一種Bt蛋白Cry62Aa1、其編碼基因及應用的製作方法
2024-02-26 14:17:15
專利名稱：一種Bt蛋白Cry62Aa1、其編碼基因及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種新的Bt蛋白及其編碼基因和應用。
背景技術：
蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性好氧細菌，它在形成芽孢的過程中，會在菌體的一端或兩端形成一個或多個獨特的伴胞晶體蛋白， 這是唯一能區分兩個分類學上的近緣物種B. thuringiensis和B. cereus的特徵。不同菌株晶體蛋白的形狀、大小和組分均各不相同，並且常常存在特異的殺蟲活性，故稱為殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal protein, ICP)。這種蛋白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等多種昆蟲，以及線蟲、蟎類和原生動物等都具有特異的殺蟲活性(Faust RM. , et al. 1983. Plasmid,9 :98-103.)，而對哺乳動物沒有任何有害作用，廣泛應用於衛生與農業害蟲的防治(Schn印f HE，et al. 1998. Microbiol Mol Biol Rev，62 :775-806)。Bt 的殺蟲晶體蛋白主要包含兩個結構上無任何相關性的蛋白家族Cry蛋白和Cyt蛋白，前者對特異的昆蟲有毒性，而後者對無脊椎動物和脊椎動物細胞具有廣泛的溶細胞活性，包括昆蟲和哺乳動物紅細胞。目前，Cry蛋白現在已被劃分為69個不同類型Cryl_Cry69，而Cyt僅有三個類型 Cytl、Cyt2禾口Cyt3(http://www. biols. susx. ac. uk/Home/Neil-Crickmore/Bt)(Crickmore N, Zeigler DR, Feitelson J. 1998. Microbiol Mol Biol Rev，62 :807-813.)。至今人們已從世界各地的昆蟲、土壤和植物體表等樣本中分離到數萬株Bt菌株， 但其中絕大部分Bt菌株沒有殺蟲活性，因此這些菌株一直不受重視，它們的生物學特徵也很少被研究過。直到1999年，日本學者Mizuki才對這類能產生晶體蛋白，而沒有殺蟲活性的 Bt 菌進行深入研究(Mizuki E.et al. 1999. J Appl Microbiol，86 :477-486)。他發現 Bt菌株A1190所產生的SlkDa伴孢晶體蛋白經蛋白酶處理激活後對體外培養的人癌細胞 (人白血病T細胞M0LT-4、人子宮頸癌細胞等)具有殺傷能力，而且無溶血作用。此外，由於Cyt類殺蟲晶體蛋白的溶細胞活性，Al-yahaeet等將Cyt2蛋白與腫瘤細胞抗體融合為一個特異破壞腫瘤細胞的融合蛋白進行臨床研究，結果表明Cyt2蛋白對癌細胞具有抑制作用(Al-yahaee SAand Ellar DJ. 1996. Bioconjug Chem，7 :451-460)。該研究是繼發現 Bt以色列變種之後又一個與醫學聯繫的全新領域，可能為抗癌藥物的研究與發展開闢新的方向，引起了許多科學家的關注，並將這類具有抗癌活性的蛋白統稱為Parasporin，具體定義為「Bt及其相關細菌產生的無溶血作用但可優先殺死癌細胞的伴胞晶體蛋白」(Kitada S, et al. 2005. Victoria B C =Minireview, 1-8.) 2006 年，成立了以 Michio Ohba 為首白勺 Parasporin 分類禾口命名國際委員會(Committee of Parasporin Classification and Nomenclature)，並構建了抗癌晶體蛋白完善的分類系統。與Cry及Cyt蛋白的分類命名一樣，根據胺基酸序列的同源性，把現已發現的ParaSp0rin(PQ蛋白分劃為4種不同類型 Parasporin 1-4 (http //parasporin. fitc. pref. fukuoka. jp/intro. html)。通過對巨前已有的4類PS進化分析，結果表明它們存在很少的親緣關係，而這四種PS蛋白在抗癌毒性譜和活性水平上有顯著差別。兩種分子量較低的蛋白PS2和PS4具有相對較寬的殺細胞譜，每個都能誘導6個人類癌細胞系死亡，而具有典型三域結構的PS3蛋白具有最窄的活性譜， 僅對兩個癌細胞系HL-60和H印G2存在中度細胞毒性。與Cry和Cyt蛋白的活化相似，Bt 菌株合成的抗癌晶體蛋白也屬於無活性的原毒素，需要在鹼性溶液中經過蛋白酶水解之後才能產生有活性的抗癌蛋白，並且不同的蛋白酶處理對不同菌株蛋白的活化效果也有很大差異。上述四種PS蛋白未經蛋白酶處理時，不具有殺死癌細胞的活性，或由於內源酶的水解活化而具有極低的抗癌活性。目前的抗癌藥物最大的缺陷是不能特異的作用於癌細胞，在殺死癌細胞的同時也會殺死正常體細胞。而活化的Bt抗癌晶體蛋白能區別癌細胞與正常細胞，特異地或優先殺死癌細胞。同時，不同菌株的水解產物對不同的癌細胞的殺傷力也有很大區別。如 PS2蛋白能優先殺死來自於肝臟和結腸癌組織的癌細胞，而不影響正常細胞(Akio Ito, et al. 2004. J Biol Chem, 279 (20) :21282-21286.)。它對人肝癌細胞有很強的殺細胞活性， 但對人正常肝細胞和人子宮頸癌細胞細胞無毒性作用。抗癌蛋白引發的細胞和線粒體腫脹與Cry殺蟲蛋白在體內和體外對鱗翅目和雙翅目昆蟲細胞引發的症狀相似，而Cyt蛋白導致的細胞病變沒有經歷細胞腫脹階段而直接裂解(Cooksey K. E. 1971. London =Academic Press,247-274.)。從非殺蟲Bt菌株中發現具有識別並特異殺死癌細胞能力的伴胞晶體蛋白意義重大。有必要大規模發掘我國抗癌Bt蛋白新資源，篩選出高效、新型的Bt菌株，以及發現新的抗癌蛋白基因對於推動我國抗癌研究工作的進展以及研發新型的更有效、更安全的抗癌藥物都具有重要意義。
發明內容
本發明的第一個目的在於提供一種新的Bt蛋白Cry62Aal。本發明的第二個目的在於提供編碼所述蛋白的基因。本發明的第三個目的在於提供上述蛋白及基因的應用。本發明提供的菌株為蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt) ST7，該菌株已於2010年6月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJ* 址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)，保藏號為CGMCCNo. 3922。通過對ST7的毒力測試表明，ST7對鱗翅目、鞘翅目等害蟲等均不具有毒力。通過PCR擴增根據抗癌Cry類蛋白基因保守序列設計1對特異引物，擴增其基因組DNA，進一步設計其全長基因引物，克隆得到cry62Aal基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示，全長為2046bp，分析表明，GC含量為39. 69%，編碼681個胺基酸組成的蛋白。經測定， 其胺基酸序列如SEQ ID N02所示。被國際Bt殺蟲晶體蛋白基因命名委員會正式命名為 cry62Aal。本發明進一步分析了 Cry62Aal蛋白的胺基酸組成(表1)。在softberry網站採用kicterial sigma7. Opromoter程序對全序列進行預測表明，在基因編碼區上遊含有 RNA聚合酶活化位點的序列。Cry62Aal蛋白的胺基酸組成如表1。該蛋白的活性中心位於 (2)區段。表1 Cry62Aal蛋白的胺基酸組成
權利要求
1.一種Bt蛋白Cry62Aal，其胺基酸序列是1)SEQID No. 2所示的胺基酸序列；或2)SEQ ID No. 2所示的胺基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個胺基酸殘基形成的具有同等功能的胺基酸序列。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體。
5.由權利要求4所述表達載體轉化的宿主細胞。
6.如權利要求5所述的宿主細胞，其為植物或微生物宿主細胞。
7.含有權利要求1所述蛋白或權利要求2所述基因的抗癌藥物。
8.如權利要求7所述的抗癌藥物，其為抗乳腺癌藥物。
9.權利要求1所述的蛋白或其編碼基因或權利要求4所述表達載體在製備抗癌藥物中的應用。
10.權利要求1所述的蛋白或其編碼基因或權利要求4所述表達載體在製備轉基因植物或轉基因微生物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種新的Bt蛋白Cry62Aa1及其編碼基因，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的胺基酸序列，或SEQ ID No.2所示的胺基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個胺基酸且具有同等活性的胺基酸序列。本發明提供的Bt蛋白Cry62Aa1具有殺滅癌細胞的作用，可用於製備抗癌藥物，具有重要的經濟價值和應用前景。
文檔編號A01H5/00GK102408472SQ201110387749
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月29日 優先權日2011年11月29日
發明者劉懷年, 朱軍, 李雙成, 李平, 梁紅霞, 王世全, 王玲霞, 鄧其明, 鄭愛萍 申請人:四川農業大學