斷內含子例如表達增強內含子(在某些實施方式中是優選的)，其中在轉錄時，基因抑制元件從內含子切除。因此，不要求蛋白編碼外顯子提供本文公開的重組DNA構建體的基因抑制功能。轉錄調控元件在一些實施方式中，本發明的重組DNA構建體或多核苷酸包括編碼轉錄調控元件的DNA。轉錄調控元件包括調控本發明重組DNA構建體的表達水平(相對於缺少這種調控元件情況下的它的表達)的元件。適合的轉錄調控元件的實例包括核糖開關(順式或反式作用)、轉錄穩定序列和miRNA識別位點，如美國專利申請公布2006/0200878所詳細描述，通過引用特別引入本文。製備和使用轉基因植物細胞和轉基因植物植物轉化可以包括任何若干種眾所周知的方法和組合物。用於植物轉化的適合的方法幾乎包括可以將DNA引入細胞的任何方法。植物轉化的一種方法是微粒轟擊，例如，如美國專利5,015,580(大豆)、5,538,880(玉米)、5,550,318(玉米)、5,914,451(大豆)、6,153,812(小麥)、6,160,208(玉米)、6,288,312(水稻)、6,365,807(水稻)和6,399,861(玉米)和6,403,865(玉米)所述，所有專利通過引用引入以能夠生產轉基因植物。植物轉化的另一種有用的方法是藉助於包含二元Ti質粒系統的農桿菌的農桿菌介導的轉化，其中農桿菌攜帶第一Ti質粒和包含至少一種野生型Ti質粒的T-DNA邊界的第二嵌合質粒、在轉化的植物細胞中具有功能且可操作地連接至本發明多核苷酸或重組DNA構建體的啟動子。參見例如通過引用引入的美國專利5,159,135中描述的二元系統。還參見DeFramond(1983)Biotechnology,1:262-269；andHoekemaetal.,(1983)Nature,303:179。在這種二元系統中，包含一個或多個T-DNA邊界的較小質粒可在適合的選擇性寄主例如大腸桿菌中方便地構建和操作，然後轉入農桿菌。農桿菌介導的植物(特別是作物植物)轉化的詳細程序包括美國專利5,004,863、5,159,135和5,518,908(棉花)；5,416,011、5,569,834、5,824,877和6,384,301(大豆)；5,591,616和5,981,840(玉米)、5,463,174(芸苔，包括加拿大油菜)、7,026,528(小麥)和6,329,571(水稻)和美國專利申請公布2004/0244075(玉米)和2001/0042257A1(甜菜)中公開的程序，所有專利通過引用特別引入以能夠生產轉基因植物。美國專利申請公開2011/0296555在實施例5中公開了轉化載體(包括載體序列)和轉化玉米、大豆、加拿大油菜、棉花和甘蔗的詳細方案，其通過引用特別引入以能夠生產轉基因植物。在雙子葉植物和單子葉植物的許多植物品種中已經報導了類似的方法，尤其包括花生(Cheng等(1996)PlantCellRep.,15:653)；蘆筍(Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84:5345)；大麥(WanandLemaux(1994)PlantPhysiol.,104:37)；水稻(Toriyama等(1988)Bio/Technology,6:10；Zhang等(1988)PlantCellRep.,7:379；小麥(Vasil等(1992)Bio/Technology,10:667；Becker等(1994)PlantJ.,5:299)，紫花苜蓿(Masoud等(1996)Transgen.Res.,5:313)；和番茄(Sun等(2006)PlantCellPhysiol.,47:426-431)。還參見通過引用引入的美國專利申請公開2003/0167537A1中的載體、轉化方法和生產轉化的擬南芥(Arabidopsisthaliana)植物的描述，其中轉錄因子通過CaMV35S啟動子組成性表達。尤其對茄科植物有用的轉化方法是本領域眾所周知的。例如參見番茄(Sharma等(2009),J.Biosci.,34:423-433)、茄子(Arpaia等(1997)Theor.Appl.Genet.,95:329-334)、馬鈴薯(Bannerjee等(2006)PlantSci.,170:732-738；Chakravarty等(2007)Amer.J.PotatoRes.,84:301-311；S.Millam「Agrobacterium-mediatedtransformationofpotato.」Chapter19(pp.257-270),「TransgenicCropsoftheWorld:EssentialProtocols」,IanS.Curtis(editor),Springer,2004)和胡椒(Li等(2003)PlantCellReports,21:785-788)的公開描述的轉化方法。穩定的轉基因馬鈴薯、番茄和茄子已經商業化引入各種區域；參見例如K.Redenbaugh等「SafetyAssessmentofGeneticallyEngineeredFruitsandVegetables:ACaseStudyoftheFLAVRSAVRTMTomato」,CRCPress,BocaRaton,1992，和GM作物資料庫中商業的轉基因作物的廣泛公開可獲得的記錄，參見：CERA.(2012).GMCropDatabase.CenterforEnvironmentalRiskAssessment(CERA),ILSIResearchFoundation,WashingtonD.C.，在www.cera-gmc.org/？action＝gm_crop_database上電子可獲得。其他植物品種的各種轉化方法是本領域眾所周知的，例如參見百科全書參考文獻，「CompendiumofTransgenicCropPlants」，由ChittaranjanKole和TimothyC.Hall編輯，BlackwellPublishingLtd.,2008；ISBN978-1-405-16924-0(在mrw.interscience.wiley.com/emrw/9781405181099/hpt/toc電子可獲得)，其描述了穀物和飼草(水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、高粱、珍珠稷、龍爪稷、冷季型飼草和百喜草)、油籽作物(大豆、油籽芸苔、向日葵、花生、亞麻、芝麻和紅花)、豆類顆粒和飼料(菜豆、豇豆、豌豆、蠶豆、小扁豆、寬葉菜豆、亞洲豆、木豆、野豌豆、鷹嘴豆、羽扇豆、紫花苜蓿和苜蓿)、溫帶水果和堅果(蘋果、梨、桃、李、漿果作物、櫻桃、葡萄、橄欖、杏仁和胡桃)、熱帶和亞熱帶水果和堅果(柑橘屬果樹、葡萄柚、香蕉和車前草、菠蘿、番木瓜、芒果、鱷梨、奇異果、雞蛋果和柿)、蔬菜作物(番茄、茄子、胡椒、蔬菜芸苔、蘿蔔、胡蘿蔔、葫蘆、蔥屬、蘆筍和葉菜)、糖、塊莖和纖維作物(甘蔗、甜菜、甜菊、馬鈴薯、甘薯、木薯和棉花)、種植作物、觀賞植物和草皮草(菸草、咖啡、可可粉、茶、橡膠樹、藥用植物、觀賞植物和草皮草)和森林樹種的轉化方案。提供包含穩定整合的重組DNA的轉基因植物細胞和轉基因植物的轉化方法優選在培養基的組織培養物中和在受控環境中實踐。「培養基」是指用於體外(即在完整活生物之外)生長細胞的多種營養素混合物。受體細胞靶標包括但不限於分生組織細胞、愈傷組織、未成熟胚胎或胚胎部分和配子細胞例如小孢子、花粉、精子和卵細胞。可以從其再生可育植物的任何細胞用作實踐本發明的受體細胞。愈傷組織可以源自各種組織來源，包括但不限於未成熟胚胎或胚胎部分、幼苗頂端分生組織、小孢子等。像愈傷組織一樣能夠繁殖的那些細胞可以用作遺傳轉化的受體細胞。用於製備本發明轉基因植物的實際的轉化方法和材料(例如各種培養基和受體靶細胞、未成熟胚胎的轉化和隨後可育轉基因植物的再生)例如公開於通過引用特別引入的美國專利6,194,636和6,232,526和美國專利申請公布2004/0216189中。在一般的轉化實踐中，在任何一個轉化實驗中僅將DNA引入小百分比的靶細胞中。標記基因通常用於提供鑑別通過將轉基因DNA構建體接受和整合入它們的基因組中穩定轉化的那些細胞的有效系統。優選的標記基因提供賦予對選擇劑例如抗生素或除草劑的抗性的選擇性標誌。植物細胞抵抗的任何抗生素或除草劑可以是用於選擇的有用試劑。將潛在的轉化細胞暴露於選擇劑。在存活細胞群中存在其中通常整合了抗性賦予基因並以足夠水平表達以允許細胞存活的那些細胞。可以進一步測試細胞以證實重組DNA的穩定整合。通常使用的選擇性標記基因包括賦予對抗生素例如卡那黴素或巴龍黴素(nptII)、潮黴素B(aphIV)和慶大黴素(aac3和aacC4)的抗性或對除草劑例如草丁膦(bar或pat)和草甘磷(EPSPS)的抗性的那些。有用的選擇性標記基因和選擇試劑的實例闡明於美國專利5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047中，所有專利通過引用具體引入。也可使用可篩選標記或報導基因，例如提供視覺鑑別轉化體的能力的標記。有用的可篩選標記包括例如表達通過作用於顯色底物產生可檢測顏色的蛋白的基因(例如β葡糖苷酸酶(GUS)(uidA)或螢光素酶(luc))，或蛋白本身是可檢測的，例如綠色螢光蛋白(GFP)(gfp)或免疫原性分子。本領域技術人員將理解可以應用許多其他有用的標記或報導基因。檢測或測量轉基因植物細胞中重組DNA構建體的轉錄可以通過任何適合的方法實現，包括蛋白質檢測方法(例如蛋白質印跡、ELISA、和其他免疫化學方法)、測量酶活性或核酸檢測方法(例如Southern印跡、Northern印跡、PCR、RT-PCR、螢光原位雜交)。其他用於檢測或測量植物細胞中本發明的靶向昆蟲靶基因的重組多核苷酸的轉錄的適合的方法包括測量與不存在重組多核苷酸情況下觀察的表達水平相比，作為昆蟲中的靶基因表達水平的直接或代表指示的任何其他性狀，例如昆蟲的生長率、死亡率或再生率或補充率，或測量植物中或受昆蟲侵染的植物田間的損傷(例如根損傷)或產量損失。通常，用於檢測或測量植物細胞中目標重組多核苷酸的轉錄的適合的方法包括，例如總體或微觀的形態學性狀、生長率、產量、再生率或補充率、對害蟲或病原體的抗性、或對生物或非生物脅迫(例如水分不足脅迫、鹽脅迫、營養素脅迫、熱或冷脅迫)的抗性。這種方法可以使用表型性狀的直接測量或代表性分析(例如，在植物中，這些分析包括植物部分分析，例如葉或根分析以測定非生物脅迫的耐受性)。這種方法包括直接測量對無脊椎害蟲或病原體的抗性(例如對植物組織的損害)或代表性分析(例如植物產量分析、或無脊椎害蟲生物學分析例如西部玉米根蟲(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte)幼蟲的生物學分析，如通過引用特別引入的國際專利申請公布WO2005/110068A2和美國專利申請公布US2006/0021087A1中所描述；或如Steeves等(2006)Funct.PlantBiol.,33:991-999所描述的大豆孢囊線蟲病生物學分析，其中測量每棵植物的孢囊、每克根的孢囊、每棵植物的蟲卵、每克根的蟲卵和每個孢囊的蟲卵；或本文工作實施例中描述的生物學分析。本發明的重組DNA構建體可以例如通過表達或抑制其他基因來用其他重組DNA堆疊以賦予額外的性狀(例如在轉化植物情況下，性狀包括除草劑抗性、抗蟲性、冷萌芽耐受性、水分不足耐受性等)。用於協調降低和增加基因表達的構建體公開於通過引用特別引入的美國專利申請公布2004/0126845A1中。可以收穫可育轉基因植物的種子並用於生長在其基因組中包含重組DNA構建體的本發明轉基因植物的後代，包括雜合代。因此，除用本發明重組DNA構建體直接轉化植物之外，本發明的轉基因植物可以通過使具有重組DNA的第一植物與缺乏所述構建體的第二植物雜交來製備。例如，可以將重組DNA引入適合轉化的株系以生產轉基因植物，其可以與第二株系雜交以將重組DNA基因滲入由此產生的後代中。本發明的轉基因植物可以與具有賦予一種或多種額外性狀(例如但不限於除草劑抗性、害蟲或疾病抗性、環境脅迫抗性、改變的營養含量和產量提高)的其他重組DNA的株系雜交以生產具有賦予期望的靶序列表達行為和額外性狀兩者的重組DNA的後代植物。在這種組合性狀的育種中，賦予額外性狀的轉基因植物可以是雄系(授粉器)，攜帶基本性狀的轉基因植物可以是雌系。這種雜交的後代分離，使得一些植物將攜帶兩個親本性狀的DNA和一些將攜帶一個親本性狀的DNA；這種植物可以通過與親本重組DNA有關的標記來鑑別。攜帶兩個親本性狀的DNA的後代植物可以與雌性親本系回交多次，例如通常為6到8代，以生產具有與原始轉基因親本系基本上相同的基因型以及其他轉基因親本系的重組DNA的純合子後代。本發明的又一方面是由本發明轉基因種子生長的轉基因植物。本發明預期直接由包含重組DNA的轉基因種子生長的轉基因植物以及植物的後代，包括通過將直接由轉基因種子生長的轉基因植物與不由相同的轉基因種子生長的第二植物雜交製備的近交或雜合株系。雜交例如可包括以下步驟：(a)種植第一親本植物(例如非轉基因或轉基因)和根據本發明轉基因的第二親本植物的種子；(b)使第一和第二親本植物的種子生長為攜帶花的植物；(c)用來自第二親本的花粉對來自第一親本的花授粉；和(d)收穫在攜帶受精花的親本植物上產生的種子。通常期望的是將重組DNA基因例如通過回交滲入優良品種，以將特異性期望性狀從一種來源轉移入缺乏這種性狀的近交種或其他植物。這可以例如通過首先將高級近交種(「A」)(回交親本)與攜帶所討論的性狀的適當基因(例如根據本發明製備的構建體)的供體近交種(「B」)(非回交親本)雜交來實現。在生成的後代中首先選擇具有待從非回交親本「B」中轉移的期望性狀的雜交後代，然後將所選擇的後代與高級回交親本「A」回交。選擇期望性狀五代或更多代回交代之後，後代的控制待轉移特徵的基因座基本上是半合子的，但大多數或幾乎所有的其他基因類均似於高級親本。將最後的回交代自交以提供待轉移基因是純種育種的後代，即一個或多個轉化事件。通過一系列育種操作，可將所選擇的DNA構建體從一個品系移入完全不同的品系中，而無需進一步的重組操作。因此可以生產對於一個或多個DNA構建體是真正育種的近交種植物。通過雜交不同的近交種植物，可以生產大量具有DNA構建體的不同組合的不同雜交種。以這種方法，可以生產植物，其具有經常與雜交種有關的期望的農學性質(「雜交種優勢」)，以及通過一個或多個DNA構建體賦予的期望的特徵。在本發明的某些轉基因植物細胞和轉基因植物中，有時期望同時表達目的基因，同時還調節Leptinotarsa靶基因的表達。因此，在一些實施方式中，轉基因植物包含進一步包括用於表達至少一種目的基因的基因表達元件的重組DNA，且本發明重組DNA構建體的轉錄優選用基因表達元件的同時發生的轉錄實現。在一些實施方式中，本發明重組DNA構建體可以在任何植物細胞或組織或在任何發育階段的整個植物中轉錄。轉基因植物可以源自任何單子葉或雙子葉植物，例如但不限於，商業或農學目的的植物，例如作物植物(尤其是用於人食物或動物飼料的作物植物)、生產木材或紙漿的樹、蔬菜植物、水果植物和觀賞植物。目的植物的實例包括穀類作物植物(例如小麥、燕麥、大麥、玉米、黑麥、黑小麥、水稻、稷、高粱、奎藜籽、莧屬植物和蕎麥)；飼料作物植物(例如飼草和飼料雙子葉植物，包括紫花苜蓿、野豌豆、三葉草等)；油籽作物植物(例如棉花、紅花、向日葵、大豆、加拿大油菜、油菜籽、亞麻、花生和油棕)；木本堅果(例如胡桃、腰果、榛子、山核桃、杏仁等)；甘蔗、椰子、海棗、橄欖、甜菜、茶和咖啡；生產木材或紙漿的樹；蔬菜作物植物例如豆科植物(例如豆、豌豆、小扁豆、紫花苜蓿、花生)、萵苣、蘆筍、朝鮮薊、芹菜、胡蘿蔔蘿蔔、芸苔(例如捲心菜、羽衣甘藍、芥末和其他葉狀芸苔、椰菜、花椰菜、芽甘藍、蕪菁、甘藍)、食用葫蘆(例如黃瓜、甜瓜、西葫蘆、筍瓜)、食用蔥屬植物(例如洋蔥、大蒜、韭蔥、蔥、細香蔥)、食用茄科成員(例如番茄、茄子、馬鈴薯、胡椒、酸漿)和食用藜科成員(例如甜菜、君達菜、菠菜、奎藜籽、莧屬植物)；水果作物植物例如蘋果、梨、柑桔類水果(例如橙、酸橙、檸檬、葡萄柚和其他)、核果(例如杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠蘿、葡萄、奇異果、木瓜、鱷梨和漿果；為生物質或生物燃料而生長的植物(例如芒草、柳枝稷、麻風樹、油棕、真核微藻例如布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)、小球藻屬(Chlorellaspp.)和鹽藻屬(Dunaliellaspp.)和真核大藻例如江蘺屬(Gracilariaspp.)和馬尾藻屬(Sargassumspp.)；和觀賞植物，包括觀賞開花植物、觀賞樹木、裝飾地被植物和觀賞禾草。本發明還提供由本發明轉基因植物細胞、植物或種子產生的商品，包括但不限於收穫的葉、根、枝、塊莖、莖、果實、種子或植物的其他部分、膳食、油、提取物、發酵或消化產品、植物的壓碎或整粒或種子、或包括由本發明轉基因植物細胞、植物或種子產生的這種商品的任何食品或非食品產品。在本文預期的一種或多種商品或商品產品中檢測到本發明的重組DNA構建體的一個或多個核酸序列事實上是該商品或商品產品包含或源自於本發明轉基因植物細胞、植物或種子的證據。通常在其基因組中具有本發明重組DNA構建體的轉基因植物表現出對昆蟲侵擾的增加的抗性。在各種實施方式中，例如，當轉基因植物表達與賦予額外性狀的其他重組DNA堆疊的本發明重組DNA構建體時，相對於缺乏所述重組DNA構建體的植物，轉基因植物具有至少一種選自以下的額外改變的性狀：(a)改進的非生物脅迫耐受性；(b)改進的生物脅迫耐受性；(c)改變的初級代謝物組成；(d)改變的次級代謝物組成；(e)改變的微量元素、類胡蘿蔔素或維生素組成；(f)提高的產量；(g)改進的使用氮、磷酸酯或其他營養素的能力；(h)改變的農藝性狀；(i)改變的生長或再生特徵；和(j)改進的收穫、儲存或加工質量。在一些實施方式中，轉基因植物的特徵在於：改進的非生物脅迫耐受性(例如水分不足或乾旱、熱、冷、非最佳營養或鹽水平、非最佳光照水平的耐受性)或改進的生物脅迫耐受性(例如群集、植化相剋或創傷)；改變的初級代謝物(例如脂肪酸、油、胺基酸、蛋白質、糖或碳水化合物)組成；改變的次級代謝物(例如生物鹼、萜、聚酮化合物、非核糖體肽和混合的生物合成來源的次級代謝物)組成；改變的微量元素(例如鐵、鋅)、類胡蘿蔔素(例如β葉紅素、番茄紅素、葉黃素、玉米黃素或其他的類胡蘿蔔素和葉黃素)或維生素(例如生育酚)組成；提高的產量(例如在非脅迫條件下提高的產量或在生物或非生物脅迫下提高的產量)；改進的使用氮、磷酸酯或其他營養素的能力；改變的農藝性狀(例如延遲成熟；延遲衰老；早熟或晚熟；改進的耐陰性；改進的對根或莖倒伏的抗性；改進的對莖「綠色折斷」的抗性；改變的光周期反應)；改變的生長或再生特徵(例如有意的矮化；例如用於改進的雜交程序的有意的雄性不育；改進的植物生長率；改進的萌芽；改進的雄性或雌性生育力)；改進的收穫、儲存或加工質量(例如在儲存期間改進的抗蟲性、改進的抗破裂性、改進的對消費者的吸引力)；或這些性狀的任何組合。在另一個實施方式中，轉基因種子或由轉基因植物產生的種子具有改變的初級代謝物(例如脂肪酸、油、胺基酸、蛋白質、糖或碳水化合物)組成、改變的次級代謝物組成、改變的微量元素、類胡蘿蔔素或維生素組成、改進的收穫、儲存或加工質量或這些的組合。在另一個實施方式中，期望改變轉基因植物或轉基因植物的種子的天然組分的水平，例如降低過敏蛋白或糖蛋白或毒性代謝物的水平。通常，各自從轉基因植物細胞再生的轉基因植物的群體進行篩選以鑑別發育成具有期望性狀的轉基因植物的轉基因植物細胞。分析轉基因植物以檢測增強的性狀，例如增強的水使用效率、增強的耐寒性、增加的產量、增強的氮氣使用效率、增強的種子蛋白質和增強的植物油。篩選方法包括在溫室或田間試驗中直接篩選性狀或篩選代表性狀。這種分析涉及檢測植物的化學組成、生物質、生理特性或形態的變化。化學組成例如穀物的營養組成的變化通過分析種子組成和蛋白質、游離胺基酸、油、游離脂肪酸、澱粉、生育酚或其他營養素的含量來檢測。生長或生物質特性的變化通過測量株高、莖徑、節間長、根和枝幹重和(對於生產穀物的植物例如玉米、水稻或小麥)穗或種子頭長和直徑來檢測。生理特性的變化通過評價對脅迫條件的響應來鑑別，例如在作用脅迫條件例如水分不足、氮或磷酸酯不足、冷或熱的生長條件、病原體或昆蟲攻擊、光照不足或增加的植株密度下的分析。其他的選擇性質包括開花天數、花粉脫落天數、果實成熟天數、產生的果實或塊莖質量或含量、玉米抽絲天數、葉伸長率、葉綠素含量、葉溫、高度(stand)、幼苗活力、節間長、株高、葉數、葉面積、舵柄、支持根、保持綠色、莖倒伏、根倒伏、植物健康、生育力、綠色折斷和抗蟲性。此外，可以評估收穫的果實、種子或塊莖的表型特性。具體實施方式實施例1該實施例闡明了編碼用於控制昆蟲物種和用於製備本發明組合物和植物的靶基因的DNA序列的非限制性實施方式，並鑑別了可用於控制昆蟲物種的dsRNA引發劑序列。從之前沒有報告對經口遞送的RNA敏感的昆蟲物種中鑑別了之前在西部玉米根蟲中顯示對於RNAi-介導的死亡是有效靶標的同源基因。這些同源靶基因和dsRNA引發劑序列的實例提供於表1。表1*引發劑序列以5'到3'方向的dsRNA引發劑的有義鏈提供。被證實以序列特異性方式有效抑制靶基因的dsRNA引發劑序列可用於鑑別有效的RNA遞送劑和製劑。包含dsRNA引發劑的製劑的殺蟲活性可以通過各種技術來優化，例如改變製劑中的化學實體或改變製劑中化學組分的比例。遞送劑和製劑的非限制性實例提供於實施例6和8。實施例2該實施例闡明了可用於抑制或沉默昆蟲細胞中的靶基因或引起昆蟲發育障礙或死亡的dsRNA引發劑序列的非限制性實施方式和用於確認dsRNA引發劑功效或用於引起昆蟲發育障礙或死亡的方法。更具體地，該實施例闡明使用dsRNA引發劑以序列特異性降低昆蟲細胞中靶基因mRNA轉錄物水平。將培養的草地夜蛾(草地粘蟲)SF9細胞與dsRNA引發劑T34640(SEQIDNO:17，靶向V-ATPaseA亞基)、T34642(SEQIDNO:18，靶向COPIcoatomerB(beta)亞基)或T34644(SEQIDNO:19，靶向COPIcoatomerB』(beta主要)亞基)或用對照引發劑T35763(SEQIDNO:27,300bpdsRNA引發劑，靶向綠色螢光性蛋白)(參見表1)一起孵育。用商業轉染劑II(LifeTechnologies,Inc.,GrandIsland,NY14072)配製dsRNA引發劑。圖1描述了轉染實驗的結果，表明昆蟲細胞中的dsRNA引發劑引起的靶基因特異性抑制(通過Quantigene分析測量的靶基因mRNA水平降低)。對照dsRNA引發劑T35763對昆蟲靶基因mRNA水平沒有影響。用小菜蛾(菜蛾，DBM)細胞進行類似的實驗。結果顯示類似的對DBM引發劑的靶基因特異性細胞毒性響應，但對靶向綠色螢光性蛋白的非特異性引發劑沒有靶基因特異性細胞毒性響應。將培養的小菜蛾(菜蛾)PxE-PO#5A3細胞與dsRNA引發劑T42017(SEQIDNO:21，靶向V-ATPase亞基A)、T33310(SEQIDNO:29，靶向V-ATPase亞基A)、T32938(SEQIDNO:28，靶向COPIcoatomerbeta亞基)和T32937(SEQIDNO:13，靶向COPIcoatomerbeta主要亞基)或用對照引發劑T35763(SEQIDNO:27,300bpdsRNA引發劑，靶向綠色螢光性蛋白)(參見表1)一起孵育。用商業轉染劑II(LifeTechnologies,Inc.,GrandIsland,NY14072)配製dsRNA引發劑。圖2描述了轉染實驗的結果，表明昆蟲細胞中的dsRNA引發劑引起的靶基因特異性抑制(通過Quantigene分析測量的靶基因mRNA水平降低)。對照dsRNA引發劑T35763對昆蟲靶基因mRNA水平沒有影響。在該具體的實驗中，與cellfectinII或cellfectinII+T35763(SEQIDNO:27)處理相比，在所有DBM-特異性引發劑處理中觀察到mRNA水平的一些降低。T32937(SEQIDNO:13，靶向COPIcoatomerbeta主要亞基)和T32938(SEQIDNO:28，靶向COPIcoatomerbeta亞基)處理出現明顯可見的病理，其中轉染48小時後在轉染孔中發生一些細胞死亡、變圓和移動。用T42017(SEQIDNO:21)和T33310(SEQIDNO:29)處理顯示靶基因V-ATPase亞基AmRNA敲除，但在用那些引發劑轉染的細胞中沒有明顯可見的病理。實施例3該實施例闡明了可用於抑制或沉默昆蟲細胞中的靶基因或引起昆蟲發育障礙或死亡的dsRNA引發劑序列的非限制性實施方式和用於確認dsRNA引發劑功效或用於引起昆蟲發育障礙或死亡的方法。更具體地，該實施例闡明經口遞送dsRNA引發劑以引起昆蟲發育障礙或死亡。採用以人工飼料為食的Euschistusheros(新熱帶區褐臭蝽，NBSB)幼蟲的分析用於測試特異性設計為靶向Euschistusheros基因的dsRNA引發劑的功效。採用該分析，觀察到靶向E.heros泛素C基因的～500個鹼基對的dsRNA引發劑T33199在E.heros幼蟲中引起劑量依賴性發育障礙和死亡響應。基於T33199序列設計了較短(302bp)的dsRNA引發劑T44042(SEQIDNO:26)用於配製經口或局部遞送。實施例4該實施例闡明了可用於抑制或沉默昆蟲細胞中的靶基因或引起昆蟲發育障礙或死亡的dsRNA引發劑序列的非限制性實施方式和用於確認dsRNA引發劑功效或用於引起昆蟲發育障礙或死亡的方法。更具體地，該實施例闡明用於引起昆蟲發育障礙或死亡的dsRNA引發劑的實施方式，並闡明這些引發劑的系統RNAi功效。表2提供了在豆莢草盲蝽(西部無澤盲蝽)幼蟲中通過顯微注射遞送的測試dsRNA引發劑。非草盲蝽特異性引發劑T35763(SEQIDNO:27,300bpdsRNA引發劑，靶向綠色螢光性蛋白)用作對照。表2表3顯示在豆莢草盲蝽(西部無澤盲蝽)幼蟲中通過顯微注射遞送的測試dsRNA引發劑T34617(SEQIDNO:15，靶向豆莢草盲蝽V-ATPase亞基A)和34622(SEQIDNO:16，靶向豆莢草盲蝽COPIcoatomerbeta主要亞基)的死亡率結果。對照幼蟲用T35763(靶向綠色螢光性蛋白)或用去離子水顯微注射。在5天觀察期內，每天觀察到草盲蝽靶基因特異性處理組(T34617和T34622)與陰性對照處理組相比百分比死亡率增加。表3表4顯示在豆莢草盲蝽(西部無澤盲蝽)幼蟲中通過顯微注射遞送的測試dsRNA引發劑T34616(SEQIDNO:14，靶向豆莢草盲蝽核糖體蛋白rpL19)、T34622(SEQIDNO:16，靶向豆莢草盲蝽COPIcoatomerbeta主要亞基)和T42772(SEQIDNO:22，靶向豆莢草盲蝽泛素C)的死亡率結果。對照幼蟲用T35763(靶向綠色螢光性蛋白)顯微注射。在6天觀察期內，每天觀察到草盲蝽靶基因特異性處理組(T34616、T34622和T42772)與陰性對照處理組相比百分比死亡率增加。T34622的重複活性證實了在較早試驗中觀察到的該引發劑的活性(表3)。表4實施例5該實施例公開了與具有包含特定修飾例如核苷酸替換的核苷酸序列的多核苷酸分子有關的實施方式。這種修飾的實施方式包括修飾的dsRNA引發劑，其提供目標蟲害的預定靶基因和其他非靶標物種的遺傳序列之間的改進的序列識別力。表5鑑別了表1提供的靶基因序列和非靶標生物(NTO)中鑑定的序列之間的匹配的實例，其中匹配是至少19個連續核苷酸的片斷。表5進一步提供了序列修飾(例如，原始靶基因序列中指定位置處核苷酸變化)以消除與非靶標生物匹配的序列的實例。表5表6鑑別了表1提供的dsRNA引發劑序列和非靶標生物(NTO)中鑑定的序列之間的匹配的實例，其中匹配是至少19個連續核苷酸的片斷。表6進一步提供了序列修飾(例如，原始dsRNA引發劑序列中指定位置處核苷酸變化)的實例，其消除至少19個連續核苷酸與非靶標生物的具體序列匹配。表6進一步提供了修飾的引發劑序列的非限制性實施方式，其中已經對表6中記載的給定的初始引發劑序列的所有的核苷酸進行變化以消除至少19個連續核苷酸與非靶標生物的所有記載的匹配。例如，與具有SEQIDNO:15的原始dsRNA引發劑相比，具有SEQIDNO:31的修飾的dsRNA引發劑在213位具有一個核苷酸變化(A→U)；該單個變化消除了至少19個連續核苷酸與兩種非靶標生物熊蜂(Bombusimpatiens)和地熊蜂(Bombusterrestris)的匹配。在另一個實施例中，與具有SEQIDNO:20的原始dsRNA引發劑相比，具有SEQIDNO:35的修飾的dsRNA引發劑(在42、79、124和194位)具有四個核苷酸變化；這些變化消除了至少19個連續核苷酸與NTO黑脈金斑蝶(Danausplexippus)的四種匹配。在另一個實施例中，與具有SEQIDNO:20的原始dsRNA引發劑相比，具有SEQIDNO:37的修飾的dsRNA引發劑(在64、72、131和280位)具有四個核苷酸變化；這些變化消除了至少19個連續核苷酸與NTO熊蜂、地熊蜂、智人(Homosapiens)和黑脈金斑蝶的四種匹配。表6實施例6該實施例公開了與設計用於沉默或抑制目的蟲害的靶基因的多核苷酸分子例如dsRNA引發劑有關的實施方式，以及用於測定這種分子在抑制靶基因或控制蟲害中的功效的技術。該實施例公開了將可攝取組合物形式的多核苷酸例如重組RNA分子或dsRNA引發劑提供給昆蟲的方法。測定多核苷酸分子在抑制靶基因或控制害蟲草盲蝽物種的功效的一種方法是蔗糖飼養試驗。簡言之，該試驗包括將西部無澤盲蝽(豆莢草盲蝽)幼蟲與可攝取組合物形式的dsRNA引發劑接觸，然後用人工飼料維持上並監控幼蟲的情況。製備包含2毫升15％蔗糖溶液的石蠟膜小袋用於飼養實驗，其中處理小袋包含500微克/毫升(或百萬分之一，ppm)或1000微克/毫升(或百萬分之一，ppm)的dsRNA引發劑。在一些實驗中，蔗糖溶液進一步包括5毫克/毫升酵母tRNA以抑制可能的核酸酶活性。還採用包含2毫升西部無澤盲蝽(豆莢草盲蝽)人工飼料的石蠟膜小袋製備人工飼料小袋，所述人工飼料通過在表面殺菌的攪拌機中混合高壓滅菌的沸水(518毫升)和156.3克飼料F9644B(Bio-Serv,Frenchtown,NJ)來製備。在二氧化碳蒸氣下麻醉三齡豆莢草盲蝽幼蟲並分配在4盎司玻璃罐(40–75個體/處理)中。將一張紙巾添加至各罐中以吸引蜜露。各實驗進行7天。允許幼蟲在蔗糖小袋上進食72小時的周期(3天)，然後在7天觀察期的剩餘4天去除蔗糖小袋並用人工飼料小袋替換。在單個場地觀察單個處理組的所有昆蟲，在27攝氏度、60％相對溼度孵育。所有情況下，第0天(72小時蔗糖飼養階段開始)的初始死亡率是0。從實驗開始第3天(即72小時蔗糖飼養階段結束時)到7天記錄死亡率。對於基因表達研究，在72小時蔗糖飼養階段結束之後立即從各罐移除12隻活的幼蟲並立即在單獨的基質管中的乾冰上冷凍以作為RNA測量分析的樣品。進行採用上述方案的一系列飼養實驗以評估dsRNA引發劑T34616(SEQIDNO:14)、T34617(SEQIDNO:15)、T34619(SEQIDNO:45)、T34622(SEQIDNO:16)、T42772(SEQIDNO:22)、T42768(SEQIDNO:46)和T44045(SEQIDNO:26)對豆莢草盲蝽的活性。還在美國牧草盲蝽上測試dsRNA引發劑T42772(SEQIDNO:22)和T44045(SEQIDNO:26)。分析中使用對照引發劑T35763(SEQIDNO:27,300bpdsRNA引發劑，靶向綠色螢光性蛋白)。在500微克/毫升(500ppm)，與存在(表7)或不存在酵母tRNA補充(表8)的對照處理相比，對所有的草盲蝽特異性dsRNA引發劑均觀察到增強的死亡率。T34622(SEQIDNO:16)(靶向具有SEQIDNO:6的假定的COPIcoatomerbeta主要亞基基因)和T42772(SEQIDNO:22)(靶向具有SEQIDNO:7的假定的泛素C基因)始終是表現最好的引發劑。均靶向假定的泛素C基因(SEQIDNO:7)的引發劑T42772(SEQIDNO:22)和T44045(SEQIDNO:26)在西部無澤盲蝽豆莢草盲蝽中顯示類似活性(表9A)；兩種引發劑在相關的害蟲物種無澤盲蝽美國牧草盲蝽中似乎也具有活性(雖然作用較緩慢)(表9B)。三次重複實驗在豆莢草盲蝽上以1000微克/毫升(1000ppm)測試了泛素C引發劑T44045(SEQIDNO:26)和T42768(SEQIDNO:46)；結果表明，與用單獨的15％蔗糖或15％蔗糖加上1000微克/毫升(1000ppm)的對照引發劑T35763(SEQIDNO:27)的對照處理相比，泛素C引發劑處理在第3、4、5、6和7天的昆蟲死亡率顯示統計上顯著的差異(表10)。表7：昆蟲死亡率(表示為處理中總昆蟲數的百分比)，dsRNA引發劑以500ppm在5mg/mL酵母tRNA的存在下測試表8：昆蟲死亡率(表示為處理中總昆蟲數的百分比)，dsRNA引發劑以500ppm測試(無酵母tRNA)表9A：豆莢草盲蝽死亡率(表示為處理中總昆蟲數的百分比)，dsRNA引發劑以500ppm在5mg/mL酵母tRNA的存在下測試表9B：美國牧草盲蝽死亡率(表示為處理中總昆蟲數的百分比)，dsRNA引發劑以500ppm在5mg/mL酵母tRNA的存在下測試表10：豆莢草盲蝽死亡率(表示為處理中總昆蟲數的百分比)，dsRNA引發劑以1000ppm測試*sd＝平均標準差，以百分比給出通過Quantigene分析三個靶基因(COPIcoatomerbeta主要亞基、V-ATPase亞基A和COPIcoatomerbeta亞基)評估在豆莢草盲蝽中的靶基因抑制。如上所述，採用在15％蔗糖中以500或100ppm測試的dsRNA引發劑T34616(SEQIDNO:14)、T34617(SEQIDNO:15)、T34619(SEQIDNO:45)、T34622(SEQIDNO:16)、T42772(SEQIDNO:22)和T44045(SEQIDNO:26)進行蔗糖飼養試驗。在72小時蔗糖飼養階段結束之後立即將幼蟲單獨冷凍並進行Quantigene分析。將所有值根據兩個參考基因(EF1α和肌動蛋白)的表達水平標準化。結果(表11A-C)表明三個測試的靶基因的每一個被相應的dsRNA引發劑特異性抑制，這與僅用蔗糖或用對照GFP引發劑T35763(SEQIDNO:27)處理相比觀察到的增加的死亡率一致。在六個引發劑實驗中的五個觀察到與蔗糖對照相比顯著(p＝0.05)的靶基因抑制(靶基因表達降低)；在第六個引發劑實驗(1000ppm的T34622，參見表11A)中，剛好在顯著性水平下觀察到可見抑制。這些結果支持在15％蔗糖飼料試驗中觀察到的死亡率是由RNAi介導的這一結論。表11A：靶基因：豆莢草盲蝽COPIcoatomerbeta主要亞基(F38E11)，SEQIDNO:6表11B：靶基因：豆莢草盲蝽V-ATPaseA亞基(CG3762)，SEQIDNO:4表11C：靶基因：豆莢草盲蝽COPIcoatomerbeta亞基(CG6223)，SEQIDNO:43n/a＝不適用。實施例7通常將本發明多核苷酸設計為通過誘導昆蟲靶基因的調控或抑制來調節表達，並設計為具有與昆蟲靶基因或cDNA的核苷酸序列(例如SEQIDNOs:1-12和43-44)或與從昆蟲靶基因轉錄的RNA序列基本上同一或基本上互補的核苷酸序列，其可以是編碼序列或非編碼序列。這些有效的調節表達的多核苷酸分子在本文中稱為「引發劑」。該實施例描述用於設計和選擇作為調節昆蟲靶基因的表達的「引發劑」的多核苷酸的非限制性技術。通過「劃分(Tiling)」選擇多核苷酸引發劑用於本發明的多核苷酸不需要是全長的靶基因，且在許多實施方式中較之靶基因長度要短得多。用於選擇有效的引發劑的技術的實例是「劃分」，或評估對應於靶基因的相鄰或部分重疊的片斷的多核苷酸。有效的多核苷酸「引發劑」可以通過在選擇的長度片段(例如長度為200–300個核苷酸的片段，其中沿著靶基因的長度具有例如約25個核苷酸的部分重疊的區域)中「劃分」基因靶標來鑑定。為抑制單個基因，將引發劑序列設計為對應於(與其具有核苷酸同一性或互補性)靶基因獨特的區域；選擇的靶基因區域可以包括編碼序列或非編碼序列(例如啟動子區域、3'非翻譯區、內含子等)或兩者的組合。當有興趣設計有效抑制多個靶基因的靶標時，將多個靶基因序列進行比對，並設計多核苷酸引發劑來對應於在多個靶標中共有的高序列同源性的區域。相反，當有興趣設計有效地選擇性抑制多個靶序列之一的靶標時，將多個靶基因序列進行比對，並設計多核苷酸引發劑來對應於在多個靶標中沒有或共有的低序列同源性的區域。在非限制性實施例中，為表1所列每一個靶基因設計如下反義單鏈RNA引發劑。設計多個反義單鏈RNA引發劑，其中每一個長度為200–300個核苷酸且其序列對應於(即，對於反義引發劑，與其互補)具有選自SEQIDNOs:1-12和43-44的序列的靶基因的片段，使得各引發劑的序列與下一個相鄰引發劑序列的約25個核苷酸重疊，如此以致多個引發劑的組合覆蓋靶基因的全長。(有義引發劑以類似的方式設計，其中引發劑序列與靶基因片段相同。類似地，雙鏈引發劑可以通過提供有義和反義引發劑對來設計，各對引發劑與下一對相鄰的引發劑重疊)。通過任何方便的手段測試多核苷酸引發劑在沉默昆蟲靶基因中的功效。適合的測試的實例包括本文實施例中描述的生物學分析。另一個測試包括將多核苷酸引發劑直接局部施用到單個昆蟲或保護其免受昆蟲侵擾的植物表面。用本發明多核苷酸處理的一個期望的結果是預防或控制昆蟲侵擾，即通過誘導昆蟲的生理或行為的變化，例如但不限於，生長遲緩、死亡率增加、生殖能力降低、進食行為或運動降低或停止、或變形階段發育降低或停止。用本發明多核苷酸處理的另一個期望的結果是提供對於昆蟲侵擾顯示改進的抗性的植物。如果需要，劃分程序可以重複。發現提供期望活性的多核苷酸引發劑本身可以進行劃分程序。例如，設計多個重疊反義單鏈RNA引發劑，其中每個長度為50–60個核苷酸，且其序列對應於(即，對於反義引發劑，與其互補)選自SEQIDNOs:1-12和43-44的序列的靶基因的片段，發現300個核苷酸的單個多核苷酸引發劑是有效的。可以進行額外輪的劃分分析，其中測試短至18或19個核苷酸的引發劑。在本發明的各種方法中可以單獨或組合使用任何大小的有效的多核苷酸引發劑。在一些實施方式中，單個多核苷酸引發劑用於製備本發明組合物(例如用於局部施用的組合物，或用於製備轉基因植物的重組DNA構建體)。在其他實施方式中，使用不同的多核苷酸引發劑的混合物或組合；在這種情況下，多核苷酸引發劑可用於單個靶基因或用於多個靶基因。在一些實施方式中，設計多核苷酸引發劑以靶向靶基因的不同區域，即引發劑可以包括對應於靶基因的不同外顯子區域的多個片斷；和不對應於靶基因的「間隔基」核苷酸可以任選地用於片斷之間或鄰接片斷。選擇多核苷酸引發劑中的熱力學考慮可以設計多核苷酸引發劑或利用熱力學考慮優化它們的序列。例如，可以基於控制一條核酸鏈(例如多核苷酸引發劑或單個siRNA)和另一條(例如靶基因轉錄物)之間的雜交的熱力學來選擇多核苷酸引發劑。用於預期在靶基因的RNAi-介導的沉默中可能有效的核苷酸序列的方法和算法是本領域已知的。這種方法和算法的非限制性實例包括Ichihara等(2007)NucleicAcidsRes.,35(18):123e描述的「i-得分」；可在rna.urmc.rochester.edu/servers/oligowalk上公開地獲得並由Lu等(2008)NucleicAcidsRes.,36:W104-108描述「Oligowalk」；和Khovorova等(2004)NatureBiotechnol.,22:326-330描述的「Reynolds得分」。允許的錯配「基本上同一」或「基本上互補」是指引發劑多核苷酸(或雙鏈多核苷酸的至少一條鏈)與靶基因或由靶基因轉錄的RNA(例如轉錄物)具有足夠的同一性或互補性以抑制靶基因的表達(例如，引起靶基因轉錄物和/或編碼蛋白的水平或活性降低)。本發明的多核苷酸不需要與靶基因或由靶基因轉錄的RNA具有100％同一性以抑制靶基因的表達(例如，引起靶基因轉錄物或編碼蛋白的水平或活性降低，或提供昆蟲物種的控制)。在一些實施方式中，多核苷酸或其部分設計為與靶基因或由靶基因轉錄的RNA中的至少18或19個連續核苷酸的序列基本上同一或互補。在一些實施方式中，當與內源性靶基因或由靶基因轉錄的RNA中的18個或更多個連續核苷酸的序列相比時，「基本上同一」的多核苷酸具有100％序列同一性或至少約83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列同一性。在某些實施方式中，當與靶基因或由靶基因轉錄的RNA中的18個或更多個連續核苷酸的序列相比時，「基本上互補」的多核苷酸具有100％序列互補性或至少約83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列互補性。包含與靶基因或轉錄物的錯配的多核苷酸可用於本發明組合物和方法的某些實施方式中。在一些實施方式中，多核苷酸包括與靶基因或靶基因轉錄物的等效長度的片斷基本上同一或基本上互補的至少18或至少19個連續的核苷酸。在某些實施方式中，與靶基因或靶基因轉錄物的等效長度的片斷基本上同一或基本上互補的19個連續核苷酸的多核苷酸可以具有與靶基因或轉錄物的1個或2個錯配(即多核苷酸的19個連續核苷酸和靶基因或靶基因轉錄物的等效長度的片斷之間的1個或2個錯配)。在某些實施方式中，包含與靶基因或靶基因轉錄物的等效長度的片斷同一或互補的連續的19個核苷酸跨度的20個或更多個核苷酸的多核苷酸可以具有與靶基因或轉錄物的1或2個錯配。在某些實施方式中，與靶基因或靶基因轉錄物的等效長度的片斷基本上同一或基本上互補的21個連續核苷酸的多核苷酸可以具有與靶基因或轉錄物的1、2或3個錯配。在某些實施方式中，包含與靶基因或靶基因轉錄物的等效長度的片斷同一或互補的連續的21個核苷酸跨度的22個或更多個核苷酸的多核苷酸可以具有與靶基因或轉錄物的1、2或3個錯配。在設計與內源性靶基因或由靶基因轉錄的RNA具有錯配的多核苷酸時，可以使用更可能被耐受的某些類型和某些位置的錯配。在某些示例性的實施方式中，使用腺嘌呤和胞嘧啶或鳥嘌呤核苷和尿嘧啶殘基之間的錯配，如Duetal.(2005)NucleicAcidsRes.,33:1671-1677所描述。在一些實施方式中，19個鹼基對重疊區中的錯配位於低耐受性5、7、8或11位(從19個核苷酸靶標的5'端)、位於中等耐受性3、4和12-17位(從19個核苷酸靶標的5'端)、和/或在互補性區域的任一端的高耐受性位置，即1、2、18和19位(從19個核苷酸靶標的5'端)，如Duetal.(2005)NucleicAcidsRes.,33:1671-1677所描述。耐受的錯配可以在常規試驗例如本文實施例中描述的那些中憑經驗測定。在一些實施方式中，由於穩定性原因或為了在克隆或合成中方便，多核苷酸包括額外的核苷酸。在一個實施方式中，多核苷酸是包括RNA鏈的dsRNA，所述RNA鏈具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的至少21個連續核苷酸的片斷，並進一步包括鄰接片斷的額外的5'G或額外的3』C或兩者。在另一個實施方式中，多核苷酸是包括額外的核苷酸以形成懸垂的雙鏈RNA，例如包括2個脫氧核糖核苷酸以形成3'懸垂的dsRNA。將活性引發劑埋入中性序列在實施方式中，將生物活性引發劑(即具有對應於靶基因的序列的多核苷酸且其引起靶基因中觀察到的抑制)埋入「中性」序列，即插入與靶基因不具有同一性或互補性的額外的核苷酸中。中性序列可以是期望的，例如增加多核苷酸的整體長度。例如，為穩定性、製造成本有效或生物活性的理由，可以期望多核苷酸是特定大小。已經報導，在另一種鞘翅類昆蟲物種玉米根蟲(Diabroticavirgifera)中，大於或等於約60個鹼基對(bp)的dsRNA是人工飼料生物學分析中的生物活性所需要的；參見Bolognesi等(2012)PLoSONE7(10):e47534.doi:10.1371/journal.pone.0047534。因此，在一個實施方式中，將對應於表1中的靶基因且發現提供昆蟲侵擾控制的21個鹼基對的dsRNA引發劑埋入額外的39個鹼基對的中性序列中，由此形成約60個鹼基對的多核苷酸。在另一個實施方式中，發現當埋入較大部分的中性序列時(即總多核苷酸長度為約60到約300個鹼基對)，單個21個鹼基對的引發劑是有效的。在另一個實施方式中，將選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的至少21個連續核苷酸的至少一個片斷埋入較大部分的中性序列以提供有效的引發劑。另一個實施方式中，將來自選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的多個序列的片斷埋入較大部分的中性序列以提供有效的引發劑。與由單獨的重組RNA或單獨的非多核苷酸殺蟲劑得到的效果相比，預期本發明的某些重組RNA(例如具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的dsRNA引發劑，或這些引發劑的活性片段)和一種或多種非多核苷酸殺蟲劑的組合將導致預防或控制昆蟲侵擾的協同改進。常規的昆蟲生物學分析例如本文的工作實施例中描述的生物學分析可利用本發明多核苷酸和一種或多種非多核苷酸殺蟲劑(例如馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇芸金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發光桿菌屬殺蟲蛋白、側孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白)的組合來定義幼蟲死亡率或生長抑制的劑量響應。本領域技術人員可以在常規的生物學分析中測試多核苷酸和非多核苷酸殺蟲劑的組合以鑑別具有協同作用和期望用於保護植物免受昆蟲侵擾的生物活性物質的組合。實施例8該實施例闡明將本發明多核苷酸用於局部施用的組合物中以預防或控制昆蟲侵擾的非限制性實施方式。包含本發明一種或多種多核苷酸的組合物可用作其中期望預防或控制Leptinotarsa物種侵擾的植物、動物或環境的局部處理。在實施方式中，將有效量的具有選自SEQIDNOs:1-12和43-44的序列的靶基因(即如之前的實施例所描述的表1中鑑定的靶基因)的多核苷酸引發劑引入設計為直接(例如通過接觸或攝取)向昆蟲物種、或其中期望預防或控制昆蟲侵擾的植物或環境提供的組合物中。在實施方式中，將有效量的具有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的靶基因的多核苷酸引發劑引入這種組合物中。在實施方式中，將有效量的含有選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的鏈的dsRNA引發劑或這些引發劑的活性片段引入這種組合物中。這種組合物根據現有技術配製和製備，並可以為任何方便的形式，例如溶液或溶液混合物、乳劑、懸浮液、可分散粉末、固體或液體誘餌、種子包衣或土壤澆灌。這種組合物的實施方式包括其中將本發明多核苷酸提供於活的或死的微生物例如細菌或真菌或酵母細胞中，或作為微生物發酵產品提供，或提供於活的或死的植物細胞中，或作為合成的重組多核苷酸提供的那些。在實施方式中，組合物包括包含本發明多核苷酸的微生物的非致病性菌株；攝取或攝入微生物導致蟲害的發育障礙或死亡；適合的微生物的非限制性實例包括大腸桿菌、蘇雲金芽胞桿菌(B.thuringiensis)、假單胞細菌屬、發光桿菌屬(Photorhabdussp.)、致病桿菌屬、嗜蟲沙雷氏菌(Serratiaentomophila)或和相關沙雷氏菌屬、球形芽孢桿菌(B.sphaericus)、蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)、側孢芽孢桿菌(B.laterosporus)、日本甲蟲芽孢桿菌(B.popilliae)、雙酶梭菌和其他梭菌種，或其他形成孢子的革蘭氏陽性細菌。在實施方式中，組合物包括包含本發明多核苷酸的植物病毒載體；通過用植物病毒載體處理的植物上的昆蟲進食導致昆蟲的發育障礙或死亡。在實施方式中，組合物包括包含本發明多核苷酸的杆狀病毒載體；攝取或攝入載體導致昆蟲的發育障礙或死亡。在實施方式中，將本發明多核苷酸包封於合成基質例如聚合物中或附著於微粒並局部施用於植物表面；通過被局部處理的植物上的昆蟲進食導致昆蟲的發育障礙或死亡。在實施方式中，將本發明多核苷酸以表達多核苷酸的植物細胞形式(例如本發明轉基因植物細胞)提供；通過昆蟲攝取植物細胞或植物細胞內容物導致昆蟲的發育障礙或死亡。組合物的實施方式任選包括有效葉狀覆蓋所需的適當的粘著劑和溼潤劑以及保護多核苷酸例如dsRNA免受UV損傷的UV保護劑。這種添加劑通常用於生物殺蟲劑工業並且是本領域技術人員已知的。向土壤施用的組合物可以包括作為昆蟲幼蟲的誘餌的顆粒製劑。實施方式包括載體試劑、表面活性劑、有機矽酮、多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸殺蟲劑、安全劑、誘蟲劑和昆蟲生長調節劑。在實施方式中，所述組合物進一步包括至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇芸金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發光桿菌屬殺蟲蛋白、側孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑。這種組合物以任何方便的方式施用，例如，通過直接向昆蟲噴霧或撒粉，或向其中期望預防或控制昆蟲侵擾的植物或環境噴霧或撒粉，或通過向植物表面施用塗層，或通過向為種子的種植準備的種子(或種用馬鈴薯)施用塗層，或通過在期望預防或控制昆蟲侵擾的植物的根周圍施用土壤澆灌。本發明多核苷酸的有效量是足以提供昆蟲控制或足以預防昆蟲侵擾的量；本發明多核苷酸的有效量使用常規試驗例如本文工作實施例中描述的那些來測定。儘管用於本文提供的方法和組合物的本發明多核苷酸的濃度和劑量不存在上限，較低有效濃度和劑量將是效率和經濟所常規尋求的。多核苷酸的有效量的非限制性實施方式包括噴霧在植物上的液體形式的約10毫微克每毫升到約100微克每毫升的多核苷酸，或向植物田間施用的約10毫克每英畝到約100克每英畝的多核苷酸，或用於飼養昆蟲的人工飼料中約0.001到約0.1微克每毫升的多核苷酸。當向植物局部施用本發明組合物時，可以考慮向植物葉片或其他的植物部分表面例如花朵花瓣、莖、塊莖、果實、花葯、花粉、葉、根或種子施用的噴霧或處理的體積來調節濃度。在一個實施方式中，使用本發明25聚體多核苷酸的草本植物的有用的處理是約1納摩爾(nmol)的多核苷酸/植物，例如約0.05-1nmol多核苷酸/植物。其他用於草本植物的實施方式包括約0.05-約100nmol、或約0.1-約20nmol、或約1nmol-約10nmol的多核苷酸/植物的有用範圍。在某些實施方式中，施用約40-約50nmol的本發明ssDNA多核苷酸。在某些實施方式中，施用約0.5nmol-約2nmol的本發明dsRNA。在某些實施方式中，施用包含約0.5-約2.0毫克每毫升、或約0.14毫克每毫升的本發明dsRNA或ssDNA(21聚體)的組合物。在某些實施方式中，施用約0.5-約1.5毫克每毫升的約50-約200或更多個核苷酸的本發明dsRNA多核苷酸的組合物。在某些實施方式中，向植物施用約1nmol-約5nmol的本發明dsRNA。在某些實施方式中，向植物局部施用的多核苷酸組合物包含至少一種濃度為約0.01-約10毫克每毫升、或約0.05-約2毫克每毫升、或約0.1-約2毫克每毫升的本發明多核苷酸。非常大的植物、樹或藤本植物可能需要相應地較大量的多核苷酸。當使用可以加工成多個寡核苷酸(例如本發明單個重組DNA分子編碼的多個引發劑)的本發明的長dsRNA分子時，可以使用較低濃度。有效的多核苷酸處理方案的非限制性實例包括約0.1-約1nmol的多核苷酸分子/植物、或約1nmol-約10nmol的多核苷酸分子/植物、或約10nmol-約100nmol的多核苷酸分子/植物的處理。本發明組合物的實施方式包括「轉移劑」，即當與向生物表面局部施用的包括本發明多核苷酸的組合物結合時，能夠使多核苷酸進入該生物的細胞的試劑。這種轉移劑可以作為包括本發明多核苷酸的組合物的一部分，或可以在施用包括本發明多核苷酸的組合物之前、同時或之後施用。在實施方式中，轉移劑是促進昆蟲對本發明多核苷酸的吸收的試劑。在實施方式中，轉移劑是調節植物組織例如種子、葉、莖、根、花或果實的表面以使本發明多核苷酸滲透進入植物細胞的試劑。在實施方式中，轉移劑為本發明多核苷酸穿過角質層蠟質屏障、氣孔和/或細胞壁或膜屏障進入植物細胞提供了一條途徑。適合的轉移劑包括增加生物外部對本發明多核苷酸的滲透性或增加生物細胞對本發明多核苷酸的滲透性的試劑。適合的轉移劑包括化學試劑、或物理試劑、或其組合。用於調節或轉移的化學試劑包括(a)表面活性劑、(b)有機溶劑或水性溶液或有機溶劑的水性混合物、(c)氧化劑、(d)酸、(e)鹼、(f)油、(g)酶，或其組合。在實施方式中，施用本發明組合物和轉移劑可以任選地包括孵育步驟、中和步驟(例如，中和酸、鹼或氧化劑，或者使酶失活)、衝洗步驟或其組合。適合的轉移劑可以是乳劑、反相乳劑、脂質體或其它類膠束組合物的形式，或可以引起多核苷酸組合物為乳劑、反相乳劑、脂質體或其它類膠束組合物的形式。轉移劑的實施方式包括平衡離子或已知與核酸分子有關的其它分子，例如無機銨離子、烷基銨離子、鋰離子、多胺(諸如精胺、亞精胺或腐胺)及其它陽離子。轉移劑的實施方式包括有機溶劑，例如DMSO、DMF、吡啶、N-吡咯烷、六甲基磷醯胺、乙腈、二噁烷、聚丙二醇，或與水可混溶或將磷酸核苷酸溶解於非水系統(諸如用於合成反應中)中的其它溶劑。轉移劑的實施方式包括含或不含表面活性劑或乳化劑的天然來源或合成的油，例如植物來源的油、作物油(諸如第9版CompendiumofHerbicideAdjuvants中所列的那些，在網絡的herbicide.adjuvants.com上公開可用)、石蠟油、多元醇脂肪酸酯，或具有用醯胺或多胺(諸如聚乙烯亞胺或N-吡咯烷)修飾的短鏈分子的油。轉移劑的實施方式包括有機矽酮製劑。例如，適合的轉移劑是以SILWET牌表面活性劑可商購的有機矽酮製劑，該表面活性劑具有CAS編號27306-78-1和EPA編號：CAL.REG.NO.5905-50073-AA，並且目前可從MomentivePerformanceMaterials，Albany,NewYork獲得。在使用SILWET牌表面活性劑有機矽酮製劑作為植物葉或其它植物表面的噴霧處理形式的轉移劑(與包括本發明多核苷酸的組合物之前、同時或之後施用)的實施方案中，新鮮製備的以重量計為約0.015到約2％(wt％)範圍內(例如約0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt％)的濃度可有效準備葉或其它植物表面以使本發明的多核苷酸通過局部施用於該表面轉移到植物細胞中。一個實施方式包括包含本發明多核苷酸和包括以重量計為約0.015到約2％(wt％)範圍內(例如約0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt％)的有機矽酮製劑(例如SilwetL-77)轉移劑的組合物。一個實施方式包括包含本發明多核苷酸和包括以重量計為約0.3到約1％(wt％)或約0.5到約1％(wt％)範圍內的SILWET牌表面活性劑的轉移劑的組合物。在本發明中用作轉移劑的有機矽酮化合物包括但不限於，包括以下的化合物：(a)共價連接的三矽氧烷頭基；(b)共價連接的烷基連接基，包括但不限於，正丙基連接基；(c)共價連接的聚二醇鏈；(d)端基。這種有機矽酮化合物的三矽氧烷頭基包括但不限於，七甲基三矽氧烷。烷基連接基可以包括但不限於，正丙基連接基。聚二醇鏈包括但不限於，聚乙二醇或聚丙二醇。聚二醇鏈可以包含一種提供平均鏈長度「n」為約「7.5」的混合物。在某些實施方案中，平均鏈長度「n」可以在約5到約14間變化。端基可以包括但不限於，烷基，諸如甲基。在本發明中用作轉移劑的有機矽酮化合物包括但不限於，三矽氧烷乙氧化物表面活性劑或聚環氧烷改性的七甲基三矽氧烷。用於本發明的轉移劑的實例是化合物I：(化合物I：聚環氧烷七甲基三矽氧烷，平均n＝7.5)。在本發明中用作轉移劑的有機矽酮化合物例如以新鮮製備的以重量計為約0.015到約2％(wt％)範圍內(例如約0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt％)的濃度使用。轉移劑的實施方式包括一種或多種鹽，例如氯化銨、四丁基溴化磷和硫酸銨，與包括本發明多核苷酸的組合物一起提供或使用。在實施方式中，氯化銨、四丁基溴化磷和/或硫酸銨以約0.5％到約5％(w/v)、或約1％到約3％(w/v)、或約2％(w/v)的濃度使用。在某些實施方式中，包括本發明多核苷酸的組合物包括濃度大於或等於300毫摩爾的銨鹽。在某些實施方式中，包括本發明多核苷酸的組合物包括濃度為約0.015-約2wt％(wt％)的有機矽酮轉移劑以及濃度為約80-約1200mM或約150mM-約600mM的硫酸銨。轉移劑的實施方式包括磷酸鹽。用於包括本發明多核苷酸的組合物的磷酸鹽包括但不限於，磷酸鈣、鎂、鉀或鈉鹽。在某些實施方式中，包括本發明多核苷酸的組合物包括濃度為至少約5毫摩爾、至少約10毫摩爾、或至少約20毫摩爾的磷酸鹽。在某些實施方式中，包括本發明多核苷酸的組合物包括約1mM-約25mM或約5mM-約25mM的磷酸鹽。在某些實施方式中，包括本發明多核苷酸的組合物包括濃度為至少約5毫摩爾、至少約10毫摩爾、或至少約20毫摩爾的磷酸鈉。在某些實施方式中，包括本發明多核苷酸的組合物包括濃度為約5毫摩爾、約10毫摩爾、或約20毫摩爾的磷酸鈉。在某些實施方式中，包括本發明多核苷酸的組合物包括約1mM-約25mM或約5mM-約25mM的磷酸鈉。在某些實施方式中，包括本發明多核苷酸的組合物包括約10mM-約160mM或約20mM-約40mM的磷酸鈉。在某些實施方式中，包括本發明多核苷酸的組合物包括pH為約6.8的磷酸鈉緩衝液。轉移劑的實施方式包括表面活性劑和/或其中所包含的有效分子。表面活性劑和/或其中所包含的有效分子包括但不限於脂肪酸的鈉或鋰鹽(例如牛脂或牛脂胺或磷脂)和有機矽酮表面活性劑。在某些實施方式中，包括本發明多核苷酸的組合物用平衡離子或已知與核酸分子結合的其它分子來配製。非限制性實例包括四烷基銨離子、三烷基銨離子、鋶離子、鋰離子和多胺例如精胺、亞精胺或腐胺。在某些實施方式中，包括本發明多核苷酸的組合物用非多核苷酸除草劑例如草甘磷、植物生長素樣苯甲酸除草劑包括麥草畏、草滅平、和TBA、草丁膦、植物生長素樣除草劑包括苯氧基羧酸除草劑、吡啶羧酸除草劑、喹啉羧酸除草劑、嘧啶羧酸除草劑和草除靈乙基除草劑、磺醯脲、咪唑啉酮、茅草枯(delapon)、環己二酮(cyclohezanedione)、原卟啉原氧化酶抑制劑、和4-羥苯基-丙酮酸鹽雙加氧酶抑制除草劑配製。在某些實施方式中，包括本發明多核苷酸的組合物用非多核苷酸殺蟲劑例如馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇芸金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發光桿菌屬殺蟲蛋白、側孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白配製。本文公開並要求保護的所有材料和方法可以通過以上公開按照指示無需過度實驗製備和使用。雖然已經根據優選的實施方式和說明性的實施例描述了本發明的材料和方法，對本領域技術人員顯而易見的是，在不離開本發明概念、精神和範圍的情況下本文描述的材料和方法可以加以變化。對本領域技術人員顯而易見的所有這種類似的替代和修改被認為在如附加的權利要求所定義的本發明精神、範圍和概念內。SEQUENCELISTINGMonsantoTechnologyLLCBaum,JamesA.Eads,BrianD.Kroemer,JeremyA.Taylor,ChristinaMarie用於控制蟲害的組合物和方法40-21(70001)0000/WOUS61/973,4842014-04-0149PatentInversion3.511125DNA草地夜蛾1ggtgacatggccaccatccaggtatacgaagaaacatcaggtgtaactgtaggtgacccc60gtgctgcgtaccggcaagcccctgtccgtagagctgggtcctggtatcctcggctccatc120tttgacggtatccagcggccactgaaggacatcaacgagctcacacagtccatctacatc180cccaagggtgtcaacgtaccctgccttggacgtgatgtcacctgggaattcaaccccttg240aatgttaaggtcggctcccacatcaccggaggagacttgtacggtatcgtacacgagaac300acattggttaagcataagatgttgatcccacccaaggccaagggtaccgtcacctacatc360gcgccctccggcaactacaaagtcactgacgtagtgttggagacggagttcgacggcgag420aaggagaagtacaccatgttgcaagtatggccggtgcgccagccccgccccgtcactgag480aagctgcccgccaaccaccccctgctcaccggacagagagtgctcgactctctcttccct540tgtgtccagggtggtaccacggccatccccggcgccttcggttgtggcaagactgtcgtc600tcacaggctctgtccaagtactccaactctgacgtcatcatctacgtcggatgcggtgaa660cgtggtaacgagatgtctgaggtactgcgtgacctccccgagctgacggtggagatcgag720ggcatgaccgagtccatcatgaagcgtaccgcgctcgtcgccaacacctccaacatgcct780gtagccgcccgagaggcttccatctacaccggtatcaccctctccgagtacttccgtgat840atgggttacaacgtgtccatgatggctgactccacctctcgttgggccgaagctcttcgt900gagatctcaggtcgtctggctgagatgcctgccgactccggttaccccgcctacctggga960gcccgtctggcctccttctacgagcgtgccggacgtgtgaagtgcctgggtaaccccgac1020agggagggctccgtgtccatcgtgggcgccgtgtcgccgcccggaggtgacttctccgac1080cccgtgacggccgccacgctgggtatcgtgcaggtgttctggggt112522724DNA草地夜蛾2aactatgaaacacattcgcagatcaagagattcgaggtatgcgacctaccggtgcgcgcc60gctaagttcgtgcctcgcaagaactgggtgattactggctccgatgacatgcagattcgc120gtgttcaactacaacacgcttgagagagtgcacgcctttgaggcgcattctgactacgtc180aggtgcatcgcgatacatcccacacagccatacatcctcaccagcagcgatgacctattg240atcaagctgtggaactgggaacgcaactgggcatgccagcaagtgttcgagggccacaca300cattatgtgatgcagatcgtcatcaaccctaaagacaacaacacattcgctagtgctagt360ctcgacaccaccgtcaaagtatggcagcttggctcttcaatttccaacttcacattagaa420ggccacgagaaaggcgtgaactgcgtcgactactaccacggcggcgacaagccttacctc480ataagtggtgccgacgatcgcctcgtcaaaatatgggactaccagaataaaacatgtgtc540cagacattggagagtcacacgcagaatgtgacagccgtgtcgttccacccggagctgccg600atcctgatgactggctcagaggacggcaccatcagaatatggcacgcaggcacttacaga660cttgaatcctcgctcaactatggcttcgagagagtctggaccatttcctccatgcacggc720tctaacaacgtagctattggttacgacgagggcacgatcatgatcaaggtgggccgcgaa780gagccggccatttccatggacgtcaatggaggcaagattatttgggcgaagcattctgag840atgcagcaagtcaacctgaaggcgttgccagaaggcacagagataaaagatggagagcgg900gttccagttatggcgaaggacatgggatcctgtgagatttatccacaaactatagcacac960aacccgaacggtcggttcgtggtagtgtgcggggacggcgagtacattatttacacggcc1020atggcacttaggaacaaggcgttcggcactgcacaggagttcgtctgggcgtttgatagc1080tcagagtatgcgacacttgagaactccagcaccatcaaggtgttcaagaacttcaaagag1140agaaagagtttcaagcctgagtatggtgctgaaggaatatacggcggtttcatgttgggc1200gtgaagtccatcagcggtgtggcgttctccttctatgattgggagaacttggagttgatc1260agacggattgagatccagccgcggcacgtgtactggtcggagagcggcaacctggtgtgc1320ctggcggctgatgactcgtactacgtgctcaagtataatgcagctgttgtgacgcgagct1380cgcgaaaccaactccaacatcacagaagacggcatcgaagacgcttttgaggtcgtgggt1440gcagtgaacgaggtggtaaagacaggactatgggtgggcgactgcttcatctacacgaat1500tccttgaacagaataaactactacgtcggcggagagatcgtcaccatatcccacctggac1560cacaccatgtacatcctcggatacgtcgctaaggagaacagactgtacctaaatgacaag1620gagttgaacatagtgtcgtactcgctgctgctgtcggtactggagtaccagacggcggtg1680atgcgcgcagacttcgagacagcagaccgggtgctccccaccataccgcaagagcatcgc1740accagagtcgctcacttcctagagaaacaaggcttcaaacaacaagctctagcagtctct1800acggagcctgaacaccagttcgagctggctctctcactgggagaacttagaagagcaaag1860cagttggccgaggaggcggcattggccgagggttccacctcccgatcctcagcggcacgg1920tggtctcggctgggagcggccgccgccgccgctgcagacacggaactcaccaaggcctgc1980tatcagagcgctaaggactacagtgccctccttctattcgcagctagtactggtgacaaa2040gaactgttgaagagtgtagcacagatgtcctcggaggaaaacgcggagaatatctcattc2100gtggcctactttatgctgaatgatctcgaatcctgtctgaagctgctcatacagcgggac2160aagctgcctgaagccgccttctttgccagatcatacattccatcgaaaatgtcggaagtg2220gtgaagttatggcgcgagtccaccagcgccaccaacacgaagctcggccagtcgctcgcc2280gacccggagcagtatgagaatttgttccccgagtttgcgcaatcattggagttggagaga2340tttcagcgcgagtatgggtacgagcagagttgcttgctagcgaacttgccggtcgactcg2400aagacttgcaaccttgagcgtaaccttgccaccgagaaggaggaggccgagcaacgcggc2460tttaagctgagctccgctgcagtggcgcggtctcctgcacacagctcaaatgatcttggt2520cctgacgaccgagtcacaaacaatgatagtccttcccacccggtgccggagagcacggtg2580gcgaccgcggcgcagcaggatctgaagaaacggcgcgactctctcgacatcatggaggaa2640ctggagcgcgagatcgaagacatcgtcctggacggcacggtcgagagcgtggatctgtcg2700gacgatgtagatttcatggactaa272432838DNA草地夜蛾3atgtgtataagagacagctatactctgatcaacttcccgactgattcagagccttacaat60gagatgcagctcaagctggatcttgagaaaggygacacaaagaagaaaatagaagcatta120aagaaggtaataggtatyatcytktctggkgagaagatwccyggtctattgatgatcatc180atccgattygtgctgcccctgcaagaccacaccatcaagaagctgttgctkatcttctgg240gaaatagtgccaaagaccactcctgatggcaagctcatgcaggagatgatccttgtctgt300gatgcttacagaaaggatctgcaacaccccaatgagttcatccgtggctccaccctgcgc360ttcctctgtaaactgaaggagcctgaactcctcgagcctttgatgcccgccatcagagct420tgtcttgaccaccgccactcatatgtcaggaggaatgctgttcttgccatatttactatc480tacaggaactttgaattcctgatccctgatgctccagagctagtagcaaacttcttggag540acagagcaggacatgtcctgcaagaggaatgcatttcttatgctgctccatgctgaccag600gagcgggcactgtcctacctctcatccaggctggataatgtacagggctttggagatatc660cttcagttggttattgtagaacttatttacaaggtttgccacgcgaatccatcagagagg720tctcgtttcatccgtacagtatacggcttactgaacgcgaccagtgccgccgtgcggtac780gaggctgccggtactctcgttacactgtctaacgcg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％到約100％同一性或互補性；(ii)豆莢草盲蝽(西部無澤盲蝽)和所述重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:14-16、22、26、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補性；(iii)Euschistusheros(新熱帶區褐臭蝽)和所述重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:23-25的序列具有約95％到約100％同一性或互補性；或(iv)小菜蛾(菜蛾)和所述重組RNA分子包括至少一條RNA鏈，所述RNA鏈的序列與選自SEQIDNOs:13、20-21和28-29的序列具有約95％到約100％同一性或互補性；或(d)所述昆蟲是：(i)草地夜蛾(草地粘蟲)和所述重組RNA分子是包含具有選自SEQIDNOs:17-19的序列的RNA鏈的dsRNA；(ii)豆莢草盲蝽(西部無澤盲蝽)和重組RNA分子是包括具有選自SEQIDNOs:14-16、22、26、45和46的序列的RNA鏈的dsRNA；(iii)Euschistusheros(新熱帶區褐臭蝽)和重組RNA分子是包括具有選自SEQIDNOs:23-25的序列的RNA鏈的dsRNA；或(iv)小菜蛾(菜蛾)和重組RNA分子是包括具有選自SEQIDNOs:13、20-21和28-29的序列的RNA鏈的dsRNA。8.權利要求5的殺蟲組合物，其中所述組合物：(a)進一步包含一種或多種選自載體試劑、表面活性劑、有機矽酮化合物、多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸除草劑分子、非多核苷酸殺蟲劑、安全劑、誘蟲劑和昆蟲生長調節劑的組分；(b)進一步包含至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇芸金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發光桿菌屬殺蟲蛋白、側孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑；或(c)為選自固體、液體、粉末、懸浮液、乳劑、噴霧、包封劑、微珠、載體微粒、薄膜、基質或種子處理的形式。9.用權利要求5的殺蟲組合物處理的植物或所述植物的種子，其中所述植物對所述昆蟲表現出改進的抗性。10.一種提供對昆蟲抗性改進的植物的方法，包括在植物中表達含有編碼RNA的DNA的重組DNA構建體，所述RNA包括至少一個與所述昆蟲的靶基因序列的片段基本上同一或基本上互補的沉默元件，其中所述靶基因序列選自SEQIDNOs:1-12和43-44，和其中通過所述昆蟲攝取所述RNA導致所述昆蟲的死亡或發育障礙。11.權利要求10的方法，其中所述沉默元件的序列與選自SEQIDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有約95％到約100％同一性或互補性。12.權利要求10的方法，其中所述重組DNA構建體進一步包含與編碼包括至少一個沉默元件的RNA的所述DNA可操作地連接的異源啟動子，其中所述異源啟動子在植物細胞中具有功能。13.權利要求10的方法，其中通過農桿菌介導的轉化或通過引入重組植物病毒載體或重組杆狀病毒載體將所述重組DNA構建體提供給植物。14.權利要求10的方法，其中所述表達藉助於轉基因表達或瞬時表達。15.權利要求10的方法，進一步包含在所述植物中表達至少一種選自馬鈴薯糖蛋白、植物血凝素、植物蛻皮甾體、蘇芸金桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌屬殺蟲蛋白、發光桿菌屬殺蟲蛋白、側孢性桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白的殺蟲劑。16.由權利要求10的方法提供的對昆蟲的抗性改進的植物、或植物的果實、種子或可繁殖部分。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp